專利名稱：轉(zhuǎn)染劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及傳遞治療劑或其它試劑至細(xì)胞的新型化合物、組合物和方法?；颉⒍嚯?、蛋白質(zhì)和其它分子是可使用本發(fā)明化合物和方法傳遞的試劑。細(xì)胞可單獨(dú)存在或作為生物組織或器官存在。
背景技術(shù)：
將化合物傳遞入細(xì)胞是許多診斷和治療過程的第一關(guān)鍵步驟。例如，基因療法非常有希望用于需要傳遞核苷酸至細(xì)胞的治療和其它應(yīng)用。例如，已制定了基于基因轉(zhuǎn)染方法的治療新生物的各種方法。已制定了方法，以在產(chǎn)生腫瘤性轉(zhuǎn)化和進(jìn)展的確定基因座校正特異性損傷(Spandidos等，Anticancer Res.101543-1554(1990)；Banerjee等，Cancer Res.526297-6304(1992))。使用抑制轉(zhuǎn)化基因或基因產(chǎn)物的技術(shù)可解決顯性癌基因過度表達(dá)的問題。使用重建野生型腫瘤抑制基因功能的方法可解決腫瘤抑制基因喪失的問題(Goodrich等，CancerRes.521968-1973(1992))。除這些達(dá)到突變補(bǔ)償?shù)姆椒ㄍ?，還開發(fā)了特異性和選擇性殺死腫瘤細(xì)胞的基因技術(shù)。這些分子化療方法基于瘤性細(xì)胞中毒性基因的特異性表達(dá)(Abe等，Proc Soc Exp Biol Med.203354-359(1993))。最后，已使用基因轉(zhuǎn)染方法獲得抗腫瘤免疫作用。這些遺傳免疫增強(qiáng)的方法使用遺傳免疫調(diào)節(jié)技術(shù)提高腫瘤的免疫識別。因此，已開發(fā)了許多方法實(shí)現(xiàn)癌癥的基因療法。
就膀胱癌而論，在腫瘤抑制基因如p53和RB中觀察到突變的高發(fā)生率(Fujimoto等，Cancer Res.521393-1398(1992)；Cairns等，Oncogene 62305-2309(1991))。對于這種腫瘤抑制基因的遺傳損傷，可用相應(yīng)的野生型腫瘤抑制基因的代替來證明腫瘤性表型的回復(fù)(Spandidos，同前；Banerjee，同前)。
膀胱癌是發(fā)病率和死亡率的重要來源。在癌癥相關(guān)死亡率中，膀胱癌列第10位(男性)和第12位(女性)(Cancer Facts and Figures，Amer.Can.Soc.511(1995))?，F(xiàn)有治療膀胱癌的療法包括輔助化療或免疫療法、淺表性疾病的經(jīng)尿道切除術(shù)、替代膀胱切除術(shù)或常與全身性化療聯(lián)用的放射療法。雖然有這些治療方法，整體存活率沒有明顯變化(同前)。因此，必須開發(fā)新型的治療方案用于治療膀胱癌。
已開發(fā)基因治療方案作為可選擇的治療方法(例如，見Brewster等，Eur Urol25177-182(1994)；Takahashi等，Proc Natl Acad Sci USA 885257-5261(1991)；Rosenberg，SA，J Clin Oncol.10180-199(1992))。在人或其它動(dòng)物中成功治療癌癥或其它疾病依賴于足量的治療劑進(jìn)入細(xì)胞，還依賴于足夠大比例的靶細(xì)胞攝取治療劑。
許多其它治療劑或其它調(diào)節(jié)劑是多肽，例如小分子多肽。并且，到達(dá)靶細(xì)胞群的試劑的量可對治療效力有很大影響。因此，需要化合物及可提高傳遞至細(xì)胞或細(xì)胞群的試劑的量的方法。本發(fā)明滿足這些和其它需要。
發(fā)明概述本發(fā)明提供可提高試劑傳遞至細(xì)胞的化合物、組合物和方法。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供通式I的傳遞增強(qiáng)化合物 其中，R1和R2各獨(dú)立地選自氫和羥基；m和n各獨(dú)立地選自約0-2；R3選自-NR4R5，其中，R4和R5各獨(dú)立地選自氫、糖殘基、任選取代的烷基、任選取代的?；?、任選取代的酰氧基和季銨鹽-NR6R7R8X，其中，R6、R7和R8獨(dú)立地選自氫和C1-C4烷基，X是選自鹵素和任選取代的羧酸根的帶負(fù)電荷的離子結(jié)合的抗衡離子。還提供了通過給予含通式I的傳遞增強(qiáng)化合物的制劑，傳遞試劑至細(xì)胞的方法。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，通式I的傳遞增強(qiáng)化合物具有通式II 在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供傳遞試劑至細(xì)胞的組合物。組合物包含待傳遞的試劑和通式I的傳遞增強(qiáng)化合物。
本發(fā)明的另一方面是治療癌癥，包括膀胱癌的方法，通過給予細(xì)胞治療有效量的配制在含通式I的化合物的緩沖劑中的治療劑。
閱讀下面的詳細(xì)描述和附圖，這些或其它目的、方面和優(yōu)點(diǎn)將更顯而易見。
附圖簡要說明

圖1表示用于合成通式I的化合物的某些中間體化合物的合成。
圖2表示糖殘基連接于中間體，形成本發(fā)明化合物。
圖3表示用于合成通式I的化合物的某些中間體化合物的合成。
圖4表示膽酸殘基連接于中間體，形成本發(fā)明化合物。
圖5表示用ELISA測定法(PBL)測定組織勻漿中存在的IFNα2β的量。用Bradford蛋白測定法測定蛋白濃度。組織中存在的IFN的水平以pgIFN/mg組織表示。
圖6表示使用ELISA測定法測定(PBL)測定組織勻漿中存在的IFNα2b的量。
發(fā)明詳述I.定義如本文所用，術(shù)語”烷基”表示支鏈、直鏈、或環(huán)狀烴取代基或它們的組合，其可是全飽和、單或多不飽和，可包括二價(jià)和多價(jià)取代基，具有指定的碳原子數(shù)目(即C1-C10指1-10個(gè)碳)。飽和烴取代基的例子包括但不限于，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、異丁基、叔丁基、十八烷基、2-甲基戊基、環(huán)己基、(環(huán)己基)甲基、環(huán)戊基甲基。取代基可任選地被一個(gè)或多個(gè)通常連接于這鏈的官能團(tuán)取代，例如羥基、溴、氟、氯、碘、巰基、硫代、氰基、烷硫基、芳基、雜芳基、羧基、硝基、氨基、烷氧基、酰氨基等，形成烷基取代基如羧甲基、三氟甲基、3-羥己基、2-羧丙基等。不飽和烷基取代基是具有一或多個(gè)雙鍵或三鍵的基團(tuán)。不飽和烷基的例子包括但不限于，乙烯基、2-丙烯基、2-丁烯基、2-異戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基和高級同系物和異構(gòu)體。取代基可被一個(gè)或多個(gè)通常連接于這種鏈的官能團(tuán)取代，如對飽和的烴中所述。
術(shù)語“芳基”表示稠合在一起或共價(jià)連接的單環(huán)或多環(huán)(至多三環(huán))的多不飽和、通常芳族、烴取代基。術(shù)語“雜芳基”是指含有0-4個(gè)選自N、O和S的雜原子的芳基(或環(huán))，其中，氮和硫原子任選地被氧化，氮原子任選地被季銨化。雜芳基可通過雜原子連接于分子的剩余部分。芳基和雜芳基的非限制性例子包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-聯(lián)苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-異噁唑基、4-異噁唑基、5-異噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-異喹啉基、5-異喹啉基、2-喹唑啉基、5-喹唑啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。上述芳基和雜芳基環(huán)系統(tǒng)可進(jìn)一步被一個(gè)或多個(gè)通常連接于這種環(huán)系統(tǒng)的官能團(tuán)取代，例如羥基、溴、氟、氯、碘、巰基、硫代、氰基、烷硫基、羧基、硝基、氨基、烷氧基或酰氨基。
術(shù)語“酰基”表示-C(O)R-取代基，其中，R是如上所述的烷基或芳基，例如但不限于苯酰基、琥珀?；⒁阴；?、丙酰基或丁?；?br> 術(shù)語“羥基”表示取代基-OH-。
術(shù)語“烷氧基”表示取代基-OR-，其中R是烷基。
術(shù)語“氨基”表示胺鍵(-NRR′)，其中R和R′獨(dú)立地是氫取代基、烷基取代基或芳基取代基。
