本發(fā)明涉及一種提高釀酒酵母中異戊二烯合成能力的方法，屬于生物工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

異戊二烯是合成橡膠的重要單體，其年消耗量超過(guò)100萬(wàn)噸。自然界有許多植物能釋放異戊二烯。異戊二烯以氣體形式釋放到大氣中，不易收集，從而難以用于工業(yè)生產(chǎn)。目前異戊二烯的主要來(lái)源是C5餾分。由于石油資源不可再生和石油化工帶來(lái)的環(huán)境污染問(wèn)題日趨嚴(yán)重，以微生物作為細(xì)胞工廠合成異戊二烯已經(jīng)變成一個(gè)重要的研究課題。大多數(shù)微生物都具有2-甲基赤蘚醇磷酸(MEP)或甲羥戊酸(MVA)途徑，可以合成異戊二烯的前體物質(zhì)二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)。將植物來(lái)源的異戊二烯合成基因IspS轉(zhuǎn)入這些微生物中，就可以使其具備合成異戊二烯的能力。目前對(duì)生物合成異戊二烯主的研究要集中在對(duì)上游MEP和MVA途徑的調(diào)控，而對(duì)于下游異戊二烯合成途徑的研究鮮有報(bào)道。異戊二烯合成酶作為催化異戊二烯合成的酶，其在微生物體內(nèi)的表達(dá)量和催化活性都比較低。下游異戊二烯合成途徑強(qiáng)度太弱已經(jīng)成為限制異戊二烯合成能力提高的瓶頸問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明主要目的是增強(qiáng)釀酒酵母合成異戊二烯的能力。

一種提高釀酒酵母合成異戊二烯能力的方法，通過(guò)酶切連接將來(lái)源于銀白楊的IspS基因序列SEQ ID NO:1克隆到質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化到釀酒酵母體內(nèi)，以實(shí)現(xiàn)在釀酒酵母中合成異戊二烯；并通過(guò)GAL4過(guò)表達(dá)增強(qiáng)IspS轉(zhuǎn)錄水平，以實(shí)現(xiàn)提高釀酒酵母合成異戊二烯能力。

進(jìn)一步，所述IspS由SEQ ID NO.1中的基因編碼，并且所述IspS氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO.2的氨基酸序列。

進(jìn)一步，所述質(zhì)粒為p416xwp01質(zhì)粒，在釀酒酵母中以附著型低拷貝質(zhì)粒存在，篩選標(biāo)記為URA3。

進(jìn)一步，通過(guò)DNA同源重組，將含有GAL4表達(dá)盒的線性化質(zhì)粒整合到釀酒酵母基因組上GAL1/7/10區(qū)域，敲除GAL1/7/10基因，同時(shí)增強(qiáng)GAL4的表達(dá)，以實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)IspS轉(zhuǎn)錄水平。

進(jìn)一步，所述含有GAL4表達(dá)盒的線性化質(zhì)粒為含有KanMX篩選標(biāo)記、GAL1/7/10同源臂序列、多克隆位點(diǎn)和GAL4表達(dá)盒。

