專利名稱：突變酵母的乙醇產(chǎn)生的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用一種特殊類型的酵母細(xì)胞生產(chǎn)乙醇。
一般是通過(guò)發(fā)酵法生產(chǎn)乙醇，其中酵母將碳水化合物轉(zhuǎn)化為乙醇。
有幾種因素限制這些發(fā)酵中乙醇的產(chǎn)量。例如，氧對(duì)乙醇的產(chǎn)量可具有不利的影響(稱作巴斯德效應(yīng))，在有氧條件下乙醇傾向于由于進(jìn)一步代謝而丟失(主要由于線粒體呼吸)。影響乙醇產(chǎn)生的另一種因素是發(fā)酵中碳水化合物的量。在有些酵母株中過(guò)量碳水化合物的供給有助于抑制呼吸(稱為Crabtree效應(yīng))，從而使乙醇甚至在氧存在下產(chǎn)生。因此，通過(guò)提高碳水化合物的濃度可使Crabtree效應(yīng)敏感酵母的乙醇產(chǎn)量達(dá)到最大，此外或另外，通過(guò)限制氧的可用性也可使任何酵母的乙醇產(chǎn)量達(dá)到最大。然而，盡管采取這些措施，乙醇的實(shí)際產(chǎn)量仍低于所希望的。制約乙醇產(chǎn)量的另一個(gè)因素與酵母通常不耐受高乙醇濃度的事實(shí)有關(guān)。當(dāng)乙醇濃度提高時(shí)，首先延遲酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)速度，然后當(dāng)濃度再提高時(shí)細(xì)胞生存力進(jìn)一步受到不利影響。
已經(jīng)進(jìn)行了多種嘗試來(lái)提供產(chǎn)生高乙醇產(chǎn)量的酵母細(xì)胞。一種這樣的嘗試包括開發(fā)了因?yàn)楹蟹枪δ苄跃€粒體基因而為呼吸缺陷型的酵母突變體(也被稱為線粒體或胞質(zhì)小菌落突變體)。這種突變體無(wú)巴斯德效應(yīng)，因此對(duì)發(fā)酵中氧供應(yīng)的嚴(yán)格控制不是必要的，如同使用呼吸充分型(grande)酵母株的發(fā)酵情況一樣。
然而，只要向p+培養(yǎng)物中的氧氣供應(yīng)保持為足以進(jìn)行固醇和不飽和脂肪酸生物合成的水平，則當(dāng)原料氣中的氧氣受限制時(shí)，發(fā)現(xiàn)在親代grande株(p+)中乙醇產(chǎn)生的比速率高于小菌落突變體。
因此本發(fā)明的一個(gè)目的在于消除或減少上述缺點(diǎn)。
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種生產(chǎn)乙醇的方法，包括培養(yǎng)呼吸缺陷型酵母細(xì)胞，以及從該酵母細(xì)胞中分離乙醇，該細(xì)胞具有至少一種呼吸所需的核基因或其產(chǎn)物，其在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中無(wú)功能和/或被抑制。
“呼吸缺陷型酵母細(xì)胞”是指一種酵母細(xì)胞，它無(wú)線粒體介導(dǎo)的呼吸(即100％呼吸缺陷)，或者相對(duì)于其中至少一種呼吸所需的核基因或其產(chǎn)物是功能性的和/或未被抑制的相應(yīng)酵母細(xì)胞，其呼吸降低至少60％、優(yōu)選地至少75％、更優(yōu)選地85％、以至更優(yōu)選地95％。例如，可以突變親代grande株(p+)的核基因或抑制一種基因產(chǎn)物，使得相對(duì)于未操作的親代grande株而言，線粒體呼吸降低至少60％。
發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，其中促進(jìn)線粒體呼吸或?yàn)榫€粒體呼吸所需的核基因是非功能性的酵母細(xì)胞(或當(dāng)其基因產(chǎn)物被抑制時(shí))，對(duì)于巴斯德效應(yīng)不敏感或敏感性低，并且具有相當(dāng)于未操作的細(xì)胞且好于線粒體小菌落突變體的乙醇耐受性。因此，當(dāng)用于乙醇生產(chǎn)時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的方法使用的酵母細(xì)胞具有極大好處，因?yàn)椴槐匾獙⒓?xì)胞保持于嚴(yán)格厭氧條件中，并且，每批培養(yǎng)的酵母細(xì)胞的乙醇產(chǎn)量能達(dá)到比以前所知呼吸缺陷型酵母株可能達(dá)到的更高的濃度。這些細(xì)胞尤其可用于乙醇的商業(yè)生產(chǎn)，因?yàn)檠鯕夤?yīng)不需要嚴(yán)格控制。此外，這些細(xì)胞不能在雙峰生長(zhǎng)期生長(zhǎng)，所以不能將發(fā)酵產(chǎn)物(即乙醇)作為其次級(jí)底物代謝。這使得達(dá)到更高的最終滴度，并且也排除了快速阻止酵母培養(yǎng)(避免損失產(chǎn)量)的必要性。
我們不希望被任何假說(shuō)所束縛，但我們相信，根據(jù)本發(fā)明的方法使用的呼吸缺陷型酵母細(xì)胞(在此也稱為核小菌落酵母突變體)能夠產(chǎn)生大量的乙醇，因?yàn)樗鼈儗?duì)乙醇比線粒體小菌落突變體更不敏感。我們已經(jīng)證實(shí)，與grande親代酵母細(xì)胞相比，外源加入的乙醇延遲了線粒體小菌落突變體的生長(zhǎng)，而在乙醇存在下核小菌落突變酵母顯示比線粒體小菌落突變體更好的生長(zhǎng)速度。此外，我們證實(shí)，核小菌落突變體以比線粒體小菌落突變體或衍生出核小菌落突變體的grande親本(p+)更快的速度產(chǎn)生乙醇。在線粒體小菌落突變體中，我們相信完整線粒體基因組的缺乏導(dǎo)致幾種有害的細(xì)胞表面特征(如降低的糖攝取、改變的細(xì)胞絮凝及凝集和對(duì)質(zhì)膜蛋白質(zhì)的影響)，這導(dǎo)致其乙醇耐受性的降低。根據(jù)溶解氧的存在或不存在，線粒體以兩種不同的、明確的生理狀態(tài)存在(前線粒體形式和功能性線粒體形式)。前線粒體形式在厭氧生長(zhǎng)期間產(chǎn)生，并在可獲得微量溶解氧時(shí)分化為完全功能性的線粒體。最近幾年，由于Crabtree效應(yīng)，即在有氧條件下酵母呼吸能力被葡萄糖抑制，基本上忽略了釀造酵母中線粒體的功能。因?yàn)獒勗旖湍甘荂rabtree陽(yáng)性的，所以認(rèn)為氧氣的作用只是營(yíng)養(yǎng)性的，并且通常否定釀造酵母中任何真正呼吸功能的存在。前線粒體向線粒體中的轉(zhuǎn)化是一種代謝昂貴的工作，而在釀造酵母中總是觀察到該現(xiàn)象，但從未解釋其意義。因此我們提出，完全發(fā)育的功能性線粒體以一種迄今仍未知的方式對(duì)于保持酵母的乙醇耐受性從而對(duì)于發(fā)酵性能是必需的。這解釋了線粒體小菌落酵母作為生產(chǎn)乙醇的工具的無(wú)效性，并解釋了為何核小菌落酵母如此驚人地有效。
呼吸缺陷型酵母細(xì)胞可由任何酵母株衍生而來(lái)。然而優(yōu)選地，細(xì)胞來(lái)源于釀造酵母如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)?？捎玫钠渌湍赴ㄆ咸阎湍?S.uvarum)(卡爾酵母(S.carlsbergensis))和Saccharomyces sensu stricto組的其它成員。
可衍生出呼吸缺陷型酵母株的一種優(yōu)選酵母株是FY23(Winston等人(1995)酵母(Yeast)1153-55頁(yè))及相關(guān)菌株。根據(jù)本發(fā)明方法使用的最優(yōu)選的FY23衍生物是以下及實(shí)施例1中詳述的菌株，即FY23Δcox5a和FY23Δpet191。我們發(fā)現(xiàn)FY23Δpet191是100％呼吸缺陷的(或至少基本上如此)，是根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法使用的特別有用的酵母株。
最優(yōu)選地，可衍生出呼吸缺陷型酵母株的酵母株是那些本領(lǐng)域已知作為乙醇的良好生產(chǎn)者的菌株。例如，可操作工業(yè)高酒精產(chǎn)量酵母如M-株(DC(Y)L，Menstrie，蘇格蘭)、紅星(Red Star，F(xiàn)leischmann’s美國(guó))、K1酵母(Lallamand，U.K.LTD，F(xiàn)ife，蘇格蘭，由DanstarFerment AG生產(chǎn))、酒類酵母U.C.L.M.S325(Bio Springer，Maisins-Alfort，法國(guó))和酒類酵母U.C.L.M.S377(Bio Springer，Maisins-Alfort，法國(guó))，以開發(fā)根據(jù)本發(fā)明的方法使用的呼吸缺陷型酵母?？裳苌龊粑毕菪徒湍钢甑囊环N最優(yōu)選的工業(yè)酵母株是K1。根據(jù)本發(fā)明方法使用的最優(yōu)選的K1衍生物是以下詳述的菌株，尤其是實(shí)施例2所述的K1Δpet191ab。
至于可以基因操作以用于本發(fā)明方法的其它合適酵母的實(shí)例，參見(jiàn)Tavares F.C.A.的“燃料酒精生產(chǎn)的酵母培育”，Echeverriagary(59-79頁(yè))，于《工業(yè)酵母研究第1卷》(Research on industrial yeastvol.1)(1987)，Stewart G.G.，Russel I.，Klein R.D.，Hiebsch R.R.編，CRC出版社。
根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生酵母細(xì)胞的一種優(yōu)選方法是修飾一種呼吸所需的核基因，使得該基因無(wú)功能(即功能性刪除該核基因)。該修飾可引起一種破壞基因產(chǎn)物表達(dá)或功能的突變。這些突變可以是對(duì)于作為該基因的5’或3’調(diào)節(jié)序列的核酸序列，或者可以優(yōu)選地是一種引入該基因編碼序列中的突變。例如以核苷酸置換、添加或優(yōu)選地核苷酸缺失的形式通過(guò)基因突變可以進(jìn)行該基因的功能性刪除。
可通過(guò)下列方法使該基因無(wú)功能(i)移動(dòng)該基因編碼序列的讀框；(ii)在該基因編碼的蛋白質(zhì)中添加、置換或刪除氨基酸；或(iii)部分或完整地刪除編碼該基因的DNA和/或與該基因有關(guān)的上游及下游調(diào)節(jié)序列。
向呼吸所需的染色體基因中引入突變的一種優(yōu)選方法是使用分子生物學(xué)技術(shù)，尤其定向于待突變的染色體基因?？梢杂靡环NDNA分子誘導(dǎo)突變。一種引入突變的最優(yōu)選的方法是使用一種特殊制備的DNA分子，使得在靶基因與DNA分子之間發(fā)生同源重組。當(dāng)情況如此時(shí)，DNA分子理想地含有與靶染色體位置互補(bǔ)的堿基序列，以使該DNA分子能與該靶雜交(并且隨后與之重組)。使用PCR介導(dǎo)的基因置換技術(shù)如Wach等人(1994)酵母101793-7876發(fā)展的方法產(chǎn)生呼吸缺陷型核小菌落突變體是特別優(yōu)選的。
引起基因破壞產(chǎn)生核小菌落酵母的備擇方法在《酶學(xué)方法》(Methods in Enzymology)(1983)第101卷，重組DNA部分C(WuR.，Grossman L.，Moldave K.編)202-228頁(yè)中有描述。
可被修飾的核基因是那些當(dāng)變得無(wú)功能時(shí)產(chǎn)生核小菌落表型的基因。這些基因通常與直接或間接參與氧化磷酸化的蛋白質(zhì)的功能或表達(dá)有關(guān)。
可成為無(wú)功能的和/或被抑制的優(yōu)選基因與細(xì)胞色素c氧化酶(氧化磷酸化中的最終電子載體復(fù)合體)的功能有關(guān)。
向PET191基因中引入突變產(chǎn)生一種優(yōu)選的酵母細(xì)胞，其中細(xì)胞色素c氧化酶的功能減弱。發(fā)現(xiàn)PET191位于酵母染色體X上，編碼一種14.1kDa的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)為組成活性細(xì)胞色素c氧化酶全酶的多肽亞基的裝配所必需。PET191基因和相鄰DNA的序列資料可在http//genome.www.stanford.edu8000/acedb/SacchDB？find+DNA+％22cseqX_6+％28SGD％29％22處獲得。
PET191基因的一種優(yōu)選突變產(chǎn)生一種核小菌落突變體，該突變體可導(dǎo)致全酶裝配的失敗并誘導(dǎo)高達(dá)100％的呼吸缺陷。一種含有PET191突變的最優(yōu)選的細(xì)胞是在此被稱為FY23Δpet191的核小菌落突變體，其中從酵母基因組染色體X上切除確定為SEQ ID NO.1的DNA序列，并用確定為SEQ ID NO.2的DNA序列替換。
另一種含有PET191突變的最優(yōu)選的細(xì)胞是在此被稱為K1Δpet191ab的核小菌落突變體。K1WT是二倍體，而K1Δpet191 ab具有PET191基因的一種拷貝(PET191 a)，其中確定為SEQ ID NO.1的DNA序列已被切除，并用確定為SEQ ID NO.17的DNA序列替換。K1Δpet191 ab中PET191的第二種拷貝(PET191b)已切除確定為SEQ ID NO.4的DNA序列，并用確定為SEQ ID NO.17的DNA序列替換。
