專利名稱：在大腸桿菌中無需包涵體復(fù)性制備溶栓藥物瑞替普酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的重組蛋白質(zhì)藥物制備技術(shù)，具體涉及一種無需包涵 體復(fù)性、直接在大腸桿菌中表達(dá)生產(chǎn)活性溶栓藥物瑞替普酶(Reteplase，rPA)的方法。
背景技術(shù)：
目前，心血管疾病，尤其是血栓栓塞性疾病是危害人類健康的一大殺手。溶栓治療 是血栓性疾病安全而有效的治療手段。rPA是分子量為39. 6kD的單鏈蛋白，由355個氨基 酸組成，它是人組織型纖維蛋白溶解酶原激活劑(Tissue type plasminogen activator, tPA)缺失4-175位氨基酸序列的缺失變體。rPA —級結(jié)構(gòu)中不含tPA分子中的Kringlel、 Finger、EGF結(jié)構(gòu)域(domain)，但保留了 Kringle2及絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域。由于rPA缺失 了 tPA的部分結(jié)構(gòu)域，rPA與纖維蛋白的結(jié)合能力稍弱，但rPA分子中保留的Kringle2結(jié)構(gòu) 域具有對纖維蛋白適中的親和性，更容易作用于血栓內(nèi)部的纖溶酶原，溶栓速度快于tPA。 另外rPA與肝細(xì)胞受體結(jié)合的Kringlel及EGF結(jié)構(gòu)域的缺失使rPA在體內(nèi)的半衰期較tPA 大大延長，可達(dá)18min，因此rPA作為新型溶栓藥物可更好地應(yīng)用于治療急性心肌梗塞，在 療效和臨床使用等方面均優(yōu)于tPA，具有纖溶效果強(qiáng)、再通率高、起效迅速和副作用小等優(yōu) 點，是目前臨床上應(yīng)用最好的第三代溶栓藥物之一。中國專利CN200710303763. 3公開了一種在大腸桿菌中表達(dá)瑞替普酶的方法，盡 管它也是將瑞替普酶基因插入到原核表達(dá)載體的多克隆位點，得到重組表達(dá)載體，再將該 重組表達(dá)載體與質(zhì)粒PREP4共轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到重組大腸桿菌，培養(yǎng)該重組大腸桿菌，表 達(dá)得到瑞替普酶。但該方法中存在的問題在于(1)需要兩個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化，并因此在培養(yǎng)過 程中需要同時添加氨芐青霉素和卡那霉素兩種抗生素，一方面致使重組大腸桿菌遺傳穩(wěn)定 性相對降低，另一方面也較大程度上為工業(yè)化生產(chǎn)及后續(xù)臨床應(yīng)用中如何避免抗生素殘留 污染增加了困難；(2)所獲得的rPA重組蛋白質(zhì)僅通過western blot進(jìn)行鑒定，未能就其 溶栓活性加以驗證，無法確保實現(xiàn)正確的臨床應(yīng)用。目前，國內(nèi)外采用基因工程方法生產(chǎn)rPA的研究主要是應(yīng)用酵母及哺乳動物細(xì)胞 等真核表達(dá)系統(tǒng)中，成本較高，生產(chǎn)周期長，產(chǎn)率很低，且真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)產(chǎn)物易產(chǎn)生糖基 化而影響生物活性。利用大腸桿菌等原核表達(dá)系統(tǒng)則可以大大降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)率，然 而盡管也有不少學(xué)者嘗試在大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)rPA基因，但由于rPA富含9對二硫鍵，大 腸桿菌系統(tǒng)很難直接形成正確的空間構(gòu)象，致使表達(dá)產(chǎn)物多以包涵體蛋白形式存在，必須 將細(xì)胞破碎后才能將其分離出來，分離過程中要用蛋白質(zhì)變性劑，最后還要再把蛋白質(zhì)復(fù) 性，復(fù)性過程中有許多會錯接形成結(jié)構(gòu)異常的分子，同時，菌體殘余蛋白是基因工程藥物生 產(chǎn)過程中不易消除的物質(zhì)，不但收率較低，而且容易影響產(chǎn)品的質(zhì)量，從而影響到藥物的療 效。