進(jìn)一步，所述GAL4表達(dá)盒序列如SEQ ID NO.17所示。

進(jìn)一步，所述IspS基因序列為下列突變基因序列中的一個(gè)：

a.序列表中SEQ ID NO.3的核苷酸序列；

b.序列表中SEQ ID NO.5的核苷酸序列；

c.序列表中SEQ ID NO.7的核苷酸序列；

d.序列表中SEQ ID NO.9的核苷酸序列；

e.序列表中SEQ ID NO.11的核苷酸序列；

f.序列表中SEQ ID NO.13的核苷酸序列；

g.序列表中SEQ ID NO.15的核苷酸序列。

IspS由上述突變基因編碼，并且，所述IspS氨基酸序列是下列氨基酸序列之一：

(1)序列表中SEQ ID NO.4的氨基酸序列；

(2)序列表中SEQ ID NO.6的氨基酸序列；

(3)序列表中SEQ ID NO.8的氨基酸序列；

(4)序列表中SEQ ID NO.10的氨基酸序列；

(5)序列表中SEQ ID NO.12的氨基酸序列；

(6)序列表中SEQ ID NO.14的氨基酸序列；

(7)序列表中SEQ ID NO.16的氨基酸序列。

其中，序列表中SEQ ID NO.4的氨基酸序列編碼的異戊二烯合成酶命名為IspSM1，相對(duì)于野生型其第340位苯丙氨酸突變?yōu)榱涟彼?；序列表中SEQ ID NO.6的氨基酸序列編碼的異戊二烯合成酶命名為IspSM2，相對(duì)于野生型其第478位異亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸；序列表中SEQ ID NO.8的氨基酸序列編碼的異戊二烯合成酶命名為IspSM3(IspSMA)，相對(duì)于野生型其第570位丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸；序列表中SEQ ID NO.10的氨基酸序列編碼的異戊二烯合成酶命名為IspSM4，相對(duì)于野生型其第340位苯丙氨酸突變?yōu)榱涟彼?，?70位丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸；序列表中SEQ ID NO.12的氨基酸序列編碼的異戊二烯合成酶命名為IspSM5，相對(duì)于野生型其第478位異亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸，第570位丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸；序列表中SEQID NO.14的氨基酸序列編碼的異戊二烯合成酶命名為IspSM6，相對(duì)于野生型其第340位苯丙氨酸突變?yōu)榱涟彼幔?78位異亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸，第570位丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸；序列表中SEQ ID NO.16的氨基酸序列編碼的異戊二烯合成酶命名為IspSMB，相對(duì)于野生型其第340位苯丙氨酸突變?yōu)榱涟彼?，?78位異亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案，利用GAL4表達(dá)盒敲除釀酒酵母基因組中的GAL1/7/10，增強(qiáng)IspS表達(dá)水平。然后利用定向進(jìn)化的方法提高IspS催化活性。

其中上述增強(qiáng)釀酒酵母合成異戊二烯能力的技術(shù)方案中，所述GAL4表達(dá)盒序列如SEQ IDNO.17所示。

上述增強(qiáng)釀酒酵母合成異戊二烯能力的技術(shù)方案中，GAL4表達(dá)盒在基因組上的整合，其特征在于：將GAL4表達(dá)盒以酶切連接的方式克隆到整合型質(zhì)粒pLGL-△GAL1/7/10上，構(gòu)建質(zhì)粒pLGL-△GAL1/7/10-GAL4；將pLGL-△GAL1/7/10-GAL4線性化，通過(guò)電轉(zhuǎn)化整合到釀酒酵母基因組上，涂布G418平板，篩選陽(yáng)性克隆菌株。

上述增強(qiáng)釀酒酵母合成異戊二烯能力的技術(shù)方案中，對(duì)釀酒酵母使用的宿主菌過(guò)度積累中間代謝產(chǎn)物DMAPP進(jìn)行定向進(jìn)化。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明以釀酒酵母為宿主，通過(guò)將銀白楊的IspS基因轉(zhuǎn)化至釀酒酵母中，然后過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子GAL4，增強(qiáng)IspS的轉(zhuǎn)錄水平；并建立以DMAPP細(xì)胞毒性為基礎(chǔ)的高通量篩選方法對(duì)異戊二烯合成酶進(jìn)行定向進(jìn)化，獲得高活性的異戊二烯合成酶突變體。結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控和異戊二烯合成酶定向進(jìn)化，強(qiáng)化下游異戊二烯合成途徑，提高了釀酒酵母的異戊二烯合成能力。

本發(fā)明利用同源重組技術(shù)，將GAL4表達(dá)框整合到酵母基因組中GAL1/7/10區(qū)段，增強(qiáng)IspS轉(zhuǎn)錄水平。此外，利用定向進(jìn)化提高IspS催化活性。二者結(jié)合起來(lái)，增強(qiáng)了異戊二烯合成途徑的強(qiáng)度，提高了釀酒酵母的異戊二烯合成能力。

本發(fā)明所構(gòu)建的GAL4過(guò)表達(dá)菌株，在發(fā)酵過(guò)程中IspS轉(zhuǎn)錄水平是出發(fā)菌株的3-7倍。

本發(fā)明通過(guò)篩選獲得的突變體IspSMA和IspSMB，催化活性相比野生型有明顯的提高。

本發(fā)明通過(guò)單點(diǎn)組合獲得的突變體IspSM1、IspSM2、IspSM3、IspSM4IspSM5和IspSM6，IspSM4是最優(yōu)突變體，催化活性比其他突變體及野生型高。

