本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種基于磷酸鈣-PEG的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法。

背景技術(shù)：

磷酸鈣法轉(zhuǎn)染法是實(shí)驗(yàn)室廣泛使用一種轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法。DNA與磷酸鈣形成復(fù)合物，粘附到細(xì)胞表面，通過細(xì)胞內(nèi)吞作用將DNA攝入細(xì)胞內(nèi)。它具有方便，廉價(jià)，細(xì)胞毒性小等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)也存在明顯局限性。磷酸鈣轉(zhuǎn)染法操作時(shí)受到多種因素的影響，使得轉(zhuǎn)染效率非常不穩(wěn)定，不同的實(shí)驗(yàn)室選擇用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法時(shí)通常需要花很大精力優(yōu)化轉(zhuǎn)染體系，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)在醫(yī)藥化工領(lǐng)域廣泛使用一種輔料，在實(shí)驗(yàn)中常用于做細(xì)胞融合，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染。4％-6％的PEG溶液能促進(jìn)微粒之間的聚合，增強(qiáng)微粒的穩(wěn)定性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種基于磷酸鈣-PEG的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法。本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，使用PEG能夠增強(qiáng)DNA-磷酸鈣復(fù)合物形成的穩(wěn)定性，提高磷酸鈣轉(zhuǎn)染法的轉(zhuǎn)染效率。

本發(fā)明的第一方面提供了一種基于磷酸鈣-PEG的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法，所述方法包括步驟：

(1)配制PEG-DNA溶液

在1ml 2％-6％(w/v)的PEG溶液中加入5-15μg質(zhì)粒DNA(待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒)，混勻制得PEG-DNA溶液；

(2)PEG-DNA氯化鈣溶液配制

1ml PEG-DNA溶液中加入40-80μl 2M CaCl₂溶液，配制成PEG-DNA氯化鈣溶液。

(3)PEG‐磷酸鈣轉(zhuǎn)染復(fù)合物配制

在離心管中加入1ml 2×HBS溶液，逐滴加入所述PEG-DNA氯化鈣溶液，配制成PEG-磷酸鈣轉(zhuǎn)染復(fù)合物；

(4)細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入細(xì)胞培養(yǎng)物中，轉(zhuǎn)染復(fù)合物與培養(yǎng)基體積為1:5-15，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

優(yōu)選的，步驟(1)中，PEG溶液的濃度(w/v)為3％-4％。

優(yōu)選的，步驟(1)中，加入10μg質(zhì)粒DNA。

優(yōu)選的，步驟(2)中，加入60μl 2M CaCl₂溶液。

優(yōu)選的，步驟(3)中，HBS溶液和PEG-DNA氯化鈣溶液的體積比為1-3:3-1。

優(yōu)選的，步驟(4)中，轉(zhuǎn)染復(fù)合物與培養(yǎng)基比率為1:10。

本發(fā)明的基于磷酸鈣-PEG的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法，具有極高的轉(zhuǎn)染效率，而且轉(zhuǎn)染穩(wěn)定性良好。

應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

圖1顯示了PEG濃度對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響，n＝5。

圖2顯示了PEG-磷酸鈣不同批次實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染穩(wěn)定性。

圖3顯示了PEG-磷酸鈣轉(zhuǎn)染復(fù)合物室溫放置不同時(shí)間后的轉(zhuǎn)染效率。

圖4顯示了不同培養(yǎng)器皿對(duì)PEG-磷酸鈣轉(zhuǎn)染復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率的影響。

圖5顯示了PEG-磷酸鈣轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染效率。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步陳述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明詳細(xì)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如美國(guó)Sambrook.J等著《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》(黃培堂等譯，北京：科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建 議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。以下實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料和試劑如無特別說明均可從市售渠道獲得。

實(shí)施例1

1.主要實(shí)驗(yàn)材料

2M CaCl₂溶液：稱取23.96g無水氯化鈣，加入80ml超純水溶解，冷卻到室溫，定容至100ml，0.22μm濾膜過濾后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2×HBS溶液：稱取NaCl 16.3g,KCl 0.74g,Na₂HPO₄0.214g，Glucose 2.4g，HEPES 10g,加入900ml超純水溶解，調(diào)整pH值至7.05，定容至1000ml，0.22μm濾膜過濾后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