含有PET191基因突變的細(xì)胞代表本發(fā)明的一個(gè)重要特征，根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了一種特征在于PET191基因被功能性刪除的酵母細(xì)胞。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明第二方面的酵母細(xì)胞由呼吸充分的野生型酵母株衍生而來(lái)，其中通過(guò)DNA分子與編碼PET191基因的DNA之間的同源重組功能性刪除PET191基因。
根據(jù)本發(fā)明第二方面的優(yōu)選酵母細(xì)胞是在此表征的FY23Δpet191和K1Δpet191 ab。
向位于染色體XIV上的COX5a基因中引入突變產(chǎn)生可供本發(fā)明的方法使用的另一種優(yōu)選酵母細(xì)胞，其中細(xì)胞色素c氧化酶的功能減弱。COX5a編碼由9個(gè)多肽亞基組成的細(xì)胞色素c氧化酶的亞基V。COX5a基因和相鄰DNA的序列資料可在http∥genome.www.stanford.edu8000/acedb/SacchDB？find+DNA+％22YSCCOX5AA+％28GB％29％22處獲得。
一種含有COX5a基因突變的最優(yōu)選的細(xì)胞是在此被稱為FY23Δcox5a的核小菌落突變體，其中從酵母基因組(染色體XIV)上切除確定為SEQ ID NO.5的DNA序列，并用確定為SEQ ID NO.2的DNA序列替換。優(yōu)選地，F(xiàn)Y23Δcox5a突變體是85-90％呼吸缺陷的。
當(dāng)在酵母中成為無(wú)功能的和/或被抑制時(shí)，產(chǎn)生核小菌落酵母的其它核基因可以根據(jù)本發(fā)明的方法使用，可能選自被稱為PET基因的酵母基因(例如PET192或PET100)。這些PET基因的實(shí)例可于酵母基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中公開獲得，在Tzagaloff A.和Dieckman C.L.(1990)“釀酒酵母的PET基因”微生物綜述(Microbiol Rev.)(54)9211-225中也有描述?？山?jīng)操作形成核小菌落酵母細(xì)胞的核基因的其它實(shí)例包括其它COX基因(例如COX1-17中的任一個(gè))、ATP基因、CEM1、CYB2和QCR基因(例如QCR1-10中的任一個(gè))。
根據(jù)本發(fā)明方法使用的優(yōu)選核小菌落酵母具有這樣的核基因，當(dāng)它成為無(wú)功能的和/或被抑制時(shí)，產(chǎn)生至少95％呼吸缺陷、最優(yōu)選地100％呼吸缺陷的表型。在這方面，我們發(fā)現(xiàn)PET基因尤其是PET191的功能性缺失可產(chǎn)生至少95％呼吸缺陷的酵母。
當(dāng)用一種DNA分子誘導(dǎo)親代野生型菌株的突變而形成根據(jù)本發(fā)明第二方面的酵母細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明方法使用的酵母細(xì)胞時(shí)，用來(lái)轉(zhuǎn)化親代酵母株的該DNA分子可包含于合適的載體中形成重組載體。該載體可以是例如質(zhì)粒、粘粒或噬菌體。當(dāng)復(fù)制該DNA分子時(shí)，這類重組載體是非常有用的，一種優(yōu)選的載體是pFA6-kanMX4(見(jiàn)SEQ ID NO.6)。另一種優(yōu)選載體是pUG6(在Guldener等人，核酸研究(Nucl.AcidsRes.)(24)132519-2524，1996中公開)，除了kanMX4基因一側(cè)為L(zhǎng)oxP序列外，它含有與pFA6-kanMX4相應(yīng)的DNA(在下面討論，含有SEQ ID NO.17的34bp LoxP序列)。
重組載體和/或DNA分子常常包含一種或多種選擇性標(biāo)記，而使得用載體和/或核小菌落突變體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的篩選成為可能。這種選擇性標(biāo)記的一個(gè)實(shí)例是賦予對(duì)遺傳霉素(G418)抗性的基因如KanMX4的內(nèi)含物。例如，一種產(chǎn)生可在本發(fā)明方法中使用的細(xì)胞的優(yōu)選方法是，用一種DNA盒轉(zhuǎn)化呼吸充分型親代酵母株，該DNA盒含有編碼一種標(biāo)記基因的DNA，其側(cè)翼為能與編碼參與呼吸的蛋白質(zhì)的靶核基因同源重組的DNA。
當(dāng)使用選擇性標(biāo)記時(shí)，完成基因操作后人基因組中切除標(biāo)記常常是希望的(K1Δpet191ab的情況中也是如此一參見(jiàn)實(shí)施例2)。當(dāng)情況如此時(shí)，可用多種已知的重組酶系統(tǒng)切除標(biāo)記。這些系統(tǒng)利用重組酶切割特異核苷酸重復(fù)序列的能力。核苷酸重復(fù)序列可包含于用來(lái)轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞的DNA盒中，使得它們位于編碼該標(biāo)記的DNA的側(cè)翼。酵母轉(zhuǎn)化形成一種核小菌落后，可利用重組酶切除核苷酸重復(fù)序列?？捎脕?lái)切除標(biāo)記基因的系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)例是在對(duì)于K1Δpet191ab的實(shí)施例2中詳述的LoxP/Cre系統(tǒng)。
用于kanMX組件體內(nèi)切除的loxP/Cre重組酶系統(tǒng)的一種替代是使用大范圍核酸酶I-SceI。I-SceI的限制位點(diǎn)由酵母線粒體的一種可移動(dòng)I組內(nèi)含子所編碼，長(zhǎng)為18bp，缺失盒可設(shè)計(jì)為含有任一側(cè)側(cè)翼為I-SceI位點(diǎn)(代替loxP位點(diǎn))的kanMX組件。另外，這些I-SceI位點(diǎn)的外部側(cè)翼區(qū)應(yīng)彼此同源，使得一旦通過(guò)內(nèi)切核酸酶I-SceI的表達(dá)切除kanMX組件，線性化的基因組DNA即再連接，修復(fù)該DNA。該技術(shù)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是缺失株中未留下任何異源DNA。
因此，根據(jù)本發(fā)明第二方面或根據(jù)本發(fā)明方法使用的最優(yōu)選的核小菌落，是通過(guò)用DNA盒轉(zhuǎn)化呼吸充分型酵母而形成的，該DNA盒含有編碼一種標(biāo)記基因的DNA，其側(cè)翼為可與一種編碼參與呼吸的蛋白質(zhì)的靶核基因同源重組的DNA，并且進(jìn)一步含有上段所述的核苷酸重復(fù)序列。
也能提供一種呼吸缺陷型酵母細(xì)胞，對(duì)于該細(xì)胞，在未向該酵母基因組中引入突變時(shí)，至少一種呼吸所需的染色體基因產(chǎn)物是無(wú)功能的和/或被抑制的。使用可阻止酵母中發(fā)生的呼吸的特異性抑制劑可做到這一點(diǎn)。這類抑制劑的實(shí)例包括阻止基因轉(zhuǎn)錄、阻止表達(dá)或破壞翻譯后修飾的試劑。此外，該抑制劑也可以是一種增強(qiáng)基因產(chǎn)物降解的試劑(例如一種特異性蛋白水解酶)。同樣地，該抑制劑可以是一種阻止基因產(chǎn)物與線粒體成分結(jié)合的試劑，如一種中和抗體(例如抗PET191抗體)。該抑制劑也可以是一種反義寡核苷酸或能抑制由核基因介導(dǎo)的呼吸成分的任何合成化學(xué)藥品。
本發(fā)明的方法是非常有益的，因?yàn)橐掖忌a(chǎn)的速度及有些情況下生產(chǎn)乙醇的產(chǎn)量高于使用常規(guī)酵母株的已知方法。這些方法可用于為了任何目的(包括肉湯)的乙醇生產(chǎn)，盡管這些方法尤其適合于用于化學(xué)工業(yè)的乙醇商業(yè)生產(chǎn)，最特別地用于燃料乙醇的生產(chǎn)。
生長(zhǎng)培養(yǎng)基可以是對(duì)酵母常規(guī)使用的任何生長(zhǎng)培養(yǎng)基(例如YPD生長(zhǎng)培養(yǎng)基)，并且應(yīng)當(dāng)理想地含有一種碳水化合物來(lái)源，其可以是一種可發(fā)酵的糖。例如，該碳水化合物可以是甜菜或甘蔗的一種衍生物(如蔗汁或糖蜜)。用于向乙醇代謝轉(zhuǎn)化的優(yōu)選碳水化合物是蔗糖或葡萄糖。
生長(zhǎng)培養(yǎng)基應(yīng)含有理想量的必需養(yǎng)分(即碳水化合物、氮源等)，以使最適生長(zhǎng)和乙醇生產(chǎn)成為可能。該培養(yǎng)基的確切組成取決于多種因素(例如所用的特定酵母)。僅根據(jù)實(shí)施例，合適的生長(zhǎng)培養(yǎng)基可含有尿素 2.34g/L磷酸二氫鉀 1.49g/L硫酸鎂 0.9g/L肌醇 0.1g/L煙酸 0.07g/L鹽酸吡哆醇 0.005g/L鹽酸硫胺素 0.008g/L泛酸鈣 0.005g/L生物素 0.0002g/L
硫酸鋅 0.006g/L硫酸亞鐵二銨 0.004g/L硫酸銅 0.0001g/L+碳水化合物底物碳水化合物底物的濃度影響產(chǎn)生的乙醇量，通常，碳水化合物濃度越高，乙醇產(chǎn)量越高。然而，如果碳水化合物的濃度太高，則由于滲透作用而能誘導(dǎo)酵母的質(zhì)壁分離。質(zhì)壁分離的程度又取決于發(fā)酵條件和所用的酵母類型。因此向發(fā)酵中加入的碳水化合物的準(zhǔn)確量必須適合于特定酵母培養(yǎng)的實(shí)際需要。根據(jù)實(shí)施例，向上述培養(yǎng)基中加入351g/L蔗糖在適宜的發(fā)酵條件下能達(dá)到最佳v/v乙醇產(chǎn)量。
在培養(yǎng)基中也可補(bǔ)充其它多種養(yǎng)分，如復(fù)合氮源(例如肽、氨基酸)、其它維生素或脂肪酸和其它脂類。
培養(yǎng)基也應(yīng)被緩沖，使得在發(fā)酵過(guò)程中pH保持于pH4-7、最優(yōu)選地pH4.5-5。雖然某些嗜溫及嗜熱酵母株分別具有在28-35℃和40-50℃左右生長(zhǎng)的最適溫度范圍，但對(duì)于最佳乙醇生產(chǎn)，發(fā)酵期間培養(yǎng)基的溫度可保持為環(huán)境溫度(20℃左右)。
最適酵母生長(zhǎng)和乙醇生產(chǎn)至少部分地取決于使用前如何貯存酵母及隨后如何引入生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。酵母可以以干燥形式供應(yīng)，然后在接種于發(fā)酵培養(yǎng)基之前再水合。酵母最好在35-40℃水中再水合(10ml/g酵母)15分鐘。假定為每克約1×1010的菌落形成單位，則向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入的干酵母的最適量為2.13g/L左右的活性酵母。
在含有生長(zhǎng)培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)酵母。它可以是酵母細(xì)胞能在其中生長(zhǎng)的任何容器。用于工業(yè)規(guī)模乙醇生產(chǎn)(例如燃料乙醇生產(chǎn))的發(fā)酵罐通常進(jìn)一步包括一種或多種1.用于攪拌酵母培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)子或類似裝置。
2.一種空氣(或氧氣)供給。
3.一種添加養(yǎng)分的進(jìn)口。
4.一種提取廢產(chǎn)物和/或產(chǎn)生的乙醇的裝置。
5.一種恒溫器和調(diào)節(jié)溫度的裝置。
優(yōu)選的發(fā)酵罐是本領(lǐng)域已知用于酵母培養(yǎng)的發(fā)酵罐。所用的發(fā)酵罐類型取決于酵母細(xì)胞是在作為實(shí)驗(yàn)性工廠的實(shí)驗(yàn)室中用肉湯培養(yǎng)，還是在對(duì)于乙醇工業(yè)生產(chǎn)的完全放大中生長(zhǎng)。例如，當(dāng)酵母細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)?zāi)康臅r(shí)，一種優(yōu)選的發(fā)酵罐是3L Bioengineering LKF2000基本發(fā)酵罐(Bioengineering AC，CH8636-Wald，瑞士)。
這些發(fā)酵罐可以具有使溫度調(diào)節(jié)、空氣供給、養(yǎng)分含量、廢料去除和產(chǎn)物提取自動(dòng)化的裝置。一種優(yōu)選的自動(dòng)化裝置是“Pi”計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)(Process Intelligence Ltd.，Warwick，英國(guó))電子控制發(fā)酵的應(yīng)用。
生產(chǎn)乙醇的方法可以包括酵母細(xì)胞通過(guò)分批培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)的生長(zhǎng)。
當(dāng)由于某些原因生產(chǎn)乙醇時(shí)(例如乙醇的工業(yè)生產(chǎn))，該方法需要從所述酵母細(xì)胞中分離乙醇的步驟。可通過(guò)任何方便的方法從酵母細(xì)胞中分離乙醇。對(duì)于乙醇(如燃料乙醇)的工業(yè)生產(chǎn)，可包括幾個(gè)步驟，包括蒸餾步驟和/或過(guò)濾步驟。如果細(xì)胞用于肉湯，則可通過(guò)沉淀、漂浮或過(guò)濾從細(xì)胞中分離乙醇。