術(shù)語“羧酸酯”表示取代基-OC(O)R-，其中R是任選取代的烷基或芳基。
術(shù)語“酰氧基”表示取代基-(CRR′)mC(O)OR″-，其中R和R′獨(dú)立地選自烷基取代基、芳基取代基或氫取代基，R″是氫或烷基取代基，m是1-8之間的整數(shù)，包括1和8。
術(shù)語“鹵素”或“鹵原子”是指取代基F、Cl、Br或I。
術(shù)語“糖殘基”是指單糖取代基，它包含多于一個(gè)以同型寡糖取代基(含一種類型單糖的寡糖)或異型寡糖取代基(含多于一種類型單糖的寡糖)連接的單糖取代基。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，同型和異型寡糖取代基由2-10個(gè)單糖單元組成。單糖可包含戊糖或己糖殘基，殘基可作為環(huán)狀或非環(huán)狀(開鏈)形式存在。當(dāng)單糖呈開鏈形式時(shí)，除去氫(醛糖中)或羥甲基(酮糖中)，形成一個(gè)鍵用于連接。而且，羰基碳的氧原子可任選地被-RR′-替代，其中R和R′獨(dú)立地選自鍵、烷基、鹵素、羥基、氫、氨基取代基和烷氧基取代基。優(yōu)選寡糖包含戊糖-戊糖二糖基團(tuán)、己糖-己糖二糖基團(tuán)、戊糖-己糖二糖基團(tuán)和己糖-戊糖二糖基團(tuán)。單糖可選自核糖、阿拉伯糖、木糖和來蘇糖、阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖或塔羅糖，其中，單糖上一個(gè)或多個(gè)羥基可被氫、烷基取代基、烷氧基取代基、氨基取代基或?；〈〈?。
II.一般合成本發(fā)明提供提高試劑轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞，如上皮組織中存在的細(xì)胞的傳遞增強(qiáng)化合物和制劑。本發(fā)明化合物和制劑可增加試劑的量，例如可調(diào)節(jié)與例如增殖或疾病狀態(tài)相關(guān)的細(xì)胞過程的試劑，進(jìn)入細(xì)胞和/或增加組織或器官中攝取試劑的細(xì)胞比例。還提供了使用本發(fā)明傳遞增強(qiáng)化合物將試劑傳遞至細(xì)胞的方法。
一方面，本發(fā)明化合物可表示為通式I
其中，R1和R2各獨(dú)立地選自氫和羥基；m和n各獨(dú)立地選自約0-2；R3選自-NR4R5，其中，R4和R5各獨(dú)立地選自氫、糖殘基、任選取代的烷基、任選取代的?；⑷芜x取代的酰氧基和季銨鹽-NR6R7R8X，其中，R6、R7和R8獨(dú)立地選自氫和C1-C4烷基，X是選自鹵素和任選取代的羧酸根的帶負(fù)電荷的離子結(jié)合的抗衡離子。通式I的優(yōu)選化合物見表1。
在一個(gè)示例性的實(shí)施例中，可使用圖1和2所示的一般方法合成通式I的化合物。圖1和2表示本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例，因此只是一個(gè)例子而不限制權(quán)利要求的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白，可對圖1和2所示反應(yīng)流程進(jìn)行許多其它的變化、改變和改進(jìn)。參考圖1，在胺堿如三乙胺的存在下，膽酸2與氯甲酸酯反應(yīng)，形成混合的酐中間體。然后，該中間體與單保護(hù)三胺1反應(yīng)，產(chǎn)生膽酰胺化合物3。在鹽酸的酸性條件下，甲醇溶劑中處理膽酰胺3，脫去保護(hù)基團(tuán)，該實(shí)施例中是叔丁氧基羰基，產(chǎn)生伯胺4。圖2表示在還原胺化條件下，伯胺4和2當(dāng)量乳糖偶合，產(chǎn)生粗的殘留物4，該殘留物用硅膠柱色譜純化?；蛘撸瑘D1和2中未明確顯示，伯胺4可與烷基鹵如甲基碘或乙基碘烷基化，或與酸如鹽酸或醋酸質(zhì)子化，得到本發(fā)明季銨鹽。這種制備本發(fā)明化合物的方法代表本發(fā)明的某些實(shí)施方式。
在另一個(gè)示例性實(shí)施例中，可使用圖3和4所示一般方法合成通式I的化合物。圖3和4表示本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例，因此只是一個(gè)例子而不限制權(quán)利要求的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白，可對圖3和4所示反應(yīng)流程進(jìn)行許多其它的變化、改變和改進(jìn)。如圖3所示，使用如二環(huán)己基碳二亞胺作為偶聯(lián)劑，二糖酸6與三胺偶合，得到乳糖酸-二胺7。圖4表示在胺堿的存在下，用氯甲酸酯處理膽酸2時(shí)，形成膽酸的混合酐。使用膽酸的混合酐作為?；噭?，實(shí)現(xiàn)乳糖酸-二胺7的二?；?，得到粗品8，該粗品用二氯甲烷滴定純化。該制備本發(fā)明化合物的方法代表本發(fā)明的某些方面。
III.傳遞增強(qiáng)化合物本發(fā)明提供傳遞增強(qiáng)化合物，當(dāng)用感興趣的試劑制備時(shí)，可增強(qiáng)試劑傳遞至細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，細(xì)胞以組織或器官存在。如本文所用，傳遞增強(qiáng)化合物是指可增強(qiáng)試劑傳遞至細(xì)胞、組織或器官的化合物。優(yōu)選的化合物如表1所示。
雖然表1列舉了具有膽酸取代基的化合物，本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地理解，其它甾體取代基可代替膽酸而不損害化合物的傳遞增強(qiáng)性質(zhì)。雖然實(shí)施本發(fā)明不需要理解增強(qiáng)傳遞發(fā)生的機(jī)制，但應(yīng)注意增強(qiáng)傳遞可通過任何多種機(jī)制發(fā)生。一種機(jī)制可涉及，通過傳遞增強(qiáng)化合物分解組織或器官的上皮表面上保護(hù)性糖胺聚糖(GAG)層。尤其優(yōu)選的化合物是如下所示通式II和III的化合物。
本發(fā)明傳遞增強(qiáng)化合物和方法用于許多需要傳遞分子至細(xì)胞的應(yīng)用。例如，許多疾病狀態(tài)的診斷和/或治療常常需要試劑進(jìn)入涉及疾病進(jìn)程的細(xì)胞。另一個(gè)例子是使用重組DNA技術(shù)在細(xì)胞培養(yǎng)或重組有機(jī)體中產(chǎn)生感興趣的蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知許多其它將化合物導(dǎo)入細(xì)胞的例子。本發(fā)明化合物和方法由于增加感興趣的試劑傳遞至靶細(xì)胞或組織，可改善這些應(yīng)用的有效性。
給予細(xì)胞在含有傳遞增強(qiáng)化合物的制劑中的試劑，與沒有傳遞增強(qiáng)化合物的情況下給予時(shí)試劑傳遞至細(xì)胞的量相比，傳遞增強(qiáng)化合物可增加試劑傳遞至細(xì)胞的量。本文所用“增強(qiáng)傳遞”是指試劑進(jìn)入每個(gè)細(xì)胞的拷貝數(shù)增加或(例如)組織或器官中攝取試劑的細(xì)胞比例增加或兩者都增加。在優(yōu)選的實(shí)施例中，與沒有傳遞增強(qiáng)化合物的情況下給予時(shí)傳遞至細(xì)胞的試劑的量相比，傳遞增強(qiáng)化合物導(dǎo)致傳遞至細(xì)胞的試劑與細(xì)胞比例增加至少約20％，更優(yōu)選增加至少約50％，最優(yōu)選增加至少約100％。
可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法，測定特定化合物或制劑在增強(qiáng)試劑，例如治療劑或診斷劑傳遞至細(xì)胞中是否有效。例如，給予靶細(xì)胞的傳遞增強(qiáng)制劑中可含有檢測試劑。比較用傳遞增強(qiáng)制劑處理的細(xì)胞中存在的檢測試劑的量與用不含傳遞增強(qiáng)化合物的制劑處理的細(xì)胞中檢出的量。例如，當(dāng)感興趣的試劑是基因或包含基因的載體時(shí)，制劑中可含有其表達(dá)可容易地檢出的受體基因。當(dāng)調(diào)節(jié)劑是多肽時(shí)，可通過(例如)將標(biāo)記物連接于傳遞增強(qiáng)制劑中存在的多肽，并在給予制劑后檢測靶細(xì)胞中標(biāo)記物的存在和量，可測定傳遞增強(qiáng)化合物。相似地，當(dāng)除多肽和聚核苷酸外的分子用作調(diào)節(jié)劑時(shí)，可標(biāo)記分子并檢測進(jìn)入靶細(xì)胞群的標(biāo)記物的量。