附圖說(shuō)明

圖1為pLGL-△GAL1/7/10-GAL4質(zhì)粒圖譜。

圖2為p416xwp01質(zhì)粒圖譜。

圖3為結(jié)合GAL4過(guò)表達(dá)和定向進(jìn)化對(duì)異戊二烯產(chǎn)量的影響。C代表出發(fā)菌株，作為對(duì)照組；E1代表GAL4過(guò)表達(dá)菌株；E2代表在E1基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)入最優(yōu)突變體IspSM4。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明所用質(zhì)粒pLGL-△GAL1/7/10-GAL4圖譜如圖1所示。

本發(fā)明所用質(zhì)粒p416xwp01圖譜如圖2所示。

本發(fā)明培養(yǎng)基如下：

(1)YPD培養(yǎng)基(1％酵母粉，2％蛋白胨，2％葡糖糖)，固體培養(yǎng)基加入2％瓊脂粉，115℃滅菌，用于釀酒酵母活化和預(yù)培養(yǎng)。

(2)YPD(G418)培養(yǎng)基(1％酵母粉，2％蛋白胨，2％葡糖糖，200μg/mL G418)，固體培養(yǎng)基加入2％瓊脂粉，115℃滅菌，用于篩選KanMX標(biāo)記。

(3)LB培養(yǎng)基(1％氯化鈉，1％胰蛋白胨，0.5％酵母粉)，固體培養(yǎng)基加入2％瓊脂粉，121℃滅菌，用于大腸桿菌活化和預(yù)培養(yǎng)。

(4)LB(Amp/Kan)培養(yǎng)基(1％氯化鈉，1％胰蛋白胨，0.5％酵母粉,100μg/mL氨芐青霉素或50μg/mL卡那霉素)，固體培養(yǎng)基加入2％瓊脂粉，121℃滅菌，用于含有質(zhì)粒的大腸桿菌培養(yǎng)。

實(shí)施例1：異戊二烯合成途徑在釀酒酵母中的構(gòu)建

用密碼子優(yōu)化軟件將來(lái)源于銀白楊的異戊二烯合成酶基因進(jìn)行優(yōu)化，并人工合成優(yōu)化后的序列。用引物IspS-F(26)和IspS-R(27)將優(yōu)化后的IspS克隆到p416xwp01質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)入釀酒酵母中，以實(shí)現(xiàn)異戊二烯的合成。

實(shí)施例2：一種構(gòu)建GAL4過(guò)表達(dá)菌株的方法。

用于構(gòu)建GAL4過(guò)表達(dá)菌株的質(zhì)粒PLGL-△GAL1/7/10-PGAL4-GAL4，其步驟如下：

以質(zhì)粒PUG6為模板，用引物loxp-F1(30)和loxp-R1(31)擴(kuò)增獲得loxp-KanMX-loxp片段。以質(zhì)粒pESC-URA質(zhì)粒為模板，用引物loxp-F2(32)和loxp-R2(33)擴(kuò)增獲得ori片段，用引物TADH1-F2(34)和TCYC1-R2(35)擴(kuò)增獲得T_ADH1-MCS1-P_GAL10-P_GAL1-MCS2-T_CYC1區(qū)段。將三個(gè)片段融合構(gòu)建質(zhì)粒PMRI-28。

以釀酒酵母BY4741基因組為模板，用引物△GAL1/7/10-UP-F1(22)和△GAL1/7/10-UP-R1(23)擴(kuò)增獲得GAL1/7/10區(qū)段的上游534bp，用引物△GAL1/7/10-DN-F1(24)和△GAL1/7/10-DN-R1(25)擴(kuò)增獲得下游671bp。兩個(gè)片段有同源序列，利用重疊延伸PCR將兩個(gè)片段融合獲得用于敲除GAL1/7/10區(qū)段的同源臂△GAL1/7/10(1151bp)。

將△GAL1/7/10片段和克隆到質(zhì)粒PMRI-28上，構(gòu)建質(zhì)粒PLGL-△GAL1/7/10。

以釀酒酵母BY4741基因組為模板，用引物PGAL4-F1(18)和PGAL4-R1(19)擴(kuò)增獲得GAL4的啟動(dòng)子片段，用引物GAL4-F1(20)和GAL4-R1(21)擴(kuò)增獲得GAL4基因片段。

將P_GAL4-GAL4片段克隆到質(zhì)粒PLGL-△GAL1/7/10的P_GAL10-P_GAL1-MCS2區(qū)段，構(gòu)建質(zhì)粒PLGL-△GAL1/7/10-PGAL4-GAL4。

