一種檢測釀酒酵母染色體大片段重復(fù)的位置的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測釀酒酵母染色體大片段重復(fù)的位置的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，又稱面包酵母或出芽酵母。釀酒酵母是與人類關(guān)系最廣泛的一種酵母，不僅因?yàn)閭鹘y(tǒng)上它用于制作面包和饅頭等食品及釀酒，在現(xiàn)代分子和細(xì)胞生物學(xué)中用作真核模式生物，其作用相當(dāng)于原核的模式生物大腸桿菌。酵母細(xì)胞自身具備高效的同源重組特性(Ma，H.，et al.Gene( 1987)，58，201-216)，因而被廣泛的應(yīng)用于質(zhì)粒構(gòu)建、基因敲除乃至基因組構(gòu)建的研究當(dāng)中(Gibson，D.G.，etal.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A(2008).105，20404-20409)。人工合成釀酒酵母基因組項(xiàng)目(Sc2.0)的研究人員通過將大量長約3kb的DNA片段轉(zhuǎn)化進(jìn)入到釀酒酵母細(xì)胞中，利用釀酒酵母自身的同源重組特性將野生型染色體逐步替換為一條全新的人工設(shè)計(jì)的染色體(Annaluru,N.,et al.Science(2014)344,55-58)0
[0003]釀酒酵母高效的同源重組特性為DNA片段的整合提供了便利，同時(shí)也有可能導(dǎo)致外源DNA片段的重復(fù)整合形成多拷貝DNA，甚至錯(cuò)誤整合至非目標(biāo)位點(diǎn)，從而使得酵母菌株的生長狀況變差，影響相關(guān)研究。基因敲除為解決外源DNA片段錯(cuò)誤整合的傳統(tǒng)方法，即首先將營養(yǎng)標(biāo)記表達(dá)盒整合至待目標(biāo)位點(diǎn)來敲除錯(cuò)誤整合的DNA片段，然后再利用正確的DNA片段敲除營養(yǎng)標(biāo)記表達(dá)盒進(jìn)而修復(fù)DNA多拷貝問題。但是，該方法需要精確確認(rèn)待修復(fù)位點(diǎn)所在位置，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析工作非常繁瑣;而在實(shí)際研究工作當(dāng)中，往往并沒有必要確認(rèn)錯(cuò)誤整合發(fā)生的精確位置。因此，快速檢測高拷貝DNA發(fā)生位置并進(jìn)行修復(fù)將為酵母基因操作提供便利條件。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的問題提供一種快速檢測釀酒酵母染色體大片段重復(fù)的位置的方法。
[0005]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0006]—種快速檢測釀酒酵母染色體大片段重復(fù)的位置的方法，包括:
[0007]步驟A、對(duì)待測釀酒酵母菌株進(jìn)行基因組測序；
[0008]步驟B、在待測釀酒酵母菌株相反交配型的野生型酵母菌株對(duì)應(yīng)染色體著絲粒處添加半乳糖啟動(dòng)子；
[0009]步驟C、利用核內(nèi)復(fù)制回交(endoreduplicat1n backcross)獲得全新的單倍體酵母菌株；
[0010]步驟D、對(duì)步驟C獲得全新的單倍體酵母菌株進(jìn)行基因組測序，與待測釀酒酵母菌株的基因組測序結(jié)果比較，確定大片段重復(fù)的位置。
[0011]其中，本發(fā)明所述檢測方法中步驟C具體包括以下步驟:
[0012]I)將待測釀酒酵母菌株與所述添加半乳糖啟動(dòng)子的野生型酵母菌株進(jìn)行融合，獲得二倍體酵母菌株；
[0013]2)半乳糖誘導(dǎo)二倍體菌株中GALl啟動(dòng)子表達(dá)，獲得只攜帶源染色體的二倍體釀酒酵母菌株；
[0014]3)對(duì)步驟2)獲得釀酒酵母菌株進(jìn)行生孢實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行孢子拆分。
[0015]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述快速檢測釀酒酵母染色體大片段重復(fù)的位置的方法，分析比較結(jié)果，全新的單倍體酵母菌株的基因組測序結(jié)果中存在大片段重復(fù)DNA，大片段重復(fù)存在于待測釀酒酵母菌株染色體上。
[0016]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述快速檢測釀酒酵母染色體大片段重復(fù)的位置的方法，分析比較結(jié)果，全新的單倍體酵母菌株的基因組測序結(jié)果中不存在大片段重復(fù)DNA，大片段重復(fù)存在于待測釀酒酵母菌株染色體以外的染色體上。