12％PEG溶液：稱取12g PEG4000，加入80ml超純水溶解，定容至100ml，0.22μm濾膜過濾后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒DNA：pEGFP‐N1(4.7kb),pcDNA3.1‐EGFP(6.1kb),pLVX‐ZsGreen1‐C1(8.7kb)，均可購(gòu)自上海麒盟生物科技有限公司。

轉(zhuǎn)染細(xì)胞系：293T細(xì)胞，可購(gòu)自上海麒盟生物科技有限公司。

2.PEG‐磷酸鈣轉(zhuǎn)染復(fù)合物配制

2.1 PEG-DNA溶液配制

將12％PEG溶液用無菌水稀釋至所需濃度，1ml PEG溶液中加入10μg質(zhì)粒DNA，混勻。

不同濃度PEG溶液配制見表1

表1不同濃度PEG配制

2.2 PEG‐DNA氯化鈣溶液配制

1ml PEG-DNA溶液加入60μl 2M CaCl₂溶液，配制成PEG-DNA氯化鈣溶液。

2.3 PEG‐磷酸鈣轉(zhuǎn)染復(fù)合物配制

在15ml離心管中加入1ml 2×HBS溶液，離心管置于渦旋振蕩器上，用1ml移液器逐滴加入PEG‐DNA氯化鈣溶液，配制成PEG‐磷酸鈣轉(zhuǎn)染復(fù)合物。

2.4轉(zhuǎn)染細(xì)胞

將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入細(xì)胞培養(yǎng)物中，轉(zhuǎn)染復(fù)合物與培養(yǎng)基比率為1:10?；靹蚝蠓湃肱囵B(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。不同培養(yǎng)板(瓶)中加入的轉(zhuǎn)染復(fù)合物參考表2。

表2不同培養(yǎng)皿(瓶)加入轉(zhuǎn)染復(fù)合物參考值

3.檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率

轉(zhuǎn)染24后用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1不同濃度PEG對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響

PEG濃度的從1％增加到4％轉(zhuǎn)染效率有顯著提升，轉(zhuǎn)染效率提高了20％以上，PEG濃度從4％增加到6％對(duì)轉(zhuǎn)染效率基本沒有影響。

4.2 PEG-磷酸鈣轉(zhuǎn)染復(fù)合物轉(zhuǎn)染穩(wěn)定性檢測(cè)

4.2.1不同批次配制試劑穩(wěn)定性檢測(cè)

在不同時(shí)間配制2M CaCl₂溶液和2×HBS溶液，12％PEG溶液，在不同時(shí)間內(nèi)做轉(zhuǎn)染，檢測(cè)PEG-磷酸鈣轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定性。磷酸鈣轉(zhuǎn)染法在不同批次實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)染率在40％～90％，轉(zhuǎn)染穩(wěn)定性不好。在含有4％PEG的PEG-磷酸鈣轉(zhuǎn)染復(fù)合物轉(zhuǎn)染穩(wěn)定性有明顯提升，轉(zhuǎn)染效率在6重復(fù)實(shí)驗(yàn)中都沒有低于80％。

4.2.2轉(zhuǎn)染復(fù)合物時(shí)間穩(wěn)定性

轉(zhuǎn)染復(fù)合物配制完成后，在室溫條件下放置不同時(shí)間，檢測(cè)轉(zhuǎn)染復(fù)合物的時(shí)間穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PEG-磷酸鈣轉(zhuǎn)染復(fù)合物能在室溫放置1h，對(duì)轉(zhuǎn)染效率沒有影響。

4.3不同培養(yǎng)器皿的影響

實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PEG-磷酸鈣轉(zhuǎn)染復(fù)合物在不同細(xì)胞培養(yǎng)器皿中對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響，結(jié)果顯示，對(duì)于常用幾種型號(hào)的培養(yǎng)器皿，PEG-磷酸鈣轉(zhuǎn)染復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率沒有顯著差異。

4.4不同質(zhì)粒對(duì)轉(zhuǎn)染的影響

實(shí)驗(yàn)檢測(cè)幾種不同大小質(zhì)粒DNA使用PEG-磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法，結(jié)果顯示，質(zhì)粒DNA的大小對(duì)于PEG-磷酸鈣轉(zhuǎn)染復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率沒有影響。

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。