可用于本發(fā)明傳遞增強(qiáng)化合物的糖基可是單糖或可包含多于一個(gè)以同型寡糖或異型寡糖連接的單糖。優(yōu)選的單糖包括戊糖和/或己糖殘基。例如，糖基可選自戊糖單糖基團(tuán)、己糖單糖基團(tuán)、戊糖-戊糖二糖基團(tuán)、己糖-己糖二糖基團(tuán)、戊糖-己糖二糖基團(tuán)和己糖-戊糖二糖基團(tuán)。
在一些實(shí)施例中，通式I的傳遞增強(qiáng)化合物以由三個(gè)或多個(gè)單糖組成的R3作為糖殘基。優(yōu)選地，糖基具有1-10個(gè)單糖，更優(yōu)選1-4個(gè)單糖，最優(yōu)選約2-3個(gè)單糖。使用例如三糖，可提供溶解性增加的化合物。
對于一些應(yīng)用，與其它化合物相比，需要使用具有增加的水溶性和/或傳遞增強(qiáng)活性的傳遞增強(qiáng)化合物。本發(fā)明提供這種化合物。例如，本發(fā)明提供通式I的化合物，其中，R3是陽離子基團(tuán)。合適的陽離子基團(tuán)包括，例如四甲基和銨部分，及其鹽。這種化合物的例子包括A-TMA和A-HCl，如表1所示。具有改善的溶解性和/或傳遞增強(qiáng)活性的其它化合物包括通式I化合物中的糖基或基團(tuán)是三糖或更長的糖的化合物。
在某些方面，本發(fā)明提供含有待傳遞至細(xì)胞的試劑和傳遞增強(qiáng)化合物的制劑。制劑中傳遞增強(qiáng)化合物的濃度取決于多種因素，如所使用的特定傳遞增強(qiáng)化合物、緩沖劑、pH、靶組織或器官及給予方式。傳遞增強(qiáng)化合物的濃度常常為1％至50％(v/v)，優(yōu)選10％至40％(v/v)和最優(yōu)選15％至30％(v/v)。優(yōu)選本發(fā)明制劑中本發(fā)明傳遞增強(qiáng)化合物的用量范圍約為0.002-2mg/ml，更優(yōu)選約0.02-2mg/ml，最優(yōu)選約0.1-1mg/ml。
通常在可溶解化合物的溶劑中配制本發(fā)明傳遞增強(qiáng)化合物，雖然僅部分溶解化合物的制劑也是合適的。磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)是對這些化合物合適的增溶劑的一個(gè)例子，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知其它例子。應(yīng)理解，對于各種藥物制劑，可需要某些其它賦形劑和添加劑，以達(dá)到這些試劑的溶解特性。例如，可加入適當(dāng)濃度的公知增溶劑如去污劑、脂肪酸酯、表面活性劑，以增強(qiáng)化合物溶解于所采用的各種溶劑中。若制劑包含去污劑時(shí)，合適的去污劑包括如上所述的那些，給予患者的制劑中去污劑的濃度優(yōu)選約為臨界膠束濃度(CMC)的0.5-2倍。
IV.調(diào)節(jié)劑本發(fā)明傳遞增強(qiáng)化合物可用于增強(qiáng)將調(diào)節(jié)劑，包括蛋白質(zhì)、抗體核苷酸、反義RNA、小分子等傳遞至細(xì)胞。例如，傳遞增強(qiáng)化合物可用于將試劑傳遞至任何組織或器官部分的細(xì)胞，包括那些具有上皮膜的細(xì)胞。
在適合傳遞的試劑中，傳遞增強(qiáng)化合物(如滲透增強(qiáng)化合物)是“調(diào)節(jié)劑”，如本文所用，是指可調(diào)節(jié)生物過程的試劑。這些過程包括，例如，細(xì)胞生長、分化、增殖(包括腫瘤性疾病如癌癥)、調(diào)節(jié)、代謝或生物合成途徑、基因表達(dá)等。調(diào)節(jié)劑還可影響，例如，免疫反應(yīng)(包括自身免疫疾病)、細(xì)菌或真菌病原體感染和任何其它可通過引入調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)的生物過程。
治療劑是可使用傳遞增強(qiáng)試劑傳遞的調(diào)節(jié)劑的一個(gè)例子。這種試劑可用于調(diào)節(jié)與疾病相關(guān)的細(xì)胞過程。本文所用術(shù)語“治療劑”包括但不限于，治療性蛋白、抗體、治療性基因、含治療性基因的載體(質(zhì)粒或病毒載體)、反義核酸或其它治療核酸序列(如三鏈體核酸)。就本發(fā)明的目的而言，術(shù)語“治療性基因”是指可引入細(xì)胞實(shí)現(xiàn)治療效果的核酸序列。治療性基因的例子包括但不限于，腫瘤抑制基因、自殺基團(tuán)、反義核酸分子、形成三鏈體的核酸分子、基因編碼細(xì)胞因子、基因編碼I型和II型干擾素如干擾素-α、干擾素-β、干擾素-δ和干擾素γ、基因編碼白介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7和IL-10)及集落刺激因子如GM-CSF。在一些情況下，治療劑可以天然存在或重組修飾病毒形式存在。除上述基因外，它們的治療性蛋白，即由基因編碼的蛋白和/或多肽也在本發(fā)明范圍內(nèi)。這些治療性蛋白的例子包括但不限于，細(xì)胞因子、I型和II型干擾素如干擾素-α、干擾素-β、干擾素-δ和干擾素γ、白介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7和IL-10)及集落刺激因子如GM-CSF。在其它情況下，抗體如上述蛋白的抗體是本發(fā)明調(diào)節(jié)劑。它們包括但不限于，I型和II型干擾素如抗干擾素-α、抗干擾素-β、抗干擾素-δ抗干擾素γ及抗白介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7和IL-10)的抗體。
在某些實(shí)施例中，干擾素多肽或抗體是I型或II型干擾素，包括通常稱為α干擾素、β干擾素、γ干擾素和ω干擾素(例如α-干擾素、β-干擾素、γ-干擾素和ω-干擾素)，以及它們的組合，包括α-干擾素的共有序列。在一些實(shí)施例中，α-干擾素是α1或α2-干擾素。在一些實(shí)施例中，蛋白是干擾素α-2b或抗干擾素α-2b。其它干擾素包括干擾素α-2β、融合干擾素α-/2α-1、干擾素α-2e、人α1或α2干擾素。
在一些實(shí)施例中，干擾素是雜交干擾素。含不同干擾素亞型序列(例如α和Δ、α和β及α和F)組合的雜交α-干擾素基因的結(jié)構(gòu)公開于美國專利4,414,150、4,456,748和4,678,751。美國專利4,695,623、4,897,471和5,831,062公開了具有氨基酸序列的新型人白細(xì)胞干擾素多肽，該氨基酸序列包括天然存在α干擾素亞型多肽中各位置的一般或主要氨基酸，稱為共有人白細(xì)胞干擾素。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，雜交干擾素是干擾素α2α1。
在一個(gè)實(shí)施例中，干擾素是干擾素α。例如，重組干擾素α已在大腸桿菌中克隆和表達(dá)(例如，Weissmann等，Science，2091343-1349(1980)；Sreuli等，Science，2091343-1347(1980)；Goeddel等，Nature，29020-26(1981)；Henco等，J.Mol.Biol.，185227-260(1985))。在一些實(shí)施例中，干擾素是人干擾素α。在一些實(shí)施例中，干擾素α是干擾素α2a或2b。
本文所用術(shù)語干擾素是指包括所有類型和亞型的干擾素和缺失、插入、或取代變體以及蛋白質(zhì)、多肽和抗體。在一個(gè)實(shí)施例中，干擾素基因/蛋白是干擾素α基因/蛋白。例如，重組干擾素α已由幾個(gè)小組在大腸桿菌中克隆和表達(dá)(例如，Weissmann等，Science，2091343-1349(1980)；Sreuli等，Science，2091343-1347(1980)；Goeddel等，Nature，29020-26(1981)；Henco等，J.Mol.Biol.，185227-260(1985))。在一些實(shí)施例中，系統(tǒng)的干擾素基因來源于人核苷酸或多肽序列。例如，人干擾素α是包括至少24個(gè)亞種的蛋白質(zhì)家族(Zoon，K.C.，干擾素，9∶1(1987)，Gresser，I.，編，Academic Press，NY)。干擾素α最先描述為能夠誘導(dǎo)細(xì)胞中的抗病毒狀態(tài)，現(xiàn)稱為多效淋巴因子的試劑，影響許多免疫系統(tǒng)的功能(Openakker等，Experimentia，45513(1989))。在一些實(shí)施例中，干擾素α是干擾素α2a或2b(例如，參見WO 91/18927)，雖然可使用任何干擾素α。