在釀造某些酒精飲料(尤其是含有約20％或更少乙醇的飲料，如啤酒)中，使乙醇留在生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中是理想的。當(dāng)情況如此時(shí)，通常希望的是從培養(yǎng)基中分離酵母(例如通過(guò)沉淀)，而不是分離乙醇。
在本發(fā)明方法的一種具體實(shí)施方案中，以分批培養(yǎng)在3LBioengineering LKF2000基本發(fā)酵罐中的完全YPD培養(yǎng)基[1％(w/v)酵母提取物、2％(w/v)蛋白胨、5％(w/v)葡萄糖]中培養(yǎng)酵母細(xì)胞(例如K1Δpet191 ab或FY23Δpet 191)，該細(xì)胞中至少含有一種呼吸所需的核基因或其產(chǎn)物是非功能性的和/或被抑制的。45小時(shí)培養(yǎng)時(shí)間后，取出含有乙醇的培養(yǎng)基，隨后使用或然后處理來(lái)分離乙醇。用“Pi”計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)對(duì)發(fā)酵的監(jiān)控。使用安裝于中心軸上并以250WVDE電動(dòng)機(jī)驅(qū)動(dòng)的2×6葉片的Rushton葉輪(Lenze，D-4923，德國(guó))以850轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢枭L(zhǎng)培養(yǎng)液。通過(guò)加入幾滴硅基抗起泡劑(Mazu DF8005)來(lái)防止過(guò)度的泡沫形成。用轉(zhuǎn)子流量計(jì)和精確控制閥以1Lmin-1(1v/v/m)向培養(yǎng)液中充氣。發(fā)酵罐裝備有405-DPAS-50-K85/200組合式pH電極，并經(jīng)W/M 501u泵(Watson and Marlow，英國(guó))加入3MHCl和3M NaOH溶液來(lái)使所有發(fā)酵的pH保持為5.0。使用設(shè)定點(diǎn)為pH5.0(+0.005)的一種開/關(guān)控制回路，經(jīng)“Pi”系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)pH的控制。使用“Pi”系統(tǒng)的比例(P)及積分(I)控制器，在30℃(±0.005℃)下進(jìn)行所有發(fā)酵。借助DO探針(Ingold，英國(guó))連續(xù)監(jiān)控培養(yǎng)基中的溶解氧，用一種紅外氣體分析儀(ADC Instruments Ltd.，Hoddesden，英國(guó))監(jiān)控廢氣中的CO2。
應(yīng)當(dāng)理解，可利用常規(guī)生化工程技術(shù)輕易地修改本發(fā)明方法的上述實(shí)施方案，用于乙醇生產(chǎn)的放大。使用常規(guī)酵母的乙醇生產(chǎn)的放大指導(dǎo)(可容易地修改以用于核小菌落酵母)可見(jiàn)于《工業(yè)酵母研究第1卷》(1987)Stewart G.G.，Russel I.，Klein R.D.和Heibsch R.R.編，CRC出版社，或《生物化學(xué)工程與生物工程學(xué)手冊(cè)》(Biochemical Engineering& Biotechnology Handbook)(1991)Atkinson B.和Mavituna F.，自然出版社?？蓪?shí)現(xiàn)乙醇生產(chǎn)放大的已知方法的實(shí)例是利用Berkeley法、MIT法、Natick法或甘蔗底物法。
現(xiàn)在將以實(shí)施例的方式、參照下列附圖描述本發(fā)明

圖1是在實(shí)施例1中用來(lái)產(chǎn)生呼吸缺陷型酵母細(xì)胞的方法的示意圖；圖2是編碼PET191可讀框的DNA及相鄰核苷酸的示意圖，顯示實(shí)施例1中使用的有關(guān)PCR引物與該DNA在何處結(jié)合；圖3是編碼COX5a可讀框的DNA及相鄰核苷酸的示意圖，顯示實(shí)施例1中使用的有關(guān)PCR引物與該DNA在何處結(jié)合；圖4是說(shuō)明實(shí)施例1中酵母株FY23WT的發(fā)酵數(shù)據(jù)的圖；圖5是說(shuō)明實(shí)施例1中酵母株FY23Δpet191的發(fā)酵數(shù)據(jù)的圖；圖6是說(shuō)明實(shí)施例1中酵母株FY23Δcox5a的發(fā)酵數(shù)據(jù)的圖；圖7是說(shuō)明實(shí)施例1中酵母株FY23[ρ0]的發(fā)酵數(shù)據(jù)的圖；圖8是在實(shí)施例2中用來(lái)產(chǎn)生缺失盒的載體pUG6的示意圖；圖9是在實(shí)施例2中用來(lái)產(chǎn)生呼吸缺陷型酵母細(xì)胞K1Δpet191ab的方法的示意圖10是實(shí)施例2中使用的載體YEP351(a)、YEP351-cyh(b)和YEP351-cre-cyh(c)的示意圖；圖11是實(shí)施例2中呼吸缺陷型酵母細(xì)胞的(1)PET191a中整合的缺失盒和(2)PET191b中整合的缺失盒的示意圖。
實(shí)施例1兩種類型的核小菌落酵母細(xì)胞由釀酒酵母株FY23產(chǎn)生。每種細(xì)胞是一種核小菌落，具有與細(xì)胞色素c氧化酶活性的消除或降低有關(guān)的突變。然后根據(jù)本發(fā)明的方法用這些酵母細(xì)胞生產(chǎn)乙醇。這些酵母細(xì)胞具有良好的乙醇耐受性，通過(guò)呼吸鏈中的核損傷避開巴斯德效應(yīng)，并可達(dá)到高于有呼吸能力的親代酵母(FY23WT)或由FY23衍生的線粒體小菌落的發(fā)酵率。1.1方法1.1.1使用的酵母株1.1.1.1FY23WT在這些研究中用釀酒酵母FY23親代-單倍體，grande[ρ+]，MATa，ura3-52，trpΔ63，leu2Δ1(Winston等人，1995，酵母1153-55)作為有呼吸能力的親代酵母。FY23WT用作發(fā)酵研究中的對(duì)照酵母株，并用作產(chǎn)生呼吸缺陷型酵母細(xì)胞的酵母株。1.1.1.2FY23(ρ0)據(jù)在CsCl Hoechst 33258密度梯度中的平衡離心(Williamson等人，1976，細(xì)胞生物學(xué)方法(Methods in Cell Biol.)12335-351)測(cè)定線粒體小菌落突變體FY23(ρ0)缺乏所有可檢測(cè)的線粒體DNA，其在發(fā)酵研究中用來(lái)與根據(jù)本發(fā)明第一方面的酵母細(xì)胞相對(duì)比。通過(guò)在100μg/ml溴化乙錠存在下在YPD上生長(zhǎng)，由grande親本衍生出線粒體小菌落。細(xì)胞在YPD而不在YEPD復(fù)制平板上生長(zhǎng)為小菌落的指征(Slonimski等人，1968，生物化學(xué)與生物物理學(xué)研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Comm.)30232-239)。1.1.1.3FY23Δpet191FY23Δpet191是一種根據(jù)本發(fā)明第二方面并可根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法使用的酵母細(xì)胞。FY23Δpet191是FY23的一種核小菌落突變體，具有破壞的PET191基因。該突變導(dǎo)致細(xì)胞色素c氧化酶全酶裝配的失敗，從而誘導(dǎo)100％的呼吸缺陷。下面給出了關(guān)于該突變體產(chǎn)生的細(xì)節(jié)。1.1.1.4FY23Δcox5aFY23Δcox5a是一種可根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法使用的酵母細(xì)胞。FY23Δcox5a是FY23的一種核小菌落突變體，具有COX5a基因的破壞，大約85-90％呼吸缺陷。下面給出了關(guān)于該突變體產(chǎn)生的細(xì)節(jié)。1.1.2核小菌落突變體的產(chǎn)生呼吸缺陷型核小菌落突變體是利用PCR-介導(dǎo)的基因破壞技術(shù)產(chǎn)生的，該技術(shù)由Wach等人(1994)酵母101793-7876發(fā)展，如圖1的1)PCR部分所概述。
使用標(biāo)準(zhǔn)50μl PCR反應(yīng)混合液及條件。標(biāo)準(zhǔn)50μl PCR反應(yīng)混合液-0.1mM dNTP、0.2μM引物、1.5mM MgCl2、20ng模板pFA6-kanMX4(SEQ ID NO.6)、2.5U Taq聚合酶。標(biāo)準(zhǔn)PCR條件-1個(gè)循環(huán)92℃2分鐘；30個(gè)循環(huán)92℃30秒；55℃30秒；72℃90秒；隨后1個(gè)循環(huán)72℃4分鐘。1.1.2.1FY23Δpet191用PCR構(gòu)建破壞盒pet191∷kanMX4(13kb)(見(jiàn)圖1(1))，其中用PET191上游引物(SEQ ID NO.7)和PET191下游引物(SEQ IDNO.8)擴(kuò)增pFA6-MX4的特定區(qū)(見(jiàn)表1)。這些引物與pFA6-MX4多克隆位點(diǎn)具有19-22nt的同源性，并且具有分別與靶ORF PET191的起始密碼子直接下游區(qū)或終止密碼子上游區(qū)同源的35nt延伸(見(jiàn)圖2)。
破壞盒的正確擴(kuò)增后，將1-2μg乙醇沉淀的DNA用于酵母轉(zhuǎn)化(Gietz等人，1995)。一旦轉(zhuǎn)化，即在pet191∷kanMX4盒的同源區(qū)與靶基因之間發(fā)生重組事件，從而破壞ORF，并導(dǎo)致含有SEQ ID NO.1序列的DNA片段的切除，并替換為含有SEQ ID NO.2的序列、編碼KanMx4基因的DNA。在含有0.2mg/ml遺傳霉素(G418)的YEPD-瓊脂上進(jìn)行轉(zhuǎn)化子篩選。1.1.2.2FY23Δcox5a同F(xiàn)Y23Δpet191一樣，使用破壞盒cox5a∷kanMX4實(shí)現(xiàn)85％呼吸缺陷的FY23Δcox5a的產(chǎn)生，除了使用的引物為上游Cox5a(SEQ IDNO.11)和下游Cox5a(SEQ ID NO.12)(見(jiàn)表1)外，cox5a∷kanMX4與pet191∷kanMX4相同。這些引物引入了與編碼盒中KanMX4基因的DNA的Cox5a基因5’和3’具有同源性的DNA。
如1.1.2.1所述進(jìn)行轉(zhuǎn)化與重組事件，以破壞Cox5a的ORF，導(dǎo)致含有SEQ ID NO.5序列的DNA片段的切除，并替換為含有SEQ ID NO.2的序列、編碼KanMx4基因的DNA。在含有0.2mg/ml遺傳霉素(G418)的YEPD-瓊脂上進(jìn)行轉(zhuǎn)化子篩選。1.1.3分析PCR通過(guò)分析PCR(Wach等人，1994)證實(shí)了2種破壞盒的每一種向酵母基因組中的正確定向。對(duì)生長(zhǎng)于0.5mg/ml G418上的轉(zhuǎn)化子的總細(xì)胞基因組DNA進(jìn)行該試驗(yàn)。分析PCR的條件-1個(gè)循環(huán)92℃2分鐘；30個(gè)循環(huán)92℃30秒(對(duì)于PET191)或54℃30秒(對(duì)于COX5a)；72℃90秒(PET191)或72℃3分鐘(COX5a)；隨后72℃4分鐘的1個(gè)循環(huán)。對(duì)于FY23Δpet191在分析PCR反應(yīng)中使用PET191正向引物和PET191反向引物(見(jiàn)表1)，對(duì)于FY23Δcox5a的分析PCR，每一PCR反應(yīng)中使用Cox5a正向引物和Cox5a反向引物(見(jiàn)表1)。
通過(guò)在YEPG平板上檢測(cè)呼吸缺陷來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)正確ORF破壞的進(jìn)一步證實(shí)。為了分離染色體，也用鉗位均勻電場(chǎng)(CHEF)技術(shù)對(duì)推斷的核小菌落施以脈沖電場(chǎng)凝膠電泳。其后是Southern雜交，由此用32P-標(biāo)記的KanMX4盒探測(cè)膜。隨后對(duì)磷成像儀(Biorad，英國(guó))的曝光表明，cox5a∷kanMX4和pet191∷kanMX4盒已經(jīng)分別正確地整合入染色體XIV和X中。
表1.在實(shí)施例1的PCR反應(yīng)中使用的寡核苷酸引物
表1中突出的以下劃線標(biāo)出的序列是與KanMX4盒互補(bǔ)的寡核苷酸部分。1.1.4分批發(fā)酵在完全YPD培養(yǎng)基[1％(w/v)酵母提取物、2％(w/v)蛋白胨、5％(w/v)葡萄糖]中培養(yǎng)生物。根據(jù)在含有3％(w/v)甘油作為唯一碳源的YEPG培養(yǎng)上的生長(zhǎng)來(lái)測(cè)定呼吸缺陷。
在工作容積為2L的3L Bioengineering LKF2000基本發(fā)酵罐(Bioengineering AC，CH8636-Wald，瑞士)中，一式三份測(cè)定分批培養(yǎng)物中菌株特異的乙醇生產(chǎn)力。用“Pi”計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)(ProcessIntelligence Ltd.，Warwick，英國(guó))實(shí)現(xiàn)對(duì)發(fā)酵的監(jiān)控。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中以2分鐘的間隔記錄以下所述變量的數(shù)據(jù)。
