一株用于固體發(fā)酵的釀酒酵母及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一株用于固體發(fā)酵的釀酒酵母及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 酵母培養(yǎng)物是指酵母菌在特定的培養(yǎng)基上經(jīng)過(guò)充分的發(fā)酵后形成的微生態(tài)產(chǎn)品， 它主要由酵母細(xì)胞外代謝產(chǎn)物、經(jīng)過(guò)發(fā)酵后變異的培養(yǎng)基和少量的酵母細(xì)胞所構(gòu)成。代謝 產(chǎn)物是對(duì)細(xì)胞外各類代謝物的總稱，包括肽、有機(jī)酸、寡糖、氨基酸、增味物質(zhì)和芳香物質(zhì) 等，還包括其他對(duì)促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)有益的"未知生長(zhǎng)因子"等物質(zhì)。酵母培養(yǎng)物的功能可概括 為：通過(guò)向寄宿在動(dòng)物胃腸道內(nèi)的微生物提供額外的營(yíng)養(yǎng)底物來(lái)刺激它們代謝活性和維護(hù) 內(nèi)生態(tài)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定。以往的科學(xué)研究和生產(chǎn)應(yīng)用實(shí)踐證明，酵母培養(yǎng)物中所含有的細(xì) 胞外代謝產(chǎn)物可明顯提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能、優(yōu)化飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、改善動(dòng)物的健康狀態(tài)。酵 母培養(yǎng)物作為飼料添加劑可以改善動(dòng)物的腸道菌群，抑制致病菌的繁殖，提高動(dòng)物的免疫 力，增強(qiáng)對(duì)疾病的抵抗能力，同時(shí)可以改善動(dòng)物的血液生化指標(biāo)，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。因此，酵母 培養(yǎng)物對(duì)于改善動(dòng)物生產(chǎn)性能和降低養(yǎng)殖成本有著十分積極的意義。
[0003] 但目前的酵母培養(yǎng)物產(chǎn)品存在質(zhì)量參差不齊，使用效果也不穩(wěn)定等問(wèn)題，亟需開(kāi) 發(fā)質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的品牌性產(chǎn)品。通過(guò)加強(qiáng)對(duì)酵母培養(yǎng)物作用機(jī)理的深入研究，充分利用豐富的 酵母菌資源，開(kāi)發(fā)得到生物量高、代謝產(chǎn)物豐富的新菌株，并進(jìn)一步通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵工藝，包 括液體和固體發(fā)酵工藝，研究發(fā)酵培養(yǎng)基的成分，高目的產(chǎn)物的表達(dá)，對(duì)于研發(fā)新型酵母培 養(yǎng)物產(chǎn)品具有十分重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一株用于固體發(fā)酵的釀酒 酵母及其應(yīng)用。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：
[0006] -株用于固體發(fā)酵的釀酒酵母，該菌株命名為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)BLNJ03,已于2015年04月08日保藏于中國(guó)武漢市武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng) 物保藏中心（CCTCC)，其保藏編號(hào)為：CCTCC Ν0:Μ 2015209。
[0007] 本發(fā)明的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)BLNJ03的菌學(xué)特征如下：所述 釀酒酵母細(xì)胞呈圓形或橢圓形，大小為（3. 5 μ m~4. 5 μ m) X (7. 0 μ m~13. 0 μ m)，以多邊 出芽方式進(jìn)行無(wú)性繁殖，形成假菌絲；菌落呈乳白色，表面光滑濕潤(rùn)，有光澤或無(wú)光澤，邊緣 整齊或菌絲狀；化能異養(yǎng)型，能發(fā)酵葡萄糖、果糖和甘露糖，不發(fā)酵半乳糖、麥芽糖、乳糖、蜜 二糖；能同化尿素、銨鹽和硝酸鹽，不分解蛋白質(zhì)和脂肪；兼性厭氧，有氧條件下，進(jìn)行有氧 呼吸；無(wú)氧條件下，進(jìn)行酒精發(fā)酵；最適生長(zhǎng)溫度30°C，最適生長(zhǎng)pH為7. 0。