干擾素IFN-α(即α干擾素或干擾素α)基因、蛋白或抗體的藥物組合物具有許多治療適應(yīng)癥，包括毛細(xì)胞白血病、卡波西肉瘤、腎細(xì)胞癌、非何杰金氏淋巴瘤、T細(xì)胞白血病、多發(fā)性和慢性髓細(xì)胞源性白血病、惡性黑色素瘤、膀胱細(xì)胞癌、結(jié)腸癌(用5-FU)、尖銳濕疣、鼻病毒及乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)導(dǎo)致的多種形式的慢性病毒性肝炎、非甲型非乙型肝炎病毒(NANB)、或δ肝炎病毒(HDV)感染(Pestka，AIDS Research & Human Retroviruses，8(5)776-786(1992))。在患有骨髓增生病的患者中，還發(fā)現(xiàn)IFN-α可高度有效地抗巨核細(xì)胞生成和控制血小板增多(Talpaz等，Annals Int.Med.，99789-792(1983)；Gisslinger等，Lancet，1634-637(1989)；Ganser等，Blood，701173-1179(1987))。
在一些實(shí)施例中，本發(fā)明組合物包含在含傳遞增強(qiáng)化合物的緩沖劑中的“治療有效”量的治療劑。本文所用“治療有效”是指防止、降低或治療與疾病狀態(tài)相關(guān)的癥狀。
傳遞增強(qiáng)試劑和含這種試劑的制劑也可用于促進(jìn)感興趣的基因、蛋白或抗體傳遞至細(xì)胞，尤其是器官和組織的細(xì)胞。這些基因可編碼(例如)商業(yè)目的的蛋白質(zhì)。例如，可使用試劑和制劑將編碼營養(yǎng)學(xué)上重要的蛋白質(zhì)基因傳遞至哺乳動(dòng)物的乳房組織，所述蛋白質(zhì)然后分泌在哺乳動(dòng)物產(chǎn)生的奶中。這種試劑和制劑的其它應(yīng)用對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
傳遞增強(qiáng)試劑和含這種試劑的制劑還可用于將診斷劑傳遞至細(xì)胞、器官和組織。診斷劑的例子包括編碼在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)可容易地被檢出的蛋白的標(biāo)記基因(包括但不限于，β-半乳糖苷酶、綠色熒光蛋白、螢光素酶等)以及標(biāo)記的核酸探針(例如放射標(biāo)記探針)。
V.基因傳遞載體在待傳遞至細(xì)胞的試劑是基因的情況下，可將基因摻入載體中。用于該目的載體的例子包括能夠在靶細(xì)胞中介導(dǎo)感興趣的基因表達(dá)的表達(dá)質(zhì)粒。在其它情況下，載體是病毒載體系統(tǒng)，其中，將感興趣的基因摻入能夠轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞的病毒基因組中。設(shè)計(jì)在靶細(xì)胞中表達(dá)感興趣的基因時(shí)，可將基因連接于能在感興趣的靶宿主細(xì)胞中介導(dǎo)基因表達(dá)的表達(dá)和控制序列。因此，在合適的條件下，可實(shí)現(xiàn)基因在靶細(xì)胞中的表達(dá)。
可用于實(shí)踐本發(fā)明的病毒載體系統(tǒng)包括，例如，天然存在或重組病毒載體系統(tǒng)。根據(jù)特定應(yīng)用，合適的病毒載體包括有復(fù)制活力、復(fù)制缺損和條件復(fù)制的病毒載體。例如，病毒載體可來源于人或牛腺病毒、痘病毒、皰疹病毒、腺相關(guān)病毒、小鼠微小病毒(MVM)、HIV、辛德比斯病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒(包括但不限于Rous肉瘤病毒)和MoMLV的基因組。典型地，感興趣的基因插入這種載體中，一般用伴隨的病毒DNA包裝基因構(gòu)建物，感染敏感宿主細(xì)胞并表達(dá)感興趣的基因。優(yōu)選的重組病毒載體是蛋白IX基因缺失的腺病毒載體傳遞系統(tǒng)(見國際專利申請WO 95/11984，其內(nèi)容參考包括在此)。
本文所用“重組”是指核酸和核酸編碼的蛋白，其中，通過重組DNA技術(shù)、也稱為“基因工程”方法構(gòu)建核酸。
根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)容，給予配制在含傳遞增強(qiáng)試劑的緩沖劑中的、重組病毒載體傳遞系統(tǒng)中的治療有效量的含調(diào)節(jié)劑，如p53基因或視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤抑制基因的藥物組合物。例如，配制在含傳遞增強(qiáng)試劑的緩沖劑中的、在重組腺病毒載體傳遞系統(tǒng)中的治療有效量的治療性基因的范圍約為1×108顆粒/毫升-1×1012顆粒/毫升，更典型地約為1×108顆粒/毫升-5×1011顆粒/毫升，最典型地1×109顆粒/毫升-1×1011顆粒/毫升(PN/毫升)。
VI.基因傳遞系統(tǒng)如本文所用，“基因傳遞系統(tǒng)”是指將試劑傳遞至靶細(xì)胞的任何方法。試劑與基因傳遞系統(tǒng)結(jié)合，然后使用含傳遞增強(qiáng)化合物的制劑將其傳遞至細(xì)胞。
在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，通過合適的連接部分，如DNA連接部分(Wu等，J.Biol.Chem.26314621-14624(1988)；WO 92/06180)，將基因構(gòu)建物或其它試劑偶聯(lián)于細(xì)胞受體配基，以增強(qiáng)攝取(例如有被小窩的內(nèi)陷和內(nèi)涵體的內(nèi)化)。例如，可通過聚賴氨酸部分將基因構(gòu)建物連接于脫唾液酸血清類粘蛋白，脫唾液酸血清類粘蛋白是肝細(xì)胞的唾液酸糖蛋白受體的配基。
相似地，可通過加入受體配基或受體特異性抗體調(diào)節(jié)用于包裝基因構(gòu)建物的病毒被膜，允許受體介導(dǎo)的胞吞進(jìn)入特定細(xì)胞(見，例如WO 93/20221、WO93/14188、WO 94/06923)。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明DNA構(gòu)建物連接至病毒蛋白如腺病毒顆粒，以增強(qiáng)胞吞作用(Curiel等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.4.888850-8854(1991))。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明分子偶聯(lián)物可包括微管抑制劑(WO/9406922)；模擬流感病毒血凝素的合成肽(Plank等，J.Biol.Chem.26912918-12924(1994))；和核定位信號如SV40T抗原(W093/19768)。
在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，調(diào)節(jié)劑是反義核酸。該反義核苷酸可作為反義寡核苷酸提供(見，例如，Murayama等，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.7109-114(1997))。還提供了編碼反義核酸的基因；這種基因可與傳遞增強(qiáng)化合物配制并用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知方法引入細(xì)胞。例如，可引入在病毒載體中編碼反義核酸的基因，例如，在乙型肝炎病毒中(見，例如，Ji等，J Viral Hepat.4167-173(1997))；在腺相關(guān)病毒中(見，例如，Xiao等，Brain Res.75676-83(1997))；或在其它系統(tǒng)中，包括但不限于HVJ(仙臺(tái)病毒)-脂質(zhì)體基因傳遞系統(tǒng)(見，例如，Kaneda等，Ann.N.Y.Acad.Sci.811299-308(1997))；“肽載體”(見，例如，Vidal等，CR Acad.Sci III 32279-287(1997))；作為游離型載體或質(zhì)粒載體中的基因(見，例如，Cooper等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.946450-6455(1997)，Yew等Hum Gene Ther.8575-584(1997))；作為肽-DNA聚集體中的基因(見，例如，Niidome等，J.Biol.Chem.27215307-15312(1997))；作為“裸DNA”(見，例如，U.S.5,580,859和U.S.5,589,466)；在脂質(zhì)載體系統(tǒng)中(見，例如，Lee等，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.14173-206(1997))；聚合物包裹脂質(zhì)體(Marin等，1993年5月25日提交的美國專利5,213,804；Woodle等，1991年5月7日提交的美國專利5,013,556)；陽離子脂質(zhì)體(Epand等，1994年2月1日提交的美國專利5,283,185；Jessee，J.A.，1996年11月26日提交的美國專利5,578,475；Rose等，1994年1月18日提交的美國專利5,279,833；Gebeyehu等，1994年8月2日提交的美國專利5,334,761)；氣體填充微球(Unger等，1996年8月6日提交的美國專利5,542,935)，配基靶向包封的大分子(Low等，1992年4月28日提交的美國專利5,108,921；Curiel等，1996年5月28日提交的美國專利5,521,291；Groman等，1996年9月10日提交的美國專利5,554,386；Wu等，1992年11月24日提交的美國專利5,166,320)。