以850轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢枧囵B(yǎng)液，實(shí)現(xiàn)方法是使用安裝于中心軸上并以250W VDE電動(dòng)機(jī)驅(qū)動(dòng)的2×6葉片Rushton葉輪(Lenze，D-4923，德國(guó))。通過(guò)加入幾滴硅基抗起泡劑(Mazu DF8005)來(lái)防止過(guò)度的泡沫形成。用轉(zhuǎn)子流量計(jì)和精確控制閥以1Lmin-1(1v/v/m)向培養(yǎng)液中充氣。發(fā)酵罐裝備有405-DPAS-50-K85/200組合式pH電極，并經(jīng)W/M501u泵(Watson and Marlow，英國(guó))加入3M HCl和3M NaOH溶液來(lái)使所有發(fā)酵的pH保持為5.0的值。使用設(shè)定點(diǎn)為pH5.0(±0.005)的一種開/關(guān)控制回路，經(jīng)“Pi”系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)pH的控制。使用“Pi”系統(tǒng)的比例(P)及積分(I)控制器，在30℃(±0.005℃)下進(jìn)行所有發(fā)酵。借助DO探針(Ingold，英國(guó))連續(xù)監(jiān)控培養(yǎng)基中的溶解氧，用一種紅外氣體分析儀(ADC Instruments Ltd.，Hoddesden，英國(guó))監(jiān)控廢氣中的CO2。建立發(fā)酵罐的多種控制系統(tǒng)，然后用1％的過(guò)夜稠密種子培養(yǎng)物進(jìn)行接種。使發(fā)酵進(jìn)行45小時(shí)，經(jīng)常監(jiān)控廢氣中的CO2濃度。以1小時(shí)的間隔從指數(shù)期中期直到穩(wěn)定期末期采取樣品，并用于干重分析及氣相色譜分析(GC)。
在與Klett Summerson比色計(jì)和綠色濾片(Klett Summerson，美國(guó))結(jié)合的特別改進(jìn)型100ml錐形瓶(稱為Klett瓶)中，測(cè)定分批培養(yǎng)液中的菌株特異的乙醇耐受性。培養(yǎng)物過(guò)夜生長(zhǎng)到指數(shù)期早期，然后分為18ml等份，加入2ml無(wú)菌蒸餾水或乙醇溶液，產(chǎn)生0％、2％、3％、4％、6％和10％(w/v)乙醇的終濃度。每一濃度一式三份，并每小時(shí)測(cè)定細(xì)胞密度。從瓶中采取1ml樣品，稀釋并涂板于YPD上進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。離心剩余的樣品(15000轉(zhuǎn)/分，4℃，5分鐘)，冷凍上清液，用于隨后通過(guò)GC對(duì)乙醇濃度的分析。1.1.5細(xì)胞干重測(cè)定離心取自發(fā)酵罐的20ml樣品(15000轉(zhuǎn)/分，4℃，5分鐘)，并將上清液潷析入無(wú)菌容器中進(jìn)行乙醇濃度測(cè)定。細(xì)胞沉淀用20ml無(wú)菌蒸餾水洗一次，再次收獲細(xì)胞，并在90℃下干燥，直到達(dá)到恒定的細(xì)胞干重。1.1.6乙醇濃度的測(cè)定發(fā)酵罐樣品貯存于-20℃下，并使用裝備有碳蠟柱的PYE-UNICAM204系列通過(guò)氣相色譜法測(cè)定其乙醇含量。注射器和FID被設(shè)置為200℃，而柱保持80℃?；鹧鏆馐强諝馀c氫的混合物，而載氣是以161磅/平方英寸流動(dòng)的不含氧的氮(BOC Ltd.)。對(duì)于所有樣品使用1-丙醇內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，并用計(jì)算機(jī)軟件計(jì)算乙醇濃度。將乙醇濃度對(duì)時(shí)間作圖，并在最陡點(diǎn)測(cè)定乙醇生產(chǎn)的比速率(qp)(qp＝rp/x)。1.2.結(jié)果與討論1.2.1乙醇耐受性在分批培養(yǎng)中于30℃培養(yǎng)等基因系列的所有四個(gè)成員(FY23WT、FY23Δpet191、FY23Δcox5a和FY23ρ0)，并在指數(shù)期初期引入不同濃度的乙醇。細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)行8小時(shí)，用Klett計(jì)測(cè)定光密度。
向指數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞群體中加入乙醇后，生長(zhǎng)速率立即下降。所有四種菌株都顯示這一特征，這至少部分地是由于稀釋效應(yīng)，因?yàn)檫@在只用蒸餾水(即0％(w/v)乙醇)的培養(yǎng)中也發(fā)生。以loge Klett單位對(duì)經(jīng)過(guò)時(shí)間作圖，并進(jìn)行線性回歸分析來(lái)計(jì)算培養(yǎng)的比生長(zhǎng)速率μ。通過(guò)比較每一乙醇濃度下的相對(duì)生長(zhǎng)速率，并計(jì)算為不含乙醇時(shí)生長(zhǎng)速率的百分比，來(lái)分析乙醇對(duì)該系列四種成員的生長(zhǎng)速率的影響。
乙醇抑制動(dòng)力學(xué)被認(rèn)為遵循非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，并能用Monod方程式的一種變式來(lái)模擬。從計(jì)算的比生長(zhǎng)速率值來(lái)看，通過(guò)將其插入調(diào)整的方程式[μm/μi-1＝I.1/Ki]中確定Ki的值是可能的。據(jù)顯示，簡(jiǎn)單地使用原始生物量積累數(shù)據(jù)不能產(chǎn)生直線關(guān)系。這是由于使平衡動(dòng)力學(xué)的應(yīng)用無(wú)效的不可逆作用(細(xì)胞死亡)；因此必須考慮細(xì)胞生存力。計(jì)算的μ的初值是從含有活細(xì)胞和死細(xì)胞的培養(yǎng)物的生長(zhǎng)所確定的μ表觀值。由于此原因，必須用每一實(shí)驗(yàn)期間收集的生存力數(shù)據(jù)將單純由Klett值確定的每一乙醇濃度時(shí)的μ表觀校正為μ真值。
表2.抑制常數(shù)表<
>表3.比生長(zhǎng)速率與乙醇產(chǎn)量(qp
>表4.為FY23WT百分比的比生長(zhǎng)速率與乙醇產(chǎn)量(qp)<
>1.2.2乙醇對(duì)細(xì)胞生存力的影響用考慮了分批培養(yǎng)中細(xì)胞死亡的Pirt’s方程式(1975，《微生物與細(xì)胞培養(yǎng)原理》(Principles of microbe and cell cultivation)牛津大學(xué)出版社，Blackwell Scientific，牛津，英國(guó))計(jì)算每一乙醇濃度時(shí)的真實(shí)比生長(zhǎng)速率。假定分批培養(yǎng)中的細(xì)胞死亡速率與存在的活細(xì)胞數(shù)成比例。YT=yT(0)+&mu;&CenterDot;y&gamma;(0)&mu;-k(e(&mu;-k)t-1)]]>在修改的Monod方程式中使用校正的μ值(μ真值)，并用它來(lái)重新計(jì)算Ki。對(duì)抑制劑濃度(i)作圖[μ最大(真值)/μi(真值)-1]產(chǎn)生具有梯度1/Ki的直線。為了提高圖表的精確性，作圖的抑制劑濃度是批次實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每一Klett瓶中乙醇濃度的平均值。這通過(guò)GC分析來(lái)確定。
Ki越高，菌株對(duì)生長(zhǎng)的乙醇抑制越耐受。表2顯示4種菌株的Ki值，并顯示親本FY23WT是最耐受的，線粒體小菌落是最敏感的(FY23WT耐受性的76％)。對(duì)核小菌落的分析表明，100％呼吸缺陷的核小菌落FY23Δpet191具有與FY23WT相當(dāng)?shù)囊掖寄褪苄?Ki約為野生型值的95％)，而85％呼吸缺陷的FY23Δcox5a具有野生型菌株所顯示的86％的耐受性。1.2.3乙醇生產(chǎn)在2L工作容積的攪拌式容器中進(jìn)行分批發(fā)酵，以比較等基因系列成員的乙醇生產(chǎn)力。為了能進(jìn)行乙醇生產(chǎn)力的良好比較，需要高發(fā)酵率，這可通過(guò)在葡萄糖抑制-5％(w/v)葡萄糖—的條件下進(jìn)行所有發(fā)酵來(lái)實(shí)現(xiàn)。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中用無(wú)菌空氣使培養(yǎng)基飽和。保持這一點(diǎn)，使得氧對(duì)于酵母是可得的，以用于發(fā)酵過(guò)程中的非呼吸功能，主要是固醇和不飽和脂肪酸的生物合成，以及卟啉和血紅素的生物合成、培養(yǎng)基成分的氧化和前線粒體向線粒體的分化。一旦葡萄糖底物被耗盡，對(duì)于FY23WT和FY23Δcox5a的呼吸而言分子氧也是可利用的圖4-7顯示等基因系列四種成員的發(fā)酵數(shù)據(jù)。在每種情況下，排出氣中二氧化碳的濃度產(chǎn)生一種遵循典型分批生長(zhǎng)的分布圖。已經(jīng)用大量術(shù)語(yǔ)描述了生長(zhǎng)期(圖4-6中的15-25小時(shí)，圖7中的5-25小時(shí))，其特征總是在于高水平的發(fā)酵活動(dòng)和被充分抑制的呼吸。術(shù)語(yǔ)“呼吸發(fā)酵”生長(zhǎng)是恰當(dāng)?shù)?，因?yàn)樗从臣?xì)胞的生理狀態(tài)，并強(qiáng)調(diào)優(yōu)勢(shì)發(fā)酵生長(zhǎng)，其間培養(yǎng)物以最大比生長(zhǎng)速率μ最大生長(zhǎng)。表3和表4顯示每一菌株的最大比生長(zhǎng)速率，與FY23WT的比較顯示，ORF PET191和COX5a的破壞對(duì)該參數(shù)沒(méi)有明顯影響。另一方面，ρ0的比生長(zhǎng)速率是FY23WT的64.2％，表明線粒體基因組的丟失對(duì)胞質(zhì)小菌落的生長(zhǎng)具有相當(dāng)大的影響。
在接種時(shí)將溶解氧張力(DOT)設(shè)置為100％，并且也對(duì)其監(jiān)控。與生長(zhǎng)后期相符的DOT降低表示對(duì)于非呼吸功能(所有菌株)和呼吸功能(只有FY23WT和FY23Δcox5a)的氧需求，之后恢復(fù)為100％。對(duì)于所有菌株，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入雙峰后期時(shí)培養(yǎng)的生長(zhǎng)速率降低，因?yàn)槌跏伎砂l(fā)酵底物—葡萄糖—的濃度最后降低為最小值。在圖4中，雙峰生長(zhǎng)期葡萄糖底物耗盡后發(fā)生生長(zhǎng)，其間FY23WT利用發(fā)酵產(chǎn)物乙醇作為其主要碳源和能源。利用通過(guò)氧化磷酸化將乙醇氧化為乙酸的呼吸實(shí)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)。FY23Δcox5a顯示用乙醇作為次級(jí)底物的呼吸生長(zhǎng)期的證據(jù)，但達(dá)不到與grande FY23WT相同的程度。雙峰期的二氧化碳水平達(dá)不到與grande一樣高的值，而DOT濃度不降為一樣低的值，表明突變體的呼吸水平不這樣高。這種10-15％的殘余呼吸能力被認(rèn)為直接歸因于染色體COX5b基因。
FY23Δpet191和FY23ρ0在分批生長(zhǎng)末期的CO2分布圖顯示0％(±0.05％)的濃度，DOT水平恒定為100％，表明沒(méi)有雙峰呼吸生長(zhǎng)期。如預(yù)期的，這2種菌株顯示小菌落表型，因此不能氧化作為備擇能源的乙醇。
對(duì)于所有發(fā)酵，從呼吸發(fā)酵指數(shù)期中期直到“呼吸”生長(zhǎng)期末期，每小時(shí)采取樣品，將細(xì)胞用于干重分析，上清液在-20℃冷凍用于GC分析。隨后由這些數(shù)據(jù)計(jì)算乙醇生產(chǎn)的比速率值qp。
表3和表4總結(jié)了等基因系列4種成員中每一種的qp值。用線粒體小菌落FY23ρ0獲得qp的最低值，證實(shí)了以前工作者的結(jié)果。在試驗(yàn)條件下，親代grande FY23WT顯示比FY23ρ0略高的qp，這或許是由于提高的μ最大和維持其乙醇耐受性的完整線粒體基因組的存在。部分呼吸缺陷的核小菌落FY23Δcox5a顯示比野生型高30.2％的生產(chǎn)力，而完全呼吸缺陷的小菌落FY23Δpet191比野生型高42.6％。由于不能呼吸，F(xiàn)Y23Δpet191顯示增加的由葡萄糖到乙醇的糖酵解通量。這高于有呼吸能力的野生型，后者主要通過(guò)氧化磷酸化進(jìn)行ATP的產(chǎn)生。FY23Δcox5a的相對(duì)生產(chǎn)力比FY23Δpet191約低9％，這粗略地對(duì)應(yīng)于COX5b基因提供的10-15％的殘余呼吸能力。1.2.4呼吸商呼吸商(RQ)被定義為產(chǎn)生的CO2摩爾數(shù)/消耗的O2摩爾數(shù)。