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種無需包涵體復(fù)性、直接在大腸桿菌中表達(dá)制備活性 溶栓藥物瑞替普酶(rPA)的方法。本發(fā)明是將溶栓藥物瑞替普酶rPA基因插入到原核表達(dá)載體pET40b的多克隆位 點，使其位于DsbC信號肽及其編碼基因下游，得到重組表達(dá)載體，再將該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn) 化大腸桿菌，得到重組大腸桿菌，培養(yǎng)該重組大腸桿菌，表達(dá)、分離純化得到rPA。為實現(xiàn)此 目的本發(fā)明提供如下的技術(shù)方案—種無需包涵體復(fù)性、直接在大腸桿菌中表達(dá)瑞替普酶的方法，其特征在于包括 如下的步驟(1)表達(dá)載體的構(gòu)建將rPA編碼基因插入到表達(dá)載體pET40b的多克隆位點，使其 位于DsbC信號肽及其編碼基因下游，經(jīng)T4DNA連接酶連接，構(gòu)建得到pET40b_rPA重組質(zhì)粒；(2)將pET40b-rPA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，得到重組大腸桿菌；其中重組大腸桿 菌pET40b-rPA氨基酸序列如序列表4。(3)培養(yǎng)該重組大腸桿菌，誘導(dǎo)表達(dá)；(4)收集菌液，超聲離心后，分別對上清及沉淀進(jìn)行SDS-PAGE檢測；(5)分離純化得到目的融合蛋白DsbC-rPA，或經(jīng)鎳柱親和層析純化，用Xa因子 (或甲酸、凝血酶)處理，去除DsbC標(biāo)簽，得到高純度、高活性的rPA目的蛋白。本發(fā)明所述的方法，其中步驟(1)中rPA基因片段與載體中的二硫鍵異構(gòu)酶DsbC 以融合蛋白形式表達(dá)，在DsbC的輔助作用下催化二硫鍵形成，無需進(jìn)行包涵體復(fù)性。本發(fā)明所述的方法，其中所述的培養(yǎng)該重組大腸桿菌的過程中需加入IPTG或乳 糖進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。本發(fā)明所述的方法，其中所述的IPTG終濃度為0. 6mM于25°C誘導(dǎo)3h，乳糖終濃度 為30mM于30°C誘導(dǎo)5h。本發(fā)明所述的方法，其中所述的融合標(biāo)簽DsbC和rPA間是通過凝血酶、Xa因子及 甲酸蛋白質(zhì)切割位點相連，融和蛋白DsbC-rPA利用Xa因子(或甲酸、凝血酶)處理后即可 將二者分離獲得獨立的rPA蛋白質(zhì)。本發(fā)明所述的方法，其中所述的rPA編碼基因克隆插入pET40b載體所用PCR引物 序列為上游引物5，-CGGgEatccGATCGAAGGTCGTTCTTACCAAGGAAACAGTG-3'；下游引物5，-GGGctcgagATTACGGTCGCATGTTGTCACGAATCCAG-3，。其中在上下游引 物中分別引入BamHI和Xhol酶切位點；同時在上游引物中同時引入了 Xa因子蛋白酶切位 點和甲酸蛋白切割位點的編碼DNA。本發(fā)明為了確保目的蛋白形成正確的二硫鍵與空間構(gòu)象，將rPA編碼基因克隆到 二硫鍵異構(gòu)酶DsbC信號肽及其編碼基因下游。DsbC信號肽可將融合蛋白轉(zhuǎn)運到大腸桿菌 細(xì)胞周質(zhì)空間，然后在DsbC的輔助作用下催化二硫鍵的形成，成功的實現(xiàn)了 rPA重組蛋白 的高效可溶性表達(dá)，目的蛋白在不需進(jìn)行包涵體復(fù)性操作且在未切去DsbC標(biāo)簽的情況下， 即可表現(xiàn)出明顯的溶栓活性，進(jìn)一步經(jīng)鎳柱親和層析純化后，用Xa因子(或甲酸、凝血酶) 處理可獲得高純度、高活性的rPA目的蛋白。從而大大簡化了利用大腸桿菌這一目前最為 成熟、成本最低廉的表達(dá)系統(tǒng)制備可溶性、活性rPA的操作方法。