VII.蛋白傳遞系統(tǒng)如本文所用，“蛋白傳遞系統(tǒng)”是指將試劑傳遞至靶細(xì)胞的任何方法。試劑與蛋白傳遞系統(tǒng)結(jié)合，然后使用含傳遞增強(qiáng)化合物的制劑將其傳遞至細(xì)胞。
蛋白和傳遞增強(qiáng)化合物可以同時(shí)的方式，或組合的方式傳遞，組合傳遞中，先給予蛋白，再給予傳遞增強(qiáng)試劑，以及先給予傳遞增強(qiáng)試劑，再給予蛋白。
各種系統(tǒng)包括，例如脂質(zhì)體傳遞系統(tǒng)、直接注射或接觸、聚合物包裹脂質(zhì)體、陽離子脂質(zhì)體、氣體填充微球、配基-靶向包封的大分子、貼劑和其它常規(guī)蛋白傳遞平臺(tái)。
VIII.藥物制劑當(dāng)用作藥用時(shí)，本發(fā)明制劑包含含有傳遞增強(qiáng)化合物的緩沖劑。緩沖液可是任何藥學(xué)上可接受的緩沖液，例如磷酸鹽緩沖鹽水或磷酸鈉/硫酸鈉、Tris緩沖液、甘氨酸緩沖液、無菌水及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它緩沖液，例如Good等，(1966)Biochemistry 5467中所述。在包含于腺病毒載體傳遞系統(tǒng)中的含有調(diào)節(jié)基因的藥物組合物中，緩沖液的pH(例如)通常為6.4-8.4，優(yōu)選7-7.5，最優(yōu)選7.2-7.4。
本發(fā)明組合物還可包含穩(wěn)定劑、增強(qiáng)劑或其它藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。藥學(xué)上可接受的載體可含有生理學(xué)上可接受的化合物，例如，以穩(wěn)定含腫瘤抑制基因的重組腺病毒載體傳遞系統(tǒng)。生理學(xué)上可接受的化合物可包括，例如，糖類，如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖，抗氧劑，如抗壞血酸或谷胱甘肽，螯合劑，低分子量蛋白質(zhì)或其它穩(wěn)定劑或賦形劑。其它生理學(xué)上可接受的化合物包括潤濕劑、乳化劑、分散劑或防腐劑，特別用于防止微生物的生長或作用。眾所周知的各種防腐劑包括，例如，苯酚和抗壞血酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白，藥學(xué)上可接受的載體的選擇取決于給藥途徑和重組腺病毒載體傳遞系統(tǒng)及其所含的特定腫瘤抑制基因的特定生理-化學(xué)性質(zhì)。載體、穩(wěn)定劑和輔料的例子參見Martin，Remington′sPharm.Sci.，第15版(Mack Publ.Co.，Easton，PA 1975)，其內(nèi)容參考包括在此。
IX.制劑的給予在一些實(shí)施例中，傳遞增強(qiáng)化合物包含在含調(diào)節(jié)基因的緩沖液中?？稍谡{(diào)節(jié)劑前或伴隨調(diào)節(jié)劑，給予傳遞增強(qiáng)化合物。在一些實(shí)施例中，正好在給予患者前通過將調(diào)節(jié)劑制劑與傳遞增強(qiáng)化合物制劑混合，提供傳遞增強(qiáng)化合物和調(diào)節(jié)劑。在其它實(shí)施例中，傳遞增強(qiáng)化合物和調(diào)節(jié)劑以單一制劑中給予。
對于包含在重組腺病毒傳遞系統(tǒng)中的含腫瘤抑制基因的藥物組合物，該重組腺病毒傳遞系統(tǒng)配制在還含有傳遞增強(qiáng)劑的緩沖液中，可在約5分鐘-3小時(shí)，優(yōu)選約10分鐘-120分鐘，最優(yōu)選約15分鐘-90分鐘的時(shí)間內(nèi)給予藥物組合物。在另一個(gè)實(shí)施例中，可在給予含腫瘤抑制基因的重組腺病毒載體傳遞系統(tǒng)之前給予傳遞增強(qiáng)劑?？稍诮o予含腫瘤抑制基因的腺病毒載體傳遞系統(tǒng)前約30秒-1小時(shí)，優(yōu)選約1分鐘-10分鐘，最優(yōu)選約1分鐘-5分鐘給予傳遞增強(qiáng)劑。
使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何傳遞方法，例如瘤內(nèi)或膀胱內(nèi)施用，可將配制在含傳遞增強(qiáng)劑的緩沖液中的調(diào)節(jié)劑傳遞至任何組織或器官，包括新生組織如癌組織。組織和器官包括具有上皮膜的任何組織或器官，如胃腸道、膀胱、呼吸道和肺。例子包括但不限于，膀胱和上呼吸道癌、陰門癌、子宮頸癌、陰道癌或支氣管癌；腹膜局部轉(zhuǎn)移性腫瘤；支氣管肺泡癌；胸膜轉(zhuǎn)移癌；口腔和扁桃體癌；鼻咽癌、鼻癌、喉癌、食管癌、胃癌、結(jié)腸癌和直腸癌、膽囊癌或皮膚癌；或黑色素瘤。
在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，治療劑配制在粘膜、局部和/或含服制劑中。尤其是粘膜粘附凝膠和局部凝膠制劑。用于經(jīng)皮傳遞的滲透增強(qiáng)組合物、聚合物基質(zhì)和粘膜粘附凝膠制劑的例子公開于美國專利5,346,701。這種制劑尤其適用于治療口腔癌癥、頭和頸癌癥(例如，支氣管上皮細(xì)胞癌)、皮膚癌(例如，黑色素瘤、基底細(xì)胞和鱗狀上皮細(xì)胞癌)、腸粘膜癌、陰道粘膜癌和子宮頸癌。
在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，治療劑配制在眼用制劑中，給予眼睛。這種制劑適用于將視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(RB)基因傳遞至眼，任選地與傳遞p53結(jié)合。
X.治療方法通常給予本發(fā)明制劑以增強(qiáng)試劑轉(zhuǎn)染至細(xì)胞。細(xì)胞可是一部分組織如上皮膜，或是分離的細(xì)胞如組織培養(yǎng)。可體內(nèi)、活體外或體外提供細(xì)胞。
可通過多種方法，體內(nèi)或活體外將含傳遞增強(qiáng)化合物和調(diào)節(jié)劑的制劑引入感興趣的組織。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，通過以下方法將調(diào)節(jié)劑引入細(xì)胞顯微注射、磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)體融合或生物導(dǎo)彈。在其它實(shí)施例中，通過感興趣的組織直接攝取治療劑。
在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，活體外將本發(fā)明組合物給予移植自患者的細(xì)胞或組織，然后再返回患者?；铙w外給予治療性基因構(gòu)建物的例子包括Arteaga等，Cancer Research 56(5)1098-1103(1996)；Nolta等，Proc Natl.Acad.Sci.USA93(6)2414-9(1996)；Koc等，Seminars in Oncology 23(1)46-65(1996)；Raper等，Annals of Surgery 223(2)116-26(1996)；Dalesandro等，J.Thorac.Cardi.Surg，11(2)416-22(1996)；和Makarov等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(1)402-6(1996)。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供通過給予調(diào)節(jié)劑，如蛋白質(zhì)或抗體與SYN-3的組合，治療膀胱癌的方法。