對(duì)于碳水化合物的完全氧化，即完全呼吸生長(zhǎng)，RQ為6/6＝1.0。然而，實(shí)際上，酵母為了非呼吸功能消耗氧，因此看到低于1的RQ值。在真正厭氧的發(fā)酵生長(zhǎng)中，不消耗氧，因此RQ的理論值無(wú)窮大。
為了確定等基因系列的四種菌株是呼吸性生長(zhǎng)(低RQ值)還是發(fā)酵性生長(zhǎng)(高RQ值)，計(jì)算每批發(fā)酵過(guò)程中的RQ值(見(jiàn)表5)。
兩種100％呼吸缺陷小菌落FY23Δpet191和FY23ρ0的平均RQ值是可比的，即17.0-17.5±1.0。呼吸充分型親本FY23WT的RQ值是8.0±1.0，而大約85％呼吸缺陷的FY23Δcox5a為15±1.0。根據(jù)理論預(yù)測(cè)，呼吸發(fā)酵生長(zhǎng)的FY23WT具有最低的RQ值，F(xiàn)Y23Δcox5a所顯示的部分呼吸但主要發(fā)酵性生長(zhǎng)具有較高的RQ值，兩種純粹的發(fā)酵株FY23Δpet191和FY23ρ0具有最高的RQ值。
表5.等基因系列的呼吸商(RQ)<
1.3.結(jié)論外源乙醇對(duì)四種菌株的影響的檢查表明，功能性線粒體對(duì)于維持酵母對(duì)乙醇的耐受性是必要的，胞質(zhì)小菌落突變體顯示該系列中最低的耐受性。線粒體基因組被認(rèn)為在某些細(xì)胞表面現(xiàn)象中起重要作用，因而在不確定的程度上決定一種菌株的乙醇耐受性。
比生產(chǎn)率數(shù)據(jù)顯示，兩種核小菌落所顯示的提高的生產(chǎn)力是它們?cè)诜峙L(zhǎng)“呼吸發(fā)酵”期不能呼吸及相對(duì)高的乙醇耐受性的結(jié)果。它們的呼吸缺陷表型的意思是，巴斯德效應(yīng)被成功地克服，使得能達(dá)到比呼吸充分的野生型更高的發(fā)酵率。完全功能性線粒體的擁有足以維持其乙醇耐受性，從而保持高生長(zhǎng)率。雖然胞質(zhì)小菌落避免了巴斯德效應(yīng)，但線粒體基因組的缺乏阻止達(dá)到高發(fā)酵率。
因此，呼吸缺陷型核小菌落可用于乙醇的商業(yè)生產(chǎn)(尤其在氧供應(yīng)不能被嚴(yán)格控制的情況下)。100％呼吸缺陷的核小菌落不能在雙峰生長(zhǎng)期生長(zhǎng)，因此不能將發(fā)酵產(chǎn)物(乙醇)作為其次級(jí)底物代謝。這使得能達(dá)到更高的乙醇終滴度。
總之，菌株FY23Δpet191顯示(a)完全功能性線粒體基因組引起的乙醇耐受性的保持；(b)由于對(duì)巴斯德效應(yīng)的不敏感性，乙醇比生產(chǎn)率提高43％(這表明可達(dá)到更高的最終乙醇上限)；(c)與其呼吸充分型親本相當(dāng)?shù)淖畲蟊壬L(zhǎng)速率(μ最大)；和(d)其呼吸缺陷型表型，它在葡萄糖底物耗盡后使之不能利用乙醇或不可發(fā)酵的糖作為底物，因此導(dǎo)致達(dá)到更高的乙醇滴度。實(shí)施例2實(shí)施例1中進(jìn)行的工作突出了實(shí)驗(yàn)室核小菌落FY23Δpet191所顯示的許多有利特性。
因此將核小菌落突變的有利特點(diǎn)引入一種可商業(yè)應(yīng)用的釀造株K1(一種呼吸充分型高度乙醇耐受的高產(chǎn)乙醇生產(chǎn)株)，而產(chǎn)生一種根據(jù)本發(fā)明的最優(yōu)選的酵母株。2.1方法2.1.1使用的酵母株2.1.1.1K1WT在本實(shí)施例中使用K1WT，一種二倍體，grande[ρ+]，(LallemandU.K.LTD，F(xiàn)ife，蘇格蘭，由Danstar Ferment AG生產(chǎn))，作為工業(yè)用有呼吸能力的親代酵母。K1WT用作發(fā)酵研究中的對(duì)照酵母株，并用作產(chǎn)生呼吸缺陷型酵母細(xì)胞的酵母株。2.1.1.3K1Δpet191abK1Δpet191ab是根據(jù)本發(fā)明第一方面的一種酵母細(xì)胞。K1Δpet191ab是K1WT的一種核小菌落突變體，具有PET191基因兩個(gè)拷貝的破壞。這種突變導(dǎo)致細(xì)胞色素c氧化酶全酶裝配的失敗，從而誘導(dǎo)100％的呼吸缺陷。以下給出了關(guān)于該突變體產(chǎn)生的細(xì)節(jié)。2.1.1工業(yè)酵母株的遺傳修飾K1WT具有兩種拷貝的PET191(即它是該基因的二倍體)，因此采取措施來(lái)刪除這兩種基因拷貝(PET191a和PET191b)。
使用Guldener等人(1996，核酸研究(24)132519-2524)發(fā)展的改進(jìn)的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)-介導(dǎo)的基因破壞技術(shù)進(jìn)行K1WT中的多基因刪除，其中l(wèi)oxP-kanMX-loxP破壞盒結(jié)合了異源kanR標(biāo)記(Wach等人，1994，如上文)與噬菌體P1的Cre-loxP重組系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)。2.1.1.1第一種拷貝PET191(a)的破壞(a)破壞盒的產(chǎn)生最初用1.1.2.1中所述的PCR方法產(chǎn)生1.36kb的破壞盒(pet191∷loxPKanMX4(1))，用該破壞盒使K1中的ORF PET191無(wú)功能性。除了KanMX4基因側(cè)翼為編碼34bp LoxP反向重復(fù)序列的DNA(SEQ ID NO.17)外，該盒與前述相同。
該破壞盒的產(chǎn)生是使用載體pUG6(Guldener等人，如上文，所述的環(huán)狀染色體外DNA元件)作為模板，并使用與1.1.2.1中所用相同的兩種引物(SEQ ID NO 7和8)。
pUG6含有側(cè)翼為34bp loxP反向重復(fù)序列的KanMX4基因(來(lái)源于大腸桿菌，可在酵母中表達(dá)而使該酵母對(duì)抗生素遺傳霉素有抗性)(見(jiàn)圖8)。
此兩種引物具有與loxPKanMX4盒任一側(cè)區(qū)域同源的19-22個(gè)核苷酸，并具有35個(gè)核苷酸的延伸，該延伸或者與ORF PET191起始密碼子的直接上游區(qū)同源或者與其終止密碼子的下游區(qū)同源(見(jiàn)圖9(a))。
(b)用破壞盒對(duì)K1的轉(zhuǎn)化該盒正確擴(kuò)增后，將1-2μg乙醇沉淀的DNA用于K1WT的轉(zhuǎn)化。一旦轉(zhuǎn)化，在PET191∷loxPKanMX4(1)盒的同源區(qū)與靶基因之間即發(fā)生重組事件，導(dǎo)致PET191的破壞(圖9(b))。由于破壞盒的遺傳霉素抗性基因，在遺傳霉素平板上進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的篩選，并對(duì)于正確的基因破壞體進(jìn)行轉(zhuǎn)化子篩查。
(c)正確基因破壞的驗(yàn)證用1.1.3所述的分析PCR(Wach等人，1994)驗(yàn)證了該破壞盒向遺傳霉素抗性酵母基因組基因座的正確定向。
分析PCR的結(jié)果表明，工業(yè)株K1Δpet191a(“a”指明K1中PET191第一種拷貝的破壞)具有被正確破壞的兩種PET191等位基因之一，而另一種PET191 ORF(PET191b)保持完整，即該菌株在染色體X上的PET191基因座處為雜合的。
為了分離染色體，也用鉗位均勻電場(chǎng)(CHEF)技術(shù)對(duì)K1Δpet191a施以脈沖電場(chǎng)凝膠電泳。其后是Southern雜交，由此用32p-標(biāo)記的loxPKanMX4盒探測(cè)硝化纖維素膜(染色體DNA與之結(jié)合)。隨后對(duì)磷成像儀(Biorad，UK)的曝光表明，pet191∷loxPkanMX4盒已經(jīng)正確地整合入染色體X中。
(d)YEP351-cre-cyh的構(gòu)建如圖10所示，YEP351cre-cyh由YEP351(由Hill等人，酵母2163-167，1986充分描述)衍生。YEP351cre-cyh是一種多拷貝的質(zhì)粒，含有GAL1/cre重組酶系統(tǒng)，和賦予對(duì)抗生素環(huán)己酰亞胺(cyh)抗性的標(biāo)記基因。環(huán)己酰亞胺是一種抑制蛋白質(zhì)合成的抗生素，在真核生物中，這種抑制由80S核糖體的60S核糖體亞基肽基轉(zhuǎn)移酶活性的抑制引起。釀酒酵母對(duì)低濃度(一般為0.2μg/ml)的環(huán)己酰亞胺敏感。
將環(huán)己酰亞胺基因(Genbank保藏號(hào)M64932，及Sasnauskas等人(1992)基因116105-108頁(yè))的3330bp XbaI-HindIII片段連接入XbaI-HindIII消化的酵母多拷貝質(zhì)粒YEP351(5644bp)中，產(chǎn)生YEP351-cyh(8944bp)(見(jiàn)圖10(b))。用得到的連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(XL1-Blue)，使用藍(lán)/白篩選系統(tǒng)，YEP351 lacZ基因的破壞使推斷的YEP351-cyh克隆的分離成為可能。從大腸桿菌中小量制備分離質(zhì)粒，并將其引入釀酒酵母FY23中，使該菌株對(duì)抗生素環(huán)己酰亞胺(2μg/ml)有抗性。
2260bp PvuII“cre重組酶”片段由GAL1啟動(dòng)子、cre重組酶基因和來(lái)源于pSH47的CYC1終止子組成(參見(jiàn)Guldener等人，如上文)，將其連接至SacI消化的平端YEP351-cyh中，產(chǎn)生YEP351-cre-cyh(11204bp)(見(jiàn)圖10(c))。用得到的連接混合物轉(zhuǎn)化釀酒酵母，使用32P-標(biāo)記的“cre”插入片段作為探針，對(duì)推斷的YEP351-cre-cyh進(jìn)行酵母菌落雜交，并以此分離。
(e)標(biāo)記復(fù)原為了從遺傳霉素抗性雜合缺失體菌株K1Δpet191a中刪除第二種PET191等位基因(PET191b)，首先要利用cre重組酶系統(tǒng)從PET191a中去除KanMX標(biāo)記。實(shí)現(xiàn)方法是最初用YEP351-cre-cyh轉(zhuǎn)化該菌株(見(jiàn)圖9(d)和圖10)。通過(guò)對(duì)基本培養(yǎng)基補(bǔ)充環(huán)己酰亞胺(cyh＝2μg/ml)對(duì)K1Δpet191a保持載體的選擇壓力。
在用作唯一碳源的半乳糖的存在下完成cre重組酶基因的表達(dá)(見(jiàn)圖9(e))。cre重組酶介導(dǎo)KanMX標(biāo)記側(cè)翼的兩種反向重復(fù)loxP位點(diǎn)的重組。兩種loxP位點(diǎn)彼此相鄰地對(duì)齊并重組，引起標(biāo)記從破壞的PET191基因座上的有效切除，使其重復(fù)地用于隨后的基因刪除。該技術(shù)確保基因刪除中使用的實(shí)際上所有異源DNA的去除，由于當(dāng)前對(duì)釀造工業(yè)中使用基因工程酵母的限制，因此這是重要的。兩種34bp loxP位點(diǎn)之一仍在缺失的PET191基因座處(見(jiàn)圖9(f))。在半乳糖培養(yǎng)基中只生長(zhǎng)2小時(shí)對(duì)于≥95％細(xì)胞中l(wèi)oxPKanMX4標(biāo)記的切除即是足夠的，產(chǎn)生的菌落成為遺傳霉素敏感的。通過(guò)將細(xì)胞涂板于補(bǔ)充有環(huán)己酰亞胺的基本培養(yǎng)基上，并將菌落轉(zhuǎn)移到遺傳霉素上證明不生長(zhǎng)，證實(shí)了這一點(diǎn)。
通過(guò)導(dǎo)致只有572bp野生型帶產(chǎn)生的菌落PCR，驗(yàn)證了標(biāo)記從K1Δpet191a上的正確切除。缺失片段的擴(kuò)增不再是可能的，因?yàn)橐郧罢系腒anMX盒現(xiàn)已不存在，使菌株對(duì)遺傳霉素敏感。2.1.1.2PET191第二拷貝的破壞然后通過(guò)用第二種pet191∷loxPKanMX4(2)破壞盒轉(zhuǎn)化，在含有YEP351-cre-cyh的遺傳霉素敏感性菌株中進(jìn)行第二輪基因破壞(圖11(2))。
如2.1.1.1所述構(gòu)建pet191∷loxPKanMX4(2)，所不同的是用不同引物構(gòu)建該盒，使得破壞盒的5’和3’端與位于第一種破壞盒同源區(qū)內(nèi)部的PET191基因區(qū)同源。在PCR步驟中使用的兩種引物(SEQ ID NO 18和19)與loxPKanMX4盒任一側(cè)區(qū)域具有核苷酸同源性，并具有與PET191基因內(nèi)部區(qū)同源的核苷酸延伸。
表6用于產(chǎn)生第二種破壞盒pet191∷loxPKanMX4(2)的引物
對(duì)0.5mg/ml G418抗性的菌落進(jìn)行菌落PCR。824bp缺失片段的單獨(dú)出現(xiàn)證實(shí)具有雙PET191缺失體K1Δpet191ab(“b”指明K1中未知數(shù)量的PET191 ORF第二種拷貝的破壞)。未見(jiàn)到572bp野生型片段，證實(shí)PET191的兩種拷貝都已被成功地刪除(圖9(f))。