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本發(fā)明的方法成功實現(xiàn)了 rPA重組蛋白的高效可溶性表達(dá)，用BCA蛋白定量法計 算得到在上清液中的可溶性目的蛋白的含量占總蛋白量的40%左右，且目的蛋白在不需進(jìn) 行包涵體復(fù)性操作且在未切去DsbC標(biāo)簽的情況下，即可表現(xiàn)出明顯的溶栓活性，進(jìn)一步經(jīng) 鎳柱親和層析純化后，用Xa因子(或甲酸、凝血酶)處理可獲得高純度、高活性的rPA目的 蛋白。本發(fā)明的制備方法簡單易行，回收率高，縮短了 rPA生產(chǎn)工藝，降低了生產(chǎn)成本， 為更好的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)rPA奠定了堅實的基礎(chǔ)，對其它富含二硫鍵的蛋白質(zhì)的工業(yè)化 生產(chǎn)也具有重要的指導(dǎo)意義。


圖1是乳糖和IPTG誘導(dǎo)DsbC-rPA在大腸桿菌中表達(dá)的SDS-PAGE檢測。1 蛋白 質(zhì)Marker ；2 :IPTG誘導(dǎo)rPA重組大腸桿菌；3 :IPTG誘導(dǎo)pET40b空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌； 4 乳糖誘導(dǎo)rPA重組大腸桿菌。圖2是鎳柱法親和層析純化DsbC-rPA融合蛋白。圖3是用Xa因子處理DsbC-rPA融合蛋白釋放rPA蛋白質(zhì)的SDS-PAGE檢測。1 Xa因子切割融合蛋白DsbC-rPA 2 :DsbC_rPA融合蛋白3 蛋白質(zhì)Marker。圖4是DsbC-rPA和rPA的溶栓活性檢測。1 :pET40b空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的表 達(dá)產(chǎn)物2 :DsbC-rPA融合蛋白3 經(jīng)Xa因子處理獲得的rPA蛋白質(zhì)4 :tPA標(biāo)準(zhǔn)品5 經(jīng)凝血 酶處理獲得的rPA蛋白質(zhì)6 尿激酶(uPA)標(biāo)準(zhǔn)品。
具體實施例方式為了簡單和清楚的目的，下文恰當(dāng)?shù)氖÷粤斯夹g(shù)的描述，以免那些不必要的 細(xì)節(jié)影響對本技術(shù)方案的描述。在下述實施例中所給出的實驗方法，如無特別說明，均為常 規(guī)方法。其中所用試劑均有市售。實施例1rPA基因工程菌的構(gòu)建1、以本實驗室前期研究中構(gòu)建的pMD18T-tPA質(zhì)粒作為模板(江潔，江成英，杜連 祥等.Reteplase基因的克隆及在甲醇畢赤酵母中的表達(dá).華南理工大學(xué)學(xué)報自然科學(xué)版， 2006,34(12) 25-29)。采用上游引物5‘ -CGGggatccGATCGAAGGTCGTTCTTACCAAGGAAACAGTG-3‘(序列表；1)；下游引物5，-GGGctcgagATTACGGTCGCATGTTGTCACGAATCCAG-3，，(序列表2)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增， 將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用凝膠純化方法純化回收獲得rPA 基因片段。為方便后續(xù)操作，在上下游引物中分別引入了 BamHI和Xhol酶切位點(黑體小寫 部分)，同時為便于切割去除DsbC融合標(biāo)簽，在上游引物中同時引入了 Xa因子蛋白酶切位 點(黑體斜體部分)和甲酸蛋白切割位點(下劃線部分)的編碼DNA。經(jīng)過序列比較證實PCR擴(kuò)增得到的rPA編碼基因序列與已知的rPA基因序列完
5全一致，具體序列如下所示(序列表3)TCTTACCAAGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAAATACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCAGCTGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGCCTTCCCCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACCCATCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGCTGTGTGCTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCAGGGCGATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCATCAGCTGGGGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACCAAGGTTACCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCGTAA2、將rPA基因和pET40b質(zhì)粒(購買于Novagen公司)用BamHI和Xhol雙酶切 后，經(jīng)T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，在含有50 u g/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基平 板上，培養(yǎng)12h后挑取單克隆，提取質(zhì)粒用BamHI和Xhol雙酶切驗證，瓊脂糖凝膠電泳檢測 有1. lkb rPA目的片段的重組質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定正確后，命名為pET40b-rPA。在該重組質(zhì)粒 pET40b-rPA中，rPA被置于DsbC信號肽及其成熟肽下游，以同一讀碼框以融合蛋白形式表 達(dá)，且在DsbC與rPA間存在組氨酸標(biāo)簽(His Tag)以及凝血酶、甲酸及凝血因子Xa等蛋白 質(zhì)切割位點。(序列表:4，下劃線部分為rPA氨基酸序列)MKKGFMLFTLLAAFSGFAQADDAAIQQTLAKMGIKSSDIQPAPVAGMKTVLTNSGVLYITDDGKHIIQGPMYDVSGTAPVNVTNKMLLKQLNALEKEMIVYKAPQEKHVITVFTDITCGYCHKLHEQMADYNALGITVRYLAFPRQGLDSDAEKEMKAIWCAKDKNKAFDD
VMAGKSVAPASCDVDIADHYALGVQLGVSGTPAVVLSNGTLVPGYQPPKEMKEFLDEHQKMTSGKGSTSGSGHHHHHHSAGLVPRGSTAIGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKSPGFSSTMAISDPIEGRSYQGNSDCYFGNGSAYRGTHSLTESGASCLPffNSMILIGKVYTAQNPSAQALGLGKHNYCRNPDGDAKPffCHVLKNRRLTffEYCDVPSCSTCGLRQYSQPQFRIKGGLFADIASHPffQAAIFAKHRRSPGERFLCGGILISSCfflLSAAHCFQERFPPHHLTVILGRTYRVVPGEEEQKFEVEKYIVHKEFDDDTYDNDIALLQLKSDSSRCAQESSVVRTVCLPPADLQLPDffTECELSGYGKHEALSPFYSERLKEAHVRLYPSSRCTSQHLLNRTVTD匪LCACTITRSGGPQANLHDACQ⑶SGGPLVCLNDGRMTLVGIISffGLG
CGQKDVPGVYTKVTNYLDWIRD匪RP3、采用氯化鈣轉(zhuǎn)化法，將pET40b-rPA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞(天 津科技大學(xué)工業(yè)微生物教育部重點實驗室提供)，獲得rPA重組大腸桿菌。實驗同時轉(zhuǎn)化 pET40b空質(zhì)粒作為對照。4、實驗結(jié)果表明rPA原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建完全成功。實施例2rPA在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)1、將rPA重組大腸桿菌及轉(zhuǎn)化pET40b空質(zhì)粒的大腸桿菌分別接種到5mL含有終 濃度50 u g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C，220rpm培養(yǎng)過夜。