[0017]由上述技術(shù)方案可知，本發(fā)明提供了一種快速檢測釀酒酵母染色體大片段重復(fù)的位置的方法，利用基因組測序和核內(nèi)復(fù)制回交相結(jié)合，快速確認(rèn)重復(fù)大片段基因組DNA所在染色體位置。本發(fā)明所述核內(nèi)復(fù)制回交方法可高效、快速檢測釀酒酵母染色體大片段重復(fù)基因組DNA所在染色體位置，并進(jìn)行修復(fù)，刪除大片段重復(fù)基因組DNA，無需精確確認(rèn)大片段重復(fù)位點(diǎn)所在位置，無需對(duì)待檢測釀酒酵母進(jìn)行繁瑣的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析工作，操作簡單，實(shí)驗(yàn)周期短。
【附圖說明】
[0018]為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0019]圖1示實(shí)施例1釀酒酵母中存在重復(fù)大片段基因組DNA的染色體基因組測序結(jié)果圖；
[0020]圖2示本發(fā)明所述快速檢測釀酒酵母染色體大片段重復(fù)的位置的方法的示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0022]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0023]—種快速檢測釀酒酵母染色體大片段重復(fù)的位置的方法，包括:
[0024]步驟A、對(duì)待測釀酒酵母菌株進(jìn)行基因組測序；
[0025]步驟B、在待測釀酒酵母菌株相反交配型的野生型酵母菌株對(duì)應(yīng)染色體著絲粒處添加半乳糖啟動(dòng)子；
[0026]步驟C、利用核內(nèi)復(fù)制回交(endoreduplicat1n backcross)獲得全新的單倍體酵母菌株；
[0027]步驟D、對(duì)步驟C獲得全新的單倍體酵母菌株進(jìn)行基因組測序，與待測釀酒酵母菌株的基因組測序結(jié)果比較，確定大片段重復(fù)的位置。
[0028]本發(fā)明所述快速檢測釀酒酵母染色體大片段重復(fù)的位置的方法利用基因組測序和核內(nèi)復(fù)制回交相結(jié)合，快速確認(rèn)重復(fù)大片段基因組DNA所在染色體位置，具體如圖2所示。
[0029]本發(fā)明所述檢測方法步驟A利用基因組測序揭示待測釀酒酵母菌株中存在重復(fù)大片段基因組DNA，而重復(fù)的DNA片段可能存在于測序的染色體上，也有可能存在于其他染色體上;命名待測釀酒酵母菌株染色體為“源染色體”，待測釀酒酵母菌株為“源菌株”。
[0030]本發(fā)明所述檢測方法步驟B根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道方法(Reid, R.J., et al.Genetics(2008)，180，1799-1808)在相反交配型的野生型酵母菌株對(duì)應(yīng)染色體著絲粒處添加半乳糖啟動(dòng)子(pGALl)。命名上述野生型酵母菌株染色體為“野生型染色體”，該菌株為“野生型菌株”。其中，所述添加半乳糖啟動(dòng)子的方法具體為利用酵母同源重組的特性在待測釀酒酵母菌株相反交配型的野生型酵母菌株對(duì)應(yīng)染色體的著絲粒前添加半乳糖啟動(dòng)子(GALl)和K1.URA3營養(yǎng)篩選標(biāo)記。
[0031 ] 本發(fā)明所述檢測方法步驟C利用核內(nèi)復(fù)制回交(endoredup I i cat 1n backcross)獲得全新的單倍體酵母菌株。
[0032]其中，本發(fā)明所述檢測方法中步驟C具體包括以下步驟:
[0033]I)將待測釀酒酵母菌株與所述添加半乳糖啟動(dòng)子的野生型酵母菌株進(jìn)行融合，獲得二倍體酵母菌株；
[0034]2)半乳糖誘導(dǎo)二倍體菌株中GALl啟動(dòng)子表達(dá)，獲得只攜帶源染色體的二倍體釀酒酵母菌株；
[0035]3)對(duì)步驟2)獲得釀酒酵母菌株進(jìn)行生孢實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行孢子拆分。
[0036]進(jìn)一步的，步驟I)所述融合的具體為挑取待測單倍體釀酒酵母菌株和添加半乳糖啟動(dòng)子的具有相反交配型的單倍體釀酒酵母菌株單菌落于無菌水中進(jìn)行混合，然后滴于YH)培養(yǎng)平板上過夜培養(yǎng)，SC-Lys-Met營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)平板篩選二倍體菌株，挑取單菌落驗(yàn)證。
[0037]所述待測單倍體釀酒酵母菌株和具有相反交配型的單倍體釀酒酵母菌株會(huì)自發(fā)融合為二倍體酵母菌株(MATa/α)。利用SC-Lys-Met營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)平板篩選二倍體菌株，挑取單菌落并利用文獻(xiàn)(Huxley，C.,et al.Trends Genet(1990) ,6,236.)報(bào)道方法進(jìn)行二次驗(yàn)證，確認(rèn)為二倍體釀酒酵母菌株。
[0038]其中，所述YPD培養(yǎng)平板的配方為酵母提取物1g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂粉20g/L。