如同2.1.1.1(f)，從突變體上切除所有異源DNA(除單一34bp loxP位點(diǎn)外)，通過(guò)cre重組酶在半乳糖培養(yǎng)基上的表達(dá)產(chǎn)生K1Δpet191ab(如上所述)，引起菌株對(duì)遺傳霉素的敏感性。2.1.1.3載體復(fù)原通過(guò)使菌株生長(zhǎng)至少100代，每代的載體損失率為1％，去除使菌株對(duì)環(huán)己酰亞胺有抗性的載體YEP351-cre-cyh。重復(fù)傳代培養(yǎng)大約10天后對(duì)培養(yǎng)物的復(fù)制涂板(向100ml YPD中加入100μl過(guò)夜培養(yǎng)物)產(chǎn)生遺傳霉素敏感的、環(huán)己酰亞胺敏感的K1Δpet191ab核小菌落。2.1.2K1Δpet191ab概述遺傳改造工業(yè)酵母株K1WT，產(chǎn)生呼吸缺陷型核小菌落K1Δpet191ab。除了呼吸所需的兩種PET191基因缺失外，K1Δpet191ab與其親本K1WT等基因(遺傳學(xué)相同)。保持在每一缺失的PET191基因座都插入的是單一34bp loxP位點(diǎn)。分析PCR是一種用來(lái)驗(yàn)證正確基因缺失的高特異性方法，其證實(shí)(a)PET191兩種拷貝的缺乏，和(b)未改變其它的非靶基因。
核小菌落具有完全功能性的線粒體DNA，并且對(duì)任何抗生素(如遺傳霉素或環(huán)己酰亞胺)無(wú)抗性，因?yàn)镵anMX基因和載體YEP351-cre-cyh已被去除。在這兩種抗生素上不能生長(zhǎng)證實(shí)了酵母的敏感性。
應(yīng)當(dāng)理解，標(biāo)記基因未缺失的K1的突變體也落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，SEQ ID NO.3的DNA片段(在同源重組過(guò)程中插入的loxP∷KanMX4 DNA片段)可留在K1中PET191的一種或兩種拷貝中。當(dāng)情況如此時(shí)，核小菌落酵母仍適于根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)乙醇，盡管事實(shí)是標(biāo)記基因的切除常常是所希望的(例如，為了防止有抗生素抗性的微生物向環(huán)境中的引入)。2.2K1Δpet191ab的表征可基本上根據(jù)實(shí)施例1所述的方法培養(yǎng)K1Δpet191ab細(xì)胞，并且可以估計(jì)從該細(xì)胞中產(chǎn)生的乙醇。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)姓名SACHETPACK LIMITED(B)街道6 PIENTON WAY，NORTH CHESHIRE TRADINGESTATE(C)城市PRENTON(E)國(guó)家英國(guó)(F)郵政編碼L43 3DU(ii)發(fā)明名稱乙醇生產(chǎn)(iii)序列數(shù)目19(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型磁盤(B)計(jì)算機(jī)IBM兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatnetIn Release #1.0 Version #1.30(EPO)(2)SEQ.ID.NO.1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度327個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假擬非(xi)SEQ.ID.NO.1的序列描述TGCAGAGATC GCCCTGTGTC ATGATAGAGA GACATAACCC TCAAGAATGT CTTGACAATC60CAGAGCTGAA TAAGGATCTG CCCGAACTTT GTATTGCTCA GATGAAAGCA TTTTTGGATT120GTAAGCGAGG AATCGTCGAC ATGACTAAGC GGTTCACAGG TAACGCACCT CTGTCGACTG180GCAAGTACGA TCAACAGTAC GAAAACTTGT GCAAAGGAAA GTTTGATCCG AGGGAGGAGA240TGGAAAAGCT AAAACTTCTG AACAGCCAGC AGAAGGACTG ATTATTTATG AAAATTGGCC 300TGTAAATATA TACATAAATA AATATAT 327(2)SEQ.ID.NO.2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1544個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假擬非(xi)SEQ.ID.NO.2的序列描述CAGCTGAAGC TTCGTACGCT GCAGGTCGAC GGATCCCCGG GTTAATTAAG GCGCGCCAGA 60TCTGTTTAGC TTGCCTCGTC CCCGCCGGGT CACCCGGCCA GCGACATGGA GGCCCAGAAT 120ACCCTCCTTG ACAGTCTTGA CGTGCGCAGC TCAGGGGCAT GATGTGACTG TCGCCCGTAC 180ATTTAGCCCA TACATCCCCA TGTATAATCA TTTGCATCCA TACATTTTGA TGGCCGCACG 240GCGCGAAGCA AAAATTACGG CTCCTCGCTG CAGACCTGCG AGCAGGGAAA CGCTCCCCTC 300ACAGACGCGT TGAATTGTCC CCACGCCGCG CCCCTGTAGA GAAATATAAA AGGTTAGGAT 360TTGCCACTGA GGTTCTTCTT TCATATACTT CCTTTTAAAA TCTTGCTAGG ATACAGTTCT 420CACATCACAT CCGAACATAA ACAACCATGG GTAAGGAAAA GACTCACGTT TCGAGGCCGC 480GATTAAATTC CAACATGGAT GCTGATTTAT ATGGGTATAA ATGGGCTCGC GATAATGTCG 540GGCAATCAGG TGCGACAATC TATCGATTGT ATGGGAAGCC CGATGCGCCA GAGTTGTTTC 600TGAAACATGG CAAAGGTAGC GTTGCCAATG ATGTTACAGA TGAGATGGTC AGACTAAACT 660GGCTGACGGA ATTTATGCCT CTTCCGACCA TCAAGCATTT TATCCGTACT CCTGATGATG 720CATGGTTACT CACCACTGCG ATCCCCGGCA AAACAGCATT CCAGGTATTA GAAGAATATC 780CTGATTCAGG TGAAAATATT GTTGATGCGC TGGCAGTGTT CCTGCGCCGG TTGCATTCGA 840TTCCTGTTTG TAATTGTCCT TTTAACAGCG ATCGCGTATT TCGTCTCGCT CAGGCGCAAT 900CACGAATGAA TAACGGTTTG GTTGATGCGA GTGATTTTGA TGACGAGCGT AATGGCTGGC 960CTGTTGAACA AGTCTGGAAA GAAATGCATA AGCTTTTGCC ATTCTCACCG GATTCAGTCG1020TCACTCATGG TGATTTCTCA CTTGATAACC TTATTTTTGA CGAGGGGAAA TTAATAGGTT1080GTATTGATGT TGGACGAGTC GGAATCGCAG ACCGATACCA GGATCTTGCC ATCCTATGGA1140ACTGCCTCGG TGAGTTTTCT CCTTCATTAC AGAAACGGCT TTTTCAAAAA TATGGTATTG1200ATAATCCTGA TATGAATAAA TTGCAGTTTC ATTTGATGCT CGATGAGTTT TTCTAATCAG1260TACTGACAAT AAAAAGATTC TTGTTTTCAA GAACTTGTCA TTTGTATAGT TTTTTTATAT1320TGTAGTTGTT CTATTTTAAT CAAATGTTAG CGTGATTTAT ATTTTTTTTC GCCTCGACAT1380CATCTGCCCA GATGCGAAGT TAAGTGCGCA GAAAGTAATA TCATGCGTCA ATCGTATGTG1440AATGCTGGTC GCTATACTGC TGTCGATTCG ATACTAACGC CGCCATCCAG TGTCGAAAAC1500GAGCTCGAAT TCATCGATGA TATCAGATCC ACTAGTGGCC TATG 1544(2)SEQ.ID.NO.3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1598個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假擬非(xi)SEQ.ID.NO.3的序列描述CAGCTGAAGC TTCGTACGCT GCAGGTCGAC AACCCTTAAT ATAACTTCGT ATAATGTATG 60CTATACGAAG TTATTAGGTC TAGATTTAGC TTGCCTCGTC CCCGCCGGGT CACCCGGCCA 120GCGACATGGA GGCCCAGAAT ACCCTCCTTG ACAGTCTTGA CGTGCGCAGC TCAGGGGCAT 180GATGTGACTG TCGCCCGTAC ATTTAGCCCA TACATCCCCA TGTATAATCA TTTGCATCCA 240
TACATTTTGA TGGCCGCACG GCGCGAAGCA AAAATTACGG CTCCTCGCTG CAGACCTGCG 300AGCAGGGAAA CGCTCCCCTC ACAGACGCGT TGAATTGTCC CCACGCCGCG CCCCTGTAGA 360GAAATATAAA AGGTTAGGAT TTGCCACTGA GGTTCTTCTT TCATATACTT CCTTTTAAAA 420TCTTGCTAGG ATACAGTTCT CACATCACAT CCGAACATAA ACAACCATGG GTAAGGAAAA 480GACTCACGTT TCGAGGCCGC GATTAAATTC CAACATGGAT GCTGATTTAT ATGGGTATAA 540ATGGGCTCGC GATAATGTCG GGCAATCAGG TGCGACAATC TATCGATTGT ATGGGAAGCC 600CGATGCGCCA GAGTTGTTTC TGAAACATGG CAAAGGTAGC GTTGCCAATG ATGTTACAGA 660TGAGATGGTC AGACTAAACT GGCTGACGGA ATTTATGCCT CTTCCGACCA TCAAGCATTT 720TATCCGTACT CCTGATGATG CATGGTTACT CACCACTGCG ATCCCCGGCA AAACAGCATT 780CCAGGTATTA GAAGAATATC CTGATTCAGG TGAAAATATT GTTGATGCGC TGGCAGTGTT 840CCTGCGCCGG TTGCATTCGA TTCCTGTTTG TAATTGTCCT TTTAACAGCG ATCGCGTATT 900TCGTCTCGCT CAGGCGCAAT CACGAATGAA TAACGGTTTG GTTGATGCGA GTGATTTTGA 960TGACGAGCGT AATGGCTGGC CTGTTGAACA AGTCTGGAAA GAAATGCATA AGCTTTTGCC1020ATTCTCACCG GATTCAGTCG TCACTCATGG TGATTTCTCA CTTGATAACC TTATTTTTGA1080CGAGGGGAAA TTAATAGGTT GTATTGATGT TGGACGAGTC GGAATCGCAG ACCGATACCA1140GGATCTTGCC ATCCTATGGA ACTGCCTCGG TGAGTTTTCT CCTTCATTAC AGAAACGGCT1200TTTTCAAAAA TATGGTATTG ATAATCCTGA TATGAATAAA TTGCAGTTTC ATTTGATGCT1260CGATGAGTTT TTCTAATCAG TACTGACAAT AAAAAGATTC TTGTTTTCAA GAACTTGTCA1320TTTGTATAGT TTTTTTATAT TGTAGTTGTT CTATTTTAAT CAAATGTTAG CGTGATTTAT1380ATTTTTTTTC GCCTCGACAT CATCTGCCCA GATGCGAAGT TAAGTGCGCA GAAAGTAATA1440TCATGCGTCA ATCGTATGTG AATGCTGGTC GCTATACTGC TGTCGATTCG ATACTAACGC1500CGCCATCCAG TGTCGAAAAC GAGAACCCTT AATATAACTT CGTATAATGT ATGCTATACG1560AAGTTATTAG GTGATATCAG ATCCACTAGT GGCCTATG1598(2)SEQ.ID.NO.4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度237個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假擬非(xi)SEQ.ID.NO.4的序列描述ATGTCTTGAC