2、將上一步驟中所得過夜培養(yǎng)物分別按的體積比轉(zhuǎn)接到200mL含有終濃 度為50 y g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至其0D600為0. 6時加入IPTG(異丙 基-0-D-硫代半乳糖苷)或乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。具體最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件IPTG為終濃度 0. 6mM于25°C誘導(dǎo)3h，乳糖為終濃度30mM于30°C誘導(dǎo)5h。3、誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，分別收集菌液，超聲破碎后于12000rpm離心后，分別對上清 及沉淀進(jìn)行SDS-PAGE檢測，見圖1。4、實驗結(jié)果表明rPA主要以可溶性成分表達(dá)，在上清中的可溶性目的蛋白的含 量占總蛋白量的40%左右。實施例3DsbC-rPA融合蛋白的分離純化1、利用pET_40b載體上帶有His-Tag，可采用Ni離子親和色譜法純化融合蛋白。 首先將鎳瓊脂糖凝膠FF裝柱，1. 6 X 20cm,柱床體積為10mL。2、用緩沖液 l(20mmol/L Tris-HCl pH7. 9,0. 5mol/L NaCl，10%甘油)以 2mL/min 平衡2-5個床體積后，將20ml細(xì)胞破碎液(50mM PBS, pH7. 4，0. 5M NaCl) 0. 45 u m濾膜過 濾，上樣，流速為lmL/min。3、用緩沖液1再洗2-5個床體積，流速為2mL/min。然后用分別含10、20、50、 100、200、300、400mM咪唑的緩沖液3進(jìn)行階段洗脫，流速為2mL/min，收集各階段洗脫峰， 用SDS-PAGE檢測融合蛋白的分子量大小和純度。結(jié)果表明融合蛋白DsbC-rPA主要被含 10mM咪唑緩沖液從鎳柱上洗脫下來，見圖2。4、對所獲得的DsbC-rPA目的蛋白質(zhì)，利用Xa因子(或甲酸、凝血酶)進(jìn)行處理以 去除DsbC融合標(biāo)簽，釋放rPA蛋白質(zhì)。以Xa因子為例，具體操作為先用BCA蛋白濃度測定 試劑盒對樣品進(jìn)行定量，然后按照1U Xa因子能夠有效裂解50 u g融合蛋白計算，于離心管 中混合Xa因子與純化后的融合蛋白，裂解緩沖液含有50mmol/L Tris-HCl,PH8. 0,0. lmol/ L NaCl,5mmol/L CaCl2。21°C孵育 16 小時，隨后取 20 ii L 進(jìn)行 Tricine-SDS-PAGE 電泳分 析鑒定。5、實驗結(jié)果表明DsbC_rPA經(jīng)Xa因子(或甲酸、凝血酶)處理后，能夠釋放出目 的蛋白rPA和DsbC標(biāo)簽蛋白質(zhì)。見圖3。實施例4重組蛋白質(zhì)溶栓活性檢測1、制備纖維蛋白平板稱取0. 02g纖維蛋白迅速加到裝有5mL PBS的小錐形瓶中，
7混勻后置于37°C預(yù)熱lOmin使其溶解。同時另取適量凝血酶放入裝有l(wèi)mL PBS的EP管，輕 吹一下，放入37°C預(yù)熱。2、稱取0. 07克瓊脂糖用7mL PBS溶解，加熱使溶解后，冷卻至適宜溫度。將凝血 酶溶液迅速混入纖維蛋白溶液中，立即混勻后加入至瓊脂糖溶液中搖勻后，將混合液倒入 平板中使其冷卻固化。3、用打孔器在事先準(zhǔn)備好的纖維蛋白平板上打孔，加入10yL待測樣品，37°C下 孵育12h，檢測溶栓圈大小。實驗同時檢測pET40b轉(zhuǎn)化大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物作為陰性 對照，檢測人組織型纖維蛋白溶解酶原激活劑tPA(中國藥品生物制品檢定所提供)及尿激 酶uPA(天津市藥品檢驗所提供)標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照。4、實驗結(jié)果表明經(jīng)鎳柱親和層析純化，用Xa因子(或甲酸、凝血酶)處理去除 DsbC標(biāo)簽后所獲得的獨立rPA目的蛋白具有顯著的溶栓活性。而且，DsbC-rPA融和蛋白在 無需進(jìn)行包涵體復(fù)性操作且在未切去DsbC標(biāo)簽的情況下，也可以表現(xiàn)出明顯的溶栓活性， 且二者與陽性對照品tPA和uPA相比，活性相當(dāng)。具體見圖4。