[0008] 本發(fā)明還提供了該釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)BLNJ03的固體發(fā)酵培 養(yǎng)方法，步驟為：將釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)BLNJ03的液體種子按4% -6% (體積分?jǐn)?shù)）的接種量接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度為28-30°C，有氧發(fā)酵時(shí)間為 36-60h，厭氧發(fā)酵時(shí)間為72-96h。本發(fā)明對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化改進(jìn)，采用兩步兩態(tài)法一一 液體深層發(fā)酵與固體發(fā)酵結(jié)合；有氧發(fā)酵與厭氧發(fā)酵相繼進(jìn)行，使其固體培養(yǎng)物中代謝產(chǎn) 物含量更加豐富。
[0009] 所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基是由基質(zhì)和水按lg: (0.5-0. 7)mL組成；其中，基質(zhì)的組成 為：按質(zhì)量百分比計(jì)，麩皮90%、玉米面3%、豆柏7%。本發(fā)明對(duì)固體發(fā)酵培養(yǎng)基中基質(zhì)和 水的比例（即料水比）進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，過(guò)高和過(guò)低的料水比均不利于酵母菌的生 長(zhǎng)，本發(fā)明將料水比控制在1:0. 5 -1:0. 7范圍內(nèi)，在該范圍內(nèi)培養(yǎng)得到的培養(yǎng)物中活菌數(shù) 較高。
[0010] 所述釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)BLNJ03的液體種子的制備方法，具體 步驟如下：
[0011] (1)向三角瓶中裝入1/4-1/5體積的酵母菌液體培養(yǎng)基，滅菌，冷卻后用接種環(huán) 接種兩環(huán)固體斜面釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)BLNJ03, 30°C搖床200rpm培養(yǎng) 20h，得到一級(jí)種子釀酒酵母菌液；
[0012] (2)向種子罐中加入2/5-3/5體積的酵母菌液體培養(yǎng)基，實(shí)消溫度為121°C，時(shí)間 為30min ;待培養(yǎng)基溫度降為30°C時(shí)，按1. 5% (體積分?jǐn)?shù)）接種一級(jí)種子釀酒酵母菌液， 培養(yǎng)溫度28-30°C，罐壓0. 05MPa，攪拌轉(zhuǎn)速70-90rpm，培養(yǎng)14-20h ;
[0013] 步驟（1)和步驟（2)中，所述酵母菌液體培養(yǎng)基的組成為：葡萄糖2%、蛋白胨 1 %、酵母膏〇. 5%、磷酸氫二鉀0. 2%、泡敵0. 05%，所述百分含量均為質(zhì)量百分含量，純凈 水配制，pH值7.0。
[0014] 步驟⑴中，滅菌的條件為：121°C滅菌30min。
[0015] 本發(fā)明還進(jìn)一步提供了釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)BLNJ03的發(fā)酵培 養(yǎng)物在水產(chǎn)動(dòng)物和/或反芻動(dòng)物養(yǎng)殖中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明還提供了一種飼料添加劑，以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) BLNJ03的發(fā)酵培養(yǎng)物為有效成分。
[0017] 具體的，該飼料添加劑是在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) BLNJ03的發(fā)酵 培養(yǎng)物中添加4%。（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的高活性產(chǎn)朊假絲干酵母混合而成，復(fù)配后混合物中酵母菌 活菌數(shù)不低于5X10scfU/g。
[0018] 本發(fā)明的有益效果：
[0019] 本發(fā)明篩選出了一株用于固體發(fā)酵的釀酒酵母BLNJ03,該菌株具有高生物量、傳 代穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)；在固體發(fā)酵中，其氨基酸、有機(jī)酸等代謝產(chǎn)物產(chǎn)量較其他酵母菌固體發(fā)酵物 高。將釀酒酵母BLNJ03固體發(fā)酵培養(yǎng)物應(yīng)用于草魚，可顯著提高生長(zhǎng)指標(biāo)、消化指標(biāo)及免 疫指標(biāo)；應(yīng)用于奶?？稍黾赢a(chǎn)奶量；應(yīng)用于肉牛、肉羊可顯著提高其生產(chǎn)性能。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖 I :BLNJ03 釀酒酵母 chromosome XII sequence 電泳圖；
[0021] 圖2 :釀酒酵母BLNJ03在發(fā)酵罐中培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線；