AATCCAGAGC TGAATAAGGA TCTGCCCGAA CTTTGTATTG CTCAGATGAA 60AGCATTTTTG GATTGTAAGC GAGGAATCGT CGACATGACT AAGCGGTTCA CAGGTAACGC 120ACCTCTGTCG ACTGGCAAGT ACGATCAACA GTACGAAAAC TTGTGCAAAG GAAAGTTTGA 180TCCGAGGGAG GAGATGGAAA AGCTAAAACT TCTGAACAGC CAGCAGAAGG ACTGATT237(2)SEQ.ID.NO.5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度380個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假擬非(xi)SEQ.ID.NO.5的序列描述CATCCGTAAG ATTCGCTCAA ACACATGCTC TTTCCAACGC TGCTGTAATG GATCTGCAAT 60CCAGATGGGA GAACATGCCC TCCACTGAGC AGCAGGATAT TGTCAGTAAG TTGAGTGAAC 120GTCAAAAATT ACCATGGGCA CAGCTTACTG AGCCTGAAAA GCAAGCTGTG TGGTACATTT 180CTTACGGAGA ATGGGGCCCA AGAAGACCTG TATTGAATAA GGGTGATTCC AGTTTTATTG 240CCAAAGGTGT TGCTGCAGGC CTACTATTTT CAGTGGGACT TTTTGCTGTC GTCAGGATGG 300CGGGTGGCCA AGACGCAAAG ACCATGAATA AGGAGTGGCA GCTAAAGAGT GACGAATATT 360TGAAGTCGAA GAATGCTAAT 380(2)SEQ.ID.NO.6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度3938個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假擬非(xi)SEQ.ID.NO.6的序列描述GAACGCGGCC GCCAGCTGAA GCTTCGTACG CTGCAGGTCG ACGGATCCCC GGGTTAATTA 60AGGCGCGCCA GATCTGTTTA GCTTGCCTCG TCCCCGCCGG GTCACCCGGC CAGCGACATG 120GAGGCCCAGA ATACCCTCCT TGACAGTCTT GACGTGCGCA GCTCAGGGGC ATGATGTGAC 180TGTCGCCCGT ACATTTAGCC CATACATCCC CATGTATAAT CATTTGCATC CATACATTTT 240GATGGCCGCA CGGCGCGAAG CAAAAATTAC GGCTCCTCGC TGCAGACCTG CGAGCAGGGA 300AACGCTCCCC TCACAGACGC GTTGAATTGT CCCCACGCCG CGCCCCTGTA GAGAAATATA 360AAAGGTTAGG ATTTGCCACT GAGGTTCTTC TTTCATATAC TTCCTTTTAA AATCTTGCTA 420GGATACAGTT CTCACATCAC ATCCGAACAT AAACAACCAT GGGTAAGGAA AAGACTCACG 480TTTCGAGGCC GCGATTAAAT TCCAACATGG ATGCTGATTT ATATGGGTAT AAATGGGCTC 540GCGATAATGT CGGGCAATCA GGTGCGACAA TCTATCGATT GTATGGGAAG CCCGATGCGC 600CAGAGTTGTT TCTGAAACAT GGCAAAGGTA GCGTTGCCAA TGATGTTACA GATGAGATGG 660TCAGACTAAA CTGGCTGACG GAATTTATGC CTCTTCCGAC CATCAAGCAT TTTATCCGTA 720CTCCTGATGA TGCATGGTTA CTCACCACTG CGATCCCCGG CAAAACAGCA TTCCAGGTAT 780TAGAAGAATA TCCTGATTCA GGTGAAAATA TTGTTGATGC GCTGGCAGTG TTCCTGCGCC 840GGTTGCATTC GATTCCTGTT TGTAATTGTC CTTTTAACAG CGATCGCGTA TTTCGTCTCG 900CTCAGGCGCA ATCACGAATG AATAACGGTT TGGTTGATGC GAGTGATTTT GATGACGAGC 960GTAATGGCTG GCCTGTTGAA CAAGTCTGGA AAGAAATGCA TAAGCTTTTG CCATTCTCAC1020CGGATTCAGT CGTCACTCAT GGTGATTTCT CACTTGATAA CCTTATTTTT GACGAGGGGA1080AATTAATAGG TTGTATTGAT GTTGGACGAG TCGGAATCGC AGACCGATAC CAGGATCTTG1140CCATCCTATG GAACTGCCTC GGTGAGTTTT CTCCTTCATT ACAGAAACGG CTTTTTCAAA1200AATATGGTAT TGATAATCCT GATATGAATA AATTGCAGTT TCATTTGATG CTCGATGAGT1260TTTTCTAATC AGTACTGACA ATAAAAAGAT TCTTGTTTTC AAGAACTTGT CATTTGTATA1320GTTTTTTTAT ATTGTAGTTG TTCTATTTTA ATCAAATGTT AGCGTGATTT ATATTTTTTT1380TCGCCTCGAC ATCATCTGCC CAGATGCGAA GTTAAGTGCG CAGAAAGTAA TATCATGCGT1440CAATCGTATG TGAATGCTGG TCGCTATACT GCTGTCGATT CGATACTAAC GCCGCCATCC1500AGTTTAAACG AGCTCGAATT CATCGATGAT ATCAGATCCA CTAGTGGCCT ATGCGGCCGC1560GGATCTGCCG GTCTCCCTAT AGTGAGTCGT ATTAATTTCG ATAAGCCAGG TTAACCTGCA1620TTAATGAATC GGCCAACGCG CGGGGAGAGG CGGTTTGCGT ATTGGGCGCT CTTCCGCTTC1680CTCGCTCACT GACTCGCTGC GCTCGGTCGT TCGGCTGCGG CGAGCGGTAT CAGCTCACTC1740AAAGGCGGTA ATACGGTTAT CCACAGAATC AGGGGATAAC GCAGGAAAGA ACATGTGAGC1800AAAAGGCCAG CAAAAGGCCA GGAACCGTAA AAAGGCCGCG TTGCTGGCGT TTTTCCATAG1860GCTCCGCCCC CCTGACGAGC ATCACAAAAA TCGACGCTCA AGTCAGAGGT GGCGAAACCC1920GACAGGACTA TAAAGATACC AGGCGTTTCC CCCTGGAAGC TCCCTCGTGC GCTCTCCTGT1980TCCGACCCTG CCGCTTACCG GATACCTGTC CGCCTTTCTC CCTTCGGGAA GCGTGGCGCT2040TTCTCAATGC TCACGCTGTA GGTATCTCAG TTCGGTGTAG GTCGTTCGCT CCAAGCTGGG2100CTGTGTGCAC GAACCCCCCG TTCAGCCCGA CCGCTGCGCC TTATCCGGTA ACTATCGTCT2160TGAGTCCAAC CCGGTAAGAC ACGACTTATC GCCACTGGCA GCAGCCACTG GTAACAGGAT2220TAGCAGAGCG AGGTATGTAG GCGGTGCTAC AGAGTTCTTG AAGTGGTGGC CTAACTACGG2280CTACACTAGA AGGACAGTAT TTGGTATCTG CGCTCTGCTG AAGCCAGTTA CCTTCGGAAA2340AAGAGTTGGT AGCTCTTGAT CCGGCAAACA AACCACCGCT GGTAGCGGTG GTTTTTTTGT2400TTGCAAGCAG CAGATTACGC GCAGAAAAAA AGGATCTCAA GAAGATCCTT TGATCTTTTC2460TACGGGGTCT GACGCTCAGT GGAACGAAAA CTCACGTTAA GGGATTTTGG TCATGAGATT2520ATCAAAAAGG ATCTTCACCT AGATCCTTTT AAATTAAAAA TGAAGTTTTA AATCAATCTA2580AAGTATATAT GAGTAAACTT GGTCTGACAG TTACCAATGC TTAATCAGTG AGGCACCTAT2640CTCAGCGATC TGTCTATTTC GTTCATCCAT AGTTGCCTGA CTCCCCGTCG TGTAGATAAC2700TACGATACGG GAGGGCTTAC CATCTGGCCC CAGTGCTGCA ATGATACCGC GAGACCCACG2760CTCACCGGCT CCAGATTTAT CAGCAATAAA CCAGCCAGCC GGAAGGGCCG AGCGCAGAAG2820TGGTCCTGCA ACTTTATCCG CCTCCATCCA GTCTATTAAT TGTTGCCGGG AAGCTAGAGT2880AAGTAGTTCG CCAGTTAATA GTTTGCGCAA CGTTGTTGCC ATTGCTACAG GCATCGTGGT2940GTCACGCTCG TCGTTTGGTA TGGCTTCATT CAGCTCCGGT TCCCAACGAT CAAGGCGAGT3000TACATGATCC CCCATGTTGT GCAAAAAAGC GGTTAGCTCC TTCGGTCCTC CGATCGTTGT3060CAGAAGTAAG TTGGCCGCAG TGTTATCACT CATGGTTATG GCAGCACTGC ATAATTCTCT3120TACTGTCATG CCATCCGTAA GATGCTTTTC TGTGACTGGT GAGTACTCAA CCAAGTCATT3180CTGAGAATAG TGTATGCGGC GACCGAGTTG CTCTTGCCCG GCGTCAATAC GGGATAATAC3240CGCGCCACAT AGCAGAACTT TAAAAGTGCT CATCATTGGA AAACGTTCTT CGGGGCGAAA3300ACTCTCAAGG ATCTTACCGC TGTTGAGATC CAGTTCGATG TAACCCACTC GTGCACCCAA3360CTGATCTTCA GCATCTTTTA CTTTCACCAG CGTTTCTGGG TGAGCAAAAA CAGGAAGGCA3420AAATGCCGCA AAAAAGGGAA TAAGGGCGAC ACGGAAATGT TGAATACTCA TACTCTTCCT3480TTTTCAATAT TATTGAAGCA TTTATCAGGG TTATTGTCTC ATGAGCGGAT ACATATTTGA3540ATGTATTTAG AAAAATAAAC AAATAGGGGT TCCGCGCACA TTTCCCCGAA AAGTGCCACC3600