權(quán)利要求
一種無需包涵體復(fù)性、直接在大腸桿菌中高效表達(dá)瑞替普酶的方法，其特征在于包括如下的步驟(1)將rPA編碼基因插入到表達(dá)載體pET40b的多克隆位點，使其位于DsbC信號肽及其編碼基因下游，構(gòu)建得到pET40b rPA重組質(zhì)粒；(2)將pET40b rPA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，得到重組大腸桿菌；(3)培養(yǎng)該重組大腸桿菌，誘導(dǎo)表達(dá)；(4)收集菌液，超聲離心后，分別對上清及沉淀進(jìn)行SDS PAGE檢測；(5)分離純化得到目的融合蛋白DsbC rPA，或經(jīng)鎳柱親和層析純化，用Xa因子(或甲酸、凝血酶)處理，去除DsbC標(biāo)簽，得到高純度、高活性的rPA目的蛋白。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(1)中rPA基因片段與載體中的二硫鍵異構(gòu)酶 DsbC以融合蛋白形式表達(dá)，在DsbC的輔助作用下催化二硫鍵形成，無需進(jìn)行包涵體復(fù)性。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的培養(yǎng)該重組大腸桿菌的過程中需加入IPTG或乳 糖進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的IPTG終濃度為0.6mM于25°C誘導(dǎo)3h，乳糖終濃 度為30mM于30°C誘導(dǎo)5h。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中重組大腸桿菌pET40b-rPA的氨基酸序列如序列表4。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的融合標(biāo)簽DsbC和rPA間是通過凝血酶、Xa因子 及甲酸蛋白質(zhì)切割位點相連，融合蛋白DsbC-rPA利用Xa因子、甲酸或凝血酶處理后即可將 二者分離獲得獨立的rPA蛋白質(zhì)。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的rPA編碼基因克隆插入pET40b載體所用PCR引 物序列為上游引物5，-CGGggatccGATCGAAGGTCGTTCTTACCAAGGAAACAGTG-3'；下游引物5，-GGGctcgagATTACGGTCGCATGTTGTCACGAATCCAG-3，。其中在上下游引物中分別引入BamHI和Xhol酶切位點；同時在上游引物中同時引入 Xa因子蛋白酶切位點和甲酸蛋白切割位點的編碼DNA。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種無需包涵體復(fù)性、直接通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)制備溶栓藥物瑞替普酶(Reteplase，rPA)的方法。通過PCR擴(kuò)增得到rPA的基因片斷，將該基因片斷克隆到載體pET40b中，構(gòu)建得到pET40b-rPA重組質(zhì)粒，且使rPA與載體pET40b中的二硫鍵異構(gòu)酶DsbC融合表達(dá)。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，分別優(yōu)化確立了IPTG及乳糖的誘導(dǎo)表達(dá)條件。所獲得目的融合蛋白主要以可溶性成分表達(dá)，經(jīng)鎳柱親和層析純化后，用Xa因子(或甲酸、凝血酶)處理可獲得高純度的rPA目的蛋白。纖維蛋白平板法檢測結(jié)果顯示本方法所獲得的融合蛋白DsbC-rPA及去除標(biāo)簽純化所得rPA蛋白均具有顯著的溶栓活性。
文檔編號C12N15/70GK101892253SQ20101021283
公開日2010年11月24日 申請日期2010年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月30日
發(fā)明者姜勇, 張同存, 王楠, 田文靜, 羅學(xué)剛, 路福平 申請人:天津科技大學(xué)