實(shí)施例下面的實(shí)施例是為了闡明而不是限制本發(fā)明的范圍。在下面的實(shí)施例中，“g”表示克、“mL”表示毫升，“mol”表示摩爾，“℃”表示攝氏度，“min”表示分鐘，“DMF”表示二甲基甲酰胺。除非另有說明，所有溫度是攝氏度。
實(shí)施例1合成化合物A-DL(見圖1和2)
以下涉及合成化合物5，也稱為A-DL的方法。下面提供了合成1、3-5的具體細(xì)節(jié)和純化步驟。
A.所用物質(zhì)和試劑叔丁氧基羰基酸酐N-(3-氨基丙基)-1，3-二胺丙烷膽酸氯甲酸異丁酯三乙胺氰基硼氫化鈉乳糖5％鹽酸醋酸B.實(shí)驗(yàn)方法化合物15℃，20分鐘內(nèi)，將叔丁氧基羰基酸酐(10.0mmol)的CH2Cl2(50mL)溶液逐滴滴加到攪拌良好的N-(3-氨基丙基)-1，3-二胺丙烷(50-mmol)的CH2Cl2(150mL)溶液中。攪拌混合液2小時(shí)后，除去溶劑，將所得殘留物再溶解于水(200mL)中。然后用CH2Cl2(8×50mL)萃取該水溶液。用MeCN∶AcOH∶H2O(4∶1∶1)進(jìn)行TLC，產(chǎn)物的rf為0.35，磷鉬酸檢測。棄去含有非極性雜質(zhì)的最初萃取物。合并感興趣的有機(jī)萃取物，NaSO4干燥，濃縮得到感興趣的N-BOC胺，1(5.53mmol，相對于BOCO的55％)。
化合物35℃下，用氯甲酸異丁酯(9.25mmol)和三乙胺(14.3mmol)處理膽酸2(8.94mmol)的DMF(80mL)溶液10分鐘。然后加入化合物1(3.57mmol)，室溫下攪拌混合液72小時(shí)。用CH2Cl2∶MeOH(3∶1)，通過TLC檢測反應(yīng)，感興趣的產(chǎn)物的rf為0.35。蒸發(fā)溶劑，硅膠柱上純化(100g硅膠，用CH2Cl2∶MeOH(5∶1))，得到化合物2(1.90mmol 53％)。
化合物4將化合物3(1.90mmol)溶解于5％HCl的MeOH(50mL)溶液中，室溫下攪拌15小時(shí)。用TLC(CH2Cl2∶MeOH(3∶1))檢測反應(yīng)，感興趣的產(chǎn)物的rf為0.5。與甲苯共蒸發(fā)溶劑，再溶解于MeOH中。用堿性樹脂(IRA-400，OH-)處理溶液，用CH2Cl2∶MeOH∶Et3N∶H2O(60∶30∶5∶5)硅膠純化，得到化合物3(0.72mmol 38％)。
化合物5(A-DL)將化合物4(2.48mmol)溶解于MeOH(200mL)中，加入醋酸(4mL)和乳糖(6.0mmol)(見圖2)。回流加熱溶液后，加入氰基硼氫化鈉(6.0mmol)。3小時(shí)后，加入更多的氰基硼氫化鈉(6.0mmol)，再回流攪拌反應(yīng)12小時(shí)。用4∶1∶1AcCN；AcOH∶H2O溶劑系統(tǒng)，通過TLC檢測反應(yīng)。觀察到兩種主要的新化合物具有較低的rf(約0.1和0.05)，然后是化合物4和乳糖。這兩種點(diǎn)相當(dāng)于A-RLB和A-DL(A-DL的rf較低)。蒸發(fā)溶劑，將所得殘留物溶解于1∶1 MeOH∶H2O溶液中，反向硅膠柱純化。緩慢增加甲醇的百分比，得到未反應(yīng)化合物3和乳糖，然后洗脫A-DL和A-RLB。合并并濃縮含A-DL和A-RLB的部分。使用CH2Cl2∶MeOH∶H2O∶Et3N(60∶30∶5∶5)作為溶劑，在硅膠柱(150g硅膠)上純化所得殘留物?；厥?.26mmol A-RLB，以及感興趣的化合物5(A-DL，0.61mmol 25％)。
實(shí)施例2合成化合物A-LB(Syn3)(見圖3和4)下面涉及合成化合物8，也稱為A-LB的方法。下面提供了化合物5-6的合成細(xì)節(jié)和感興趣的純化步驟。
A.所用的物質(zhì)和試劑N-(3-氨基丙基)-1，3-二胺丙烷膽酸二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)氯甲酸異丁酯三乙胺乳糖酸B.實(shí)驗(yàn)化合物7回流加熱乳糖酸6(716mg，2mmol)的甲醇(60mL)溶液。在該溶液中加入DCC(500mg，2.5mmol)，回流攪拌所得溶液。2小時(shí)后，加入N-(3-氨基丙基)-1，3-二胺丙烷(800mL，5.7mmol)，再攪拌所得溶液1小時(shí)。將該反應(yīng)液冷卻至室溫，濃縮得到粗產(chǎn)物7。在二氯甲烷中研碎，純化粗產(chǎn)物7，得到粘稠吸濕性固體的7(2.72g，5.7mmol)。
化合物8將膽酸2(4.1g，10mmol))的DMF(60mL)溶液冷卻至0℃。在該溶液中加入氯甲酸異丁酯(1.2mL，10.2mmol)和三乙胺(1.4mL，10.4mmol)，攪拌所得溶液10分鐘后，加入5(2.5g，5.3mmol)的DMF(40mL)溶液。攪拌該反應(yīng)液72小時(shí)后，濃縮得到粗產(chǎn)物8。柱色譜純化粗產(chǎn)物8，得到純的8(A-LB)。
實(shí)施例3膀胱內(nèi)給予SYN3制劑后IFN蛋白的攝取本實(shí)施例表明，給予SYN3制劑時(shí)，SYN3通過增加干擾素蛋白的組織水平增強(qiáng)干擾素蛋白的攝取。
方法。使用雜交IFN蛋白和IFNα2b蛋白(Intron A)。為了比較的目的，在時(shí)間t＝0的時(shí)間點(diǎn)也包含雜交蛋白。用異氟烷麻醉雜交HSD大鼠。收集預(yù)處理尿液。使用導(dǎo)管和潤滑劑經(jīng)尿道插入導(dǎo)管至膀胱。將試驗(yàn)樣品給予膀胱，不移去導(dǎo)管，2.0G縫合線結(jié)扎尿道。45分鐘(0小時(shí))后，移去試驗(yàn)樣品并讓動(dòng)物在籠子中恢復(fù)。處死前立即收集大鼠尿樣。收集尿樣后，同一天從大鼠中取出膀胱。冷凍組織，并分析IFN應(yīng)答基因的上調(diào)。
材料38只雌性Harlan Sprague-Dawley大鼠；IACBTris-丙三醇制劑 7.57×1011P/mlIHCBvPBS制劑 1.10×1012P/mlSYN3 6×原液(6mg/ml)Intron A使用參照樣品水合在1ml無菌納米純蒸餾水(10MIU/ml)中950μl Intron A用3,008μl PBS稀釋(2.4MIU/ml)625μl稀釋的Intron A加入到125μl PBS或SYN3(6mg/ml)中IFNα2α1蛋白 105μg/ml＝105×106pg/ml1.34×107IU/ml1.28×108IU/mgIACB是干擾素α2b的重組腺病毒載體，具有CMV啟動(dòng)子和E1-區(qū)域缺失。IHCB是雜交干擾素α2α1的重組腺病毒，也具有CMV啟動(dòng)子和E1-區(qū)域缺失。
受試樣品的制備制備最終濃度2.4MIU/ml的IFNα2b(將一參照樣品水合在1ml無菌注射用水中)950μl Intron A濃縮物3,008μl PBS制備IFNα2b的PBS溶液625μl Intron A@2.4MIU/ml125μl PBS制備IFNα2b的SYN3溶液625μl Intron A@2.4MIU/ml125μl SYN3制備rAd-IFNα2b(IACB)的SYN3溶液66μl IACB250μl SYN31184μl Tris-丙三醇緩沖液制備IFN α2α1蛋白濃縮物(2.2ml)243μl IFN α2α1蛋白1957μl PBSIFN α2α1/PBS625μl IFN α2α1蛋白125μl PBSIFN α2α1/SYN3625μl IFN α2α1蛋白125μl SYN3
賦形劑的最終濃度
SYN3(120mg/20ml)/6＝1mg/ml檸檬酸一水合物(1.6mg/20ml)/6＝0.01333mg/ml檸檬酸鈉二水合物(5.1mg/20ml)/6＝0.0425mg/ml羥丙基-(β-環(huán)糊精)(1000mg/20ml)/6＝8.33mg/ml聚山梨酯80(吐溫80)(60mg/20ml)/6＝0.5mg/ml用ELISA試驗(yàn)(PBL)測定組織勻漿中存在的IFNα2b的量。用Bradford蛋白試驗(yàn)測定蛋白濃度。組織中存在的IFN水平以pgIFN/mg組織表示。如圖5所示，SYN3制劑中IFNα2b的傳遞，使得處理后長達(dá)24小時(shí)可檢出的IFNα2b蛋白的量增加約15倍。圖6顯示具體時(shí)間點(diǎn)。而且，在與IFNα2b蛋白相似的組織濃度水平檢測，在SYN3制劑中傳遞還可提高雜交IFN蛋白(IFNα2α1)的傳遞。