GAL4過(guò)表達(dá)菌株的構(gòu)建，具體步驟如下：

(1)用EcoRI單酶切質(zhì)粒PLGL-△GAL1/7/10-PGAL4-GAL4，使其線性化。

(2)制備釀酒酵母感受態(tài)。

(3)電擊轉(zhuǎn)化，將線性化質(zhì)粒整合到釀酒酵母基因組上，涂布G418平板。

(4)從平板上挑選出單菌落，在搖瓶中過(guò)夜培養(yǎng)，提取基因組，PCR驗(yàn)證GAL4表達(dá)盒是否整合到基因組上的GAL1/7/10區(qū)段。

(5)根據(jù)PCR驗(yàn)證結(jié)果，篩選出陽(yáng)性克隆。

實(shí)施例3：IspS轉(zhuǎn)錄水平測(cè)定。

將出發(fā)菌株(C)和GAL4過(guò)表達(dá)菌株(E1)培養(yǎng)在在液體SS-URA培養(yǎng)基中。在搖瓶發(fā)酵過(guò)程中第18小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)分別取2mL發(fā)酵液。

用RNA提取試劑盒(Takara)提取各個(gè)樣品的總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)去除基因組DNA并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。實(shí)驗(yàn)操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

以ACT1基因?yàn)閮?nèi)參，對(duì)IspS做實(shí)時(shí)熒光定量PCR，獲得擴(kuò)增曲線，記錄CT值。用2^-△△CT計(jì)算IspS的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。

表1 IspS的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平

實(shí)施例4：異戊二烯產(chǎn)量的檢測(cè)。

將出發(fā)菌株和GAL4過(guò)表達(dá)菌株培養(yǎng)在密封的裝有液體SS-URA培養(yǎng)基的搖瓶中，培養(yǎng)24h。

采用頂空進(jìn)樣法，用GC-FID檢測(cè)異戊二烯產(chǎn)量。柱溫箱、進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度分別為80℃、180℃和180℃。結(jié)果如圖3所示

實(shí)施例5：IspS陽(yáng)性突變體的獲得。

以p416xwp01-IspS為模板，GAL1-F(28)和qtHMG1-R1(29)為前后引物，對(duì)IspS做易錯(cuò)PCR反應(yīng)，構(gòu)建IspS突變體文庫(kù)。體系中Mn²⁺濃度為0.1mM，用于增加突變率。

酶切p416xwp01-IspS,獲得切除野生型IspS片段的質(zhì)粒。

制備釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞，將IspS突變體文庫(kù)和酶切質(zhì)粒轉(zhuǎn)入釀酒酵母體內(nèi)。涂布SS平板。

從平板上挑取10個(gè)長(zhǎng)得較快的單菌落。

將野生型菌株和10個(gè)突變菌株在液體SS培養(yǎng)基培養(yǎng)，24h后測(cè)量OD₆₀₀,篩選出4個(gè)生長(zhǎng)比野生型菌株快的突變菌株。

提取這4個(gè)突變菌株的質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌擴(kuò)增。

將質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)入原宿主菌，搖瓶培養(yǎng)，檢測(cè)異戊二烯產(chǎn)量。

分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個(gè)突變菌株比野生型菌株產(chǎn)量高，分別命名為IspSMA和IspSMB。

對(duì)兩個(gè)突變質(zhì)粒IspSMA和IspSMB進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。構(gòu)建單點(diǎn)和組合突變體，突變體如表2所示。

檢測(cè)突變體異戊二烯產(chǎn)量，比較相對(duì)酶活(相對(duì)酶活＝突變菌株產(chǎn)量/野生菌株產(chǎn)量1)，篩選出最優(yōu)突變體IspSM4，其相對(duì)酶活為2.5。

表2 單點(diǎn)組合突變體

實(shí)施例6：結(jié)合GAL4過(guò)表達(dá)和定向進(jìn)化提高異戊二烯產(chǎn)量

將質(zhì)粒p416xwp01-IspSM4轉(zhuǎn)入到GAL4過(guò)表達(dá)菌株中,構(gòu)建重組菌(E2)。

兩個(gè)重組菌在密封的搖瓶中培養(yǎng)24h，檢測(cè)異戊二烯產(chǎn)量。結(jié)果如圖3所示。