TGACGTCTAA GAAACCATTA TTATCATGAC ATTAACCTAT AAAAATAGGC GTATCACGAG3660GCCCTTTCGT CTCGCGCGTT TCGGTGATGA CGGTGAAAAC CTCTGACACA TGCAGCTCCC3720GGAGACGGTC ACAGCTTGTC TGTAAGCGGA TGCCGGGAGC AGACAAGCCC GTCAGGGCGC3780GTCAGCGGGT GTTGGCGGGT GTCGGGGCTG GCTTAACTAT GCGGCATCAG AGCAGATTGT3840ACTGAGAGTG CACCATATGG ACATATTGTC GTTAGAACGC GGCTACAATT AATACATAAC3900CTTATGTATC ATACACATAC GATTTAGGTG ACACTATA3938(2)SEQ.ID.NO.7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度54個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假擬非(xi)SEQ.ID.NO.7的序列描述ATGTAAAGAT CAGAAGAAGG CTGTCGCTAT ATGTTCAGCT GAAGCTTCGT ACGC 54(2)SEQ.ID.NO.8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度56個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假擬非(xi)SEQ.ID.NO.8的序列描述GATTACTGGA CAAACCGAAT AAAAGAGCTT GACGCCATAG GCCACTAGTG GATCTG 56(2)SEQ.ID.NO.9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假擬非(xi)SEQ.ID.NO.9的序列描述GCACCTCTGT CGACTGG 17(2)SEQ.ID.NO.10的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假擬非(xi)SEQ.ID.NO.10的序列描述GAAAGCACGT TAACTCCCA 19(2)SEQ.ID.NO.11的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度54個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假擬非(xi)SEQ.ID.NO.11的序列描述CACTTTTACT AGAGCTGGTG GACTATCACG TATTACAGCT GAAGCTTCGT ACGC54(2)SEQ.ID.NO.12的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度57個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假擬非(xi)SEQ.ID.NO.12的序列描述TCATTTAGAT TGGACCTGAG AATAACCACC CCAAGGCATA GGCCACTACT GGATCTG 57(2)SEQ.ID.NO.13的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度16個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假擬非(xi)SEQ.ID.NO.13的序列描述CGCCTCCCTA CGCTTC 16(2)SEQ.ID.NO.14的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假擬非(xi)SEQ.ID.NO.14的序列描述GCTCAGTAAG CTGTGCCC 18(2)SEQ.ID.NO.15的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假擬非(xi)SEQ.ID.NO.15的序列描述TCTCCTTCAT TACAGAAACG G 21(2)SEQ.ID.NO.16的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假擬非(xi)SEQ.ID.NO.16的序列描述CCGTTTCTGT AATGAAGGAG A 21(2)SEQ.ID.NO.17的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度34個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假擬非(xi)SEQ.ID.NO.17的序列描述ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAG TTAT 34(2)SEQ.ID.NO.18的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度46個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假擬非(xi)SEQ.ID.NO.18的序列描述GAGATCGCCC TGTGTCATGA TAGAGAGACA TAACCCTCAA GACAGC46(2)SEQ.ID.NO.19的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度48個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假擬非(xi)SEQ.ID.NO.19的序列描述TTTATTTATG TATATATTTA CAGGCCAATT TTCATAAATA CATAGGCC 48
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)乙醇的方法，包括培養(yǎng)呼吸缺陷型酵母細(xì)胞及從該酵母細(xì)胞中分離乙醇，該細(xì)胞具有至少一種呼吸所需的在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中是無(wú)功能的和/或被抑制的核基因，或其產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中呼吸缺陷型酵母細(xì)胞由一種呼吸充分型酵母株衍生而來(lái)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中相對(duì)于呼吸充分型酵母株，呼吸缺陷型酵母細(xì)胞的呼吸至少降低了60％。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中相對(duì)于呼吸充分型酵母株，呼吸缺陷型酵母細(xì)胞的呼吸至少降低了75％。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中相對(duì)于呼吸充分型酵母株，呼吸缺陷型酵母細(xì)胞的呼吸至少降低了85％。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中相對(duì)于呼吸充分型酵母株，呼吸缺陷型酵母細(xì)胞的呼吸至少降低了95％。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-6中任一個(gè)的方法，其中通過(guò)對(duì)呼吸充分型酵母株的遺傳修飾使得至少一種呼吸所需的核基因或其產(chǎn)物是無(wú)功能的，從而產(chǎn)生呼吸缺陷型酵母細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中修飾是一種破壞基因產(chǎn)物的表達(dá)或功能的突變。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中通過(guò)核基因與DNA分子之間的同源重組引入突變。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中使用PCR-介導(dǎo)的基因破壞技術(shù)產(chǎn)生呼吸缺陷型酵母細(xì)胞。
11.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中核基因是PET基因。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中該基因?yàn)镻ET191。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中修飾PET191基因，使得從酵母細(xì)胞基因組中切除鑒定為SEQ ID NO.1的DNA序列，并用鑒定為SEQID NO.2的DNA序列替換。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中修飾PET191基因，使得從酵母細(xì)胞基因組中切除鑒定為SEQ ID NO.1的DNA序列，并用鑒定為SEQID NO.17的DNA序列替換。
15.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中修飾PET191基因，使得從酵母細(xì)胞基因組中切除鑒定為SEQ ID NO.4的DNA序列，并用鑒定為SEQID NO.17的DNA序列替換。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一個(gè)的方法，其中修飾的核基因與細(xì)胞色素c氧化酶的功能或表達(dá)有關(guān)。
17.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中修飾的核基因是COX5a。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中修飾COX5a基因，使得從酵母細(xì)胞基因組中切除鑒定為SEQ ID NO.5的DNA序列，并用鑒定為SEQID NO.2的DNA序列替換。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一個(gè)的方法，其中至少一種呼吸所需的核基因產(chǎn)物是無(wú)功能的和/或被抑制的。
20.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中呼吸缺陷型酵母細(xì)胞是釀酒酵母或其衍生物。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一個(gè)的方法，其中呼吸缺陷型酵母細(xì)胞是葡萄汁酵母(卡爾酵母)或其衍生物。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一個(gè)的方法，其中呼吸缺陷型酵母細(xì)胞是Saccharomyces sensu stricto組的成員或其衍生物。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一個(gè)的方法，其中呼吸缺陷型酵母細(xì)胞是FY23或其衍生物。
24.根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一個(gè)的方法，其中呼吸缺陷型酵母細(xì)胞是K1或其衍生物。
25.根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一個(gè)的方法，其中呼吸缺陷型酵母細(xì)胞選自M-株或其衍生物、紅星或其衍生物、酒類酵母U.C.L.M.S325或其衍生物或酒類酵母U.C.L.M.S377或其衍生物。
26.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中生長(zhǎng)培養(yǎng)基含有一種可發(fā)酵的糖作為碳水化合物來(lái)源。
27.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中生長(zhǎng)培養(yǎng)基是YPD。
28.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中細(xì)胞在一種發(fā)酵罐中生長(zhǎng)，該發(fā)酵罐具有至少一種調(diào)節(jié)溫度、空氣供給、養(yǎng)分含量、廢料去除及產(chǎn)品提取的裝置。
29.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中通過(guò)分批培養(yǎng)來(lái)培養(yǎng)呼吸缺陷型酵母。
30.根據(jù)權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng)的方法，其中通過(guò)連續(xù)培養(yǎng)來(lái)培養(yǎng)呼吸缺陷型酵母。
31.根據(jù)前述任一權(quán)利要求用于燃料乙醇生產(chǎn)的方法。
32.一種酵母細(xì)胞，其特征在于PET191基因被功能性刪除。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的酵母細(xì)胞，其中通過(guò)DNA分子和編碼PET191基因的DNA之間的同源重組，功能性刪除PET191基因。
34.根據(jù)權(quán)利要求32或33的酵母細(xì)胞，其中該酵母是FY23株。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的酵母細(xì)胞，其中通過(guò)從酵母細(xì)胞基因組中切除鑒定為SEQ ID NO.1的DNA序列，并用鑒定為SEQ ID NO.2的DNA序列替換，從而功能性刪除PET191基因。
36.根據(jù)權(quán)利要求32或33的酵母細(xì)胞，其中該酵母是K1株。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的酵母細(xì)胞，其中具有鑒定為SEQ ID NO.1的DNA序列的PET191基因的一種拷貝(PET191a)被切除，并用鑒定為SEQ ID NO.17的DNA序列替換，且具有鑒定為SEQ ID NO.4的DNA序列的PET191基因的第二種拷貝(PET191b)被切除，并用鑒定為SEQ ID NO.17的DNA序列替換。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產(chǎn)乙醇的方法和可以根據(jù)該方法使用的酵母細(xì)胞。該方法包括培養(yǎng)呼吸缺陷型酵母細(xì)胞(如在此所述的K1△pet191ab),其具有至少一種呼吸所需的在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中無(wú)功能和/或被抑制的核基因或其產(chǎn)物。該方法可用于燃料乙醇的生產(chǎn)或用于酒精飲料的生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/81GK1269836SQ9880883
公開日2000年10月11日 申請(qǐng)日期1998年9月4日 優(yōu)先權(quán)日1997年9月4日
發(fā)明者S·G·奧利弗, A·胡特 申請(qǐng)人:薩謝帕克有限公司