實(shí)施例4給予IFN蛋白的SYN3(圖4化合物8)制劑后，分析干擾素對膀胱上皮的生物學(xué)效應(yīng)本實(shí)施例研究了IFN組織濃度的增加是否導(dǎo)致可測定的生物學(xué)反應(yīng)。為了評價(jià)生物學(xué)活性，用IFN蛋白(Intron A和“通用”干擾素(IFN A/D；IFN α2α1)處理后，用RT-PCR檢測IFN應(yīng)答基因在大鼠膀胱勻漿中的表達(dá)。分析以下大鼠基因2′，5′-寡腺苷酸合成酶(2′，5′-OAS)；編碼干擾素誘導(dǎo)的p78蛋白的基因(MxAMX1)(MX1)；干擾素調(diào)節(jié)因子1(IRF-1)；和干擾素γIFNγ。(IFNγ不是一般認(rèn)為的IFN反應(yīng)基因，而通常是在接觸病原體如BCG后表達(dá)，且可被重組腺病毒誘導(dǎo))。方法一般如實(shí)施例3所述。1小時(shí)后，移去受試樣品并讓動(dòng)物在籠子中恢復(fù)。在指定時(shí)間點(diǎn)(0小時(shí)＝處理后立刻)處死大鼠，并將樣品快速冷凍在液氮中，用于RT-PCR分析。
所需材料38只雌性Harlan Sprague-Dawley大鼠；由方案04-634轉(zhuǎn)染IACBTris-丙三醇制劑7.57×1011P/mlIHCBvPBS制劑 1.10×1012P/mlSYN3 6×原液(6mg/ml)D-PBSTris-丙三醇緩沖液無菌WFIIFN α2α1蛋白 105μg/ml＝105×106pg/ml1.34×107IU/ml1.28×108IU/mg受試樣品的制備1)IFN α2b/PBS5ml@2MIU/ml最終濃度將一參照樣品(10MIU/樣品)水合在1ml無菌注射用水中1,000μl Intron A濃縮物4,000μl PBS2)IFN α2b/SYN310ml@2MIU/ml最終濃度用2ml無菌注射用水合兩個(gè)參照樣品2,000μl Intron A濃縮物
6,334μl PBS1,666μl SYN3IACB/SYN34.5ml@1.0×1011P/ml的SYN3660μl IACB750μl SYN33,090μl Tris-丙三醇緩沖液IFN α2α1/PBS4ml@1 MIU/ml最終濃度298μl IFN α2α1蛋白3,702μl PBSIFN α2α1/SYN36ml@1 MIU/ml最終濃度444μl IFN α2α1蛋白4,556μl PBS1,000μl SYN3IHCB/SYN34.0ml@1.0×1011P/ml的SYN3364μl IHCB667μl SYN32,969μl Tris-丙三醇緩沖液處死動(dòng)物并將其膀胱置于液氮上，用于RT-PCR分析。初步分析用于比較上述基因的mRNA水平和傳遞Intron A/PBS后觀察到的水平。將基因激活水平校正至Intron A/PBS組(1.0)。
結(jié)果表明，與傳遞相同量在PBS制劑中的蛋白相比，加入SYN3可增加已知下游IFN-活化基因(2′-5′OAS，MX1)的表達(dá)。即使以1MIU/ml而非IFN α2b的2MIU/ml給藥，SYN3中的雜交蛋白(BSIFN α2α1/SYN3)似乎可提供更有效的生物反應(yīng)。雖然當(dāng)以SYN3制劑給予時(shí)，Intron A(IFN α2b)和雜交IFN(IFNα2α1)都可增加大鼠OAS和MX1基因的表達(dá)，但兩者略低于rAd-IFN α2b或rAd-IFN α2α1給予后獲得的水平。
應(yīng)理解本文所述實(shí)施例和實(shí)施方式僅是示例性的目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白，根據(jù)其的各種改進(jìn)或變化，且這些改進(jìn)或變化包括在本發(fā)明的精神和范圍及所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。出于所有目的，本文引用的所有出版物、專利和專利申請以其全部內(nèi)容參考包括在此。
權(quán)利要求
1.一種通式I的化合物 式中，R1和R2各獨(dú)立地選自氫和羥基；m和n各獨(dú)立地選自約0-2；R3選自-NR4R5，其中R4和R5各獨(dú)立地選自氫、糖殘基、任選取代的烷基、任選取代的?；?、任選取代的酰氧基，和季銨鹽-NR6R7R8X，其中R6、R7和R8獨(dú)立地選自氫和C1-C4烷基，X是選自鹵素和任選取代的羧酸根的帶負(fù)電荷的離子結(jié)合的抗衡離子。
2.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，R1和R2都是羥基。
3.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，m和n各為1。
4.如權(quán)利要求3所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有通式II
5.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，R4是氫；和R5選自氫、糖殘基、任選取代的烷基、任選取代的?；腿芜x取代的酰氧基。
6.如權(quán)利要求3所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有通式III
7.如權(quán)利要求5所述的化合物，其特征在于，R5是琥珀酰基。
8.如權(quán)利要求5所述的化合物，其特征在于，R5是酰氧基。
9.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，R3是三甲基銨鹽。
10.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，R3是三乙基銨鹽。
11.一種將試劑傳遞至細(xì)胞的組合物，所述組合物包含試劑和通式I的傳遞增強(qiáng)化合物 式中，R1和R2各獨(dú)立地選自氫和羥基；m和n各獨(dú)立地選自約0-2；R3選自-NR4R5，其中R4和R5各獨(dú)立地選自氫、糖殘基、任選取代的烷基、任選取代的?；⑷芜x取代的酰氧基，和季銨鹽-NR6R7R8X，其中R6、R7和R8獨(dú)立地選自氫和C1-C4烷基，X是選自鹵素和任選取代的羧酸根的帶負(fù)電荷的離子結(jié)合的抗衡離子。
12.如權(quán)利要求11所述的組合物，其特征在于，R1和R2都是羥基。
13.如權(quán)利要求11所述的組合物，其特征在于，m和n各為1。
14.如權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于，所述組合物具有通式II
15.如權(quán)利要求11所述的組合物，其特征在于，R4是氫；和R5選自氫、糖殘基、任選取代的烷基、任選取代的?；腿芜x取代的酰氧基。
16.如權(quán)利要求15所述的組合物，其特征在于，所述組合物具有通式III
17.如權(quán)利要求15所述的組合物，其特征在于，R5是琥珀?；?。
18.如權(quán)利要求15所述的組合物，其特征在于，R5是酰氧基。
19.如權(quán)利要求11所述的組合物，其特征在于，R3是三甲基銨鹽。
20.如權(quán)利要求11所述的組合物，其特征在于，R3是三乙基銨鹽。
21.如權(quán)利要求11所述的組合物，其特征在于，所述試劑是診斷劑。
22.如權(quán)利要求11所述的組合物，其特征在于，當(dāng)試劑在細(xì)胞中存在時(shí)，所述試劑可調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)過程。
23.如權(quán)利要求22所述的組合物，其特征在于，所述生物學(xué)過程選自細(xì)胞生長、分化、增殖、代謝或生物合成途徑、基因表達(dá)、疾病相關(guān)過程和免疫反應(yīng)。
24.如權(quán)利要求11所述的組合物，其特征在于，所述試劑包含聚核苷酸或蛋白質(zhì)。
25.如權(quán)利要求24所述的組合物，其特征在于，所述聚核苷酸選自反義核酸、形成三鏈體的核酸以及含有編碼調(diào)節(jié)生物學(xué)過程的多肽的基因的核酸。
26.如權(quán)利要求25所述的組合物，其特征在于，所述基因是腫瘤抑制基因。
27.如權(quán)利要求26所述的組合物，其特征在于，所述腫瘤抑制基因選自視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因和p53基因。
28.如權(quán)利要求11所述的組合物，其特征在于，所述組合物還含有聚合基質(zhì)。
29.如權(quán)利要求11所述的組合物，其特征在于，所述組合物還含有粘膜粘附劑。
30.如權(quán)利要求24所述的組合物，其特征在于，所述試劑包含蛋白質(zhì)。
31.如權(quán)利要求30所述的組合物，其特征在于，所述蛋白質(zhì)是干擾素。