[0022] 圖3 :培養(yǎng)基初始pH對(duì)固體發(fā)酵活菌數(shù)的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，應(yīng)該說(shuō)明的是，下述說(shuō)明僅是為了解釋本 發(fā)明，并不對(duì)其內(nèi)容進(jìn)行限定。
[0024] 實(shí)施例 1 :釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)BLNJ03 的分離篩選
[0025] 1材料與方法
[0026] I. 1 材料
[0027] I. I. 1采樣地點(diǎn)及樣品類型
[0028] 分別從平度大澤山向陽(yáng)山坡的兩處葡萄架下采集了土壤樣品。
[0029] I. 1. 2主要儀器設(shè)備
[0031] 1.1. 3 培養(yǎng)基
[0032] I. I. 3. 1分尚培養(yǎng)基
[0033] 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）：蔗糖20g，馬鈴薯200g，鏈霉素20mg，瓊 脂粉 15g，水 lOOOmL，ρΗ7· 0,121°C 滅菌 20min。
[0034] I. I. 3· 2純化培養(yǎng)基
[0035] 酵母浸出粉胨葡萄糖固體培養(yǎng)基（YPD培養(yǎng)基）：葡萄糖4g，蛋白胨4g，酵母膏2g， 瓊脂粉 15g，蒸餾水 100mL，ρΗ4· 5,115°C滅菌 20min。
[0036] I. I. 3· 3液體發(fā)酵培養(yǎng)基
[0037] 葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母膏2g、磷酸二氫鉀lg，水1000mL，pH值7. 0,121°C滅 菌 20min〇
[0038] 1. 2試驗(yàn)方法
[0039] I. 2. 1酵母菌的分離及純化
[0040] 采用富集培養(yǎng)法進(jìn)行酵母菌的分離。將樣品在超凈工作臺(tái)中打開(kāi)，用滅菌的藥匙 獲取樣品IOg左右，加入到一個(gè)盛有40mL無(wú)菌水的帶玻璃珠的三角瓶中，30°C振搖30min， 將樣品充分打散、混勻。然后吸取ImL的液體加入到含鏈霉素的PDA液體培養(yǎng)基中，30°C搖 床培養(yǎng)1天，吸取ImL的培養(yǎng)液接種到一新的含鏈霉素的PDA液體培養(yǎng)基中，30°C搖床培養(yǎng) 1-2天。用接種針蘸取培養(yǎng)液在含鏈霉素的固體PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行4區(qū)劃線。30°C培養(yǎng)箱 中倒置培養(yǎng)2-3天，挑取形態(tài)不同的酵母菌菌落在YH)培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線純化，將純化好的 的菌株接入斜面?zhèn)溆谩?br>[0041] 1. 2. 2酵母菌生物量的測(cè)定
[0042] 將分離到的酵母菌分別接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C搖床培養(yǎng)20h，取發(fā)酵液 3500g離心10min，收集菌體，蒸餾水洗滌3次，收集菌體，冷凍干燥后稱重即得（g/100mL)。
[0043] L 2. 3菌株篩選
[0044] 挑選出15株菌落生長(zhǎng)迅速、革蘭氏染色鏡檢符合酵母菌特征的單菌株，經(jīng)測(cè)定生 物量試驗(yàn)后，篩選出3株生物量較高者，在PDA斜面培養(yǎng)基傳5代后（觀察其穩(wěn)定性），并與 初始菌株分別在三角瓶中發(fā)酵，以生物量為指標(biāo)進(jìn)行復(fù)篩，篩選出1株生物量高且穩(wěn)定的 菌株。
[0045] 1. 2. 4菌株鑒定
[0046] 鑒定方法：菌種鑒定采用chromosome XII sequence的PCR鑒定法， 具體方法如下：酵母菌chromosome XII sequence基因片段擴(kuò)增的引物序列 為：CXSl :5' -CACAGAAATCTCTCACCG-3'（如序列表中 SEQ ID NO. 1 所示），CXS2 : 5' -TTATGATATGCTTAAGTTC-3'（如序列表中SEQ ID NO. 2所示），序列由上海生物工程技術(shù) 服務(wù)有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系為：dNTP Mixture 4yL，5XPrime STAR Buffer 10yL， 上下游引物各 0.6 μ L，基因組模板 0.8 μ L，Prime STAR HS DNA Polymerase 0.6 μ L，用無(wú) 菌去離子水補(bǔ)充至 50yL。PCR 循環(huán)參數(shù)為：95°C 5min ;94°C lmin，52°C 15s，72°C 2min，30 個(gè)循環(huán)；72°C10min。將BLNJ03菌株的chromosome XII sequence基因目的片段切膠回收 (TAKARA膠回收試劑盒），送TAKARA測(cè)序，測(cè)序結(jié)果登