32.如權(quán)利要求31所述的組合物，其特征在于，所述干擾素選自干擾素-α、干擾素-β、干擾素-δ、干擾素-γ及其融合干擾素。
33.如權(quán)利要求31所述的組合物，其特征在于，所述干擾素選自干擾素α-2β、融合干擾素α-/2α-1和干擾素α-2e。
34.如權(quán)利要求31所述的組合物，其特征在于，所述干擾素是人α1或α2干擾素。
35.如權(quán)利要求30所述的組合物，其特征在于，所述蛋白質(zhì)是抗體。
36.如權(quán)利要求35所述的組合物，其特征在于，所述抗體選自抗-干擾素-α、抗-干擾素-β、抗-干擾素-δ、抗-干擾素γ、抗-白介素、抗-IL-1、抗-IL-2、抗-IL-4、抗-IL-6、抗-IL-7和抗-IL-10。
37.一種將試劑傳遞至細(xì)胞的方法，所述方法包括給予所述細(xì)胞在含通式I的化合物的組合物中的所述試劑 式中，R1和R2各獨(dú)立地選自氫和羥基；m和n各獨(dú)立地選自約0-2；R3選自-NR4R5，其中R4和R5各獨(dú)立地選自氫、糖殘基、任選取代的烷基、任選取代的?；⑷芜x取代的酰氧基，和季銨鹽-NR6R7R8X，其中R6、R7和R8獨(dú)立地選自氫和C1-C4烷基，X是選自鹵素和任選取代的羧酸根的帶負(fù)電荷的離子結(jié)合的抗衡離子。
38.一種通過給予編碼抑制細(xì)胞基因或腫瘤抑制基因的重組病毒載體與通式I的化合物的組合治療膀胱癌的方法， 式中，R1和R2各獨(dú)立地選自氫和羥基；m和n各獨(dú)立地選自約0-2；R3選自-NR4R5，其中R4和R5各獨(dú)立地選自氫、糖殘基、任選取代的烷基、任選取代的?；?、任選取代的酰氧基，和季銨鹽-NR6R7R8X，其中R6、R7和R8獨(dú)立地選自氫和C1-C4烷基，X是選自鹵素和任選取代的羧酸根的帶負(fù)電荷的離子結(jié)合的抗衡離子。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述腫瘤抑制基因選自RB56、RB110、RB94、P53和P53Δ13-19。
40.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述抑制細(xì)胞基因是干擾素基因。
41.如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，所述干擾素選自干擾素-α、干擾素-β、干擾素-δ、干擾素-γ及其融合干擾素。
42.如權(quán)利要求40所述的組合物，其特征在于，所述干擾素選自干擾素α-2β、融合干擾素α-/2α-1和干擾素α-2e。
43.如權(quán)利要求40所述的組合物，其特征在于，所述干擾素是人α1或α2干擾素。
44.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述膀胱癌是淺表性膀胱癌。
45.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述通式I的化合物還含有增溶劑。
46.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述試劑是治療劑。
47.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述試劑是診斷劑。
48.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述傳遞增強(qiáng)化合物的濃度約為0.002-2mg/ml。
49.如權(quán)利要求48所述的方法，其特征在于，所述傳遞增強(qiáng)化合物的濃度約為0.02-2mg/ml。
50.如權(quán)利要求49所述的方法，其特征在于，所述傳遞增強(qiáng)化合物的濃度約為0.2-2mg/ml。
51.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述傳遞增強(qiáng)化合物在沒有除傳遞增強(qiáng)化合物外的去污劑的情況下，在水溶液中可溶。
52.如權(quán)利要求51所述的方法，其特征在于，所述傳遞增強(qiáng)化合物在沒有除傳遞增強(qiáng)化合物外的去污劑的情況下，在水溶液中的溶解度至少約為1mg/ml。
53.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述試劑傳遞通過糖胺聚糖(GAG)層。
54.如權(quán)利要求53所述的方法，其特征在于，所述GAG層包含器官。
55.如權(quán)利要求53所述的方法，其特征在于，所述GAG層包含上皮組織。
56.如權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述上皮組織選自胃腸道、皮膚、肺和粘膜。
57.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述給予是通過膀胱內(nèi)給予的。
58.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述試劑是蛋白質(zhì)。
59.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述試劑是基因。
60.如權(quán)利要求59所述的方法，其特征在于，所述基因在載體中給予。
61.如權(quán)利要求60所述的方法，其特征在于，所述載體是病毒載體。
62.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述病毒載體選自腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺相關(guān)病毒載體。
63.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，以病毒載體濃度1×108顆粒/毫升至5×1011顆粒/毫升的懸浮液形式給予所述病毒載體。
64.如權(quán)利要求63所述的方法，其特征在于，所述懸浮液中病毒載體濃度為1×109顆粒/毫升至1×1011顆粒/毫升。
65.如權(quán)利要求59所述的方法，其特征在于，所述基因是治療性基因。
66.如權(quán)利要求65所述的方法，其特征在于，所述治療性基因是腫瘤抑制基因。
67.如權(quán)利要求66所述的方法，其特征在于，所述腫瘤抑制基因是p53。
68.如權(quán)利要求66所述的方法，其特征在于，所述腫瘤抑制基因是視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因。
69.如權(quán)利要求68所述的方法，其特征在于，所述視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤抑制基因編碼全長RB蛋白質(zhì)。
70.如權(quán)利要求68所述的方法，其特征在于，所述視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤抑制基因編碼p56RB。
71.如權(quán)利要求65所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是癌細(xì)胞。
72.如權(quán)利要求71所述的方法，其特征在于，所述癌細(xì)胞是膀胱癌細(xì)胞。
73.如權(quán)利要求71所述的方法，其特征在于，所述癌細(xì)胞作為一種組織提供。
74.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，給予所述試劑之前給予所述傳遞增強(qiáng)化合物。
75.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，與所述試劑一起給予所述傳遞增強(qiáng)化合物。
全文摘要
本發(fā)明提供提高試劑轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞的化合物、組合物及方法。所述試劑包括多肽、聚核苷酸如基因和反義核酸及其它分子。在一些實(shí)施例中，所述試劑是調(diào)節(jié)劑，引入細(xì)胞時(shí)可調(diào)節(jié)細(xì)胞活性或功能。化合物、組合物和方法可用于將試劑如基因?qū)雮€(gè)體細(xì)胞，及以組織或器官形式存在的細(xì)胞。
文檔編號C07J17/00GK1845932SQ200480019510
公開日2006年10月11日 申請日期2004年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月4日
發(fā)明者J·麥克科利夫, R·康納 申請人:坎基股份有限公司