本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種高產(chǎn)熱穩(wěn)定性木聚糖酶的里氏木霉基因工程菌的制備方法。

背景技術(shù)：

絲狀真菌里氏木霉（Trichoderma reesei）的表達(dá)系統(tǒng)是用于同源和異源基因重組表達(dá)的重要工具，在許多方面優(yōu)于原核表達(dá)系統(tǒng)和酵母表達(dá)系統(tǒng)。一方面，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)在表達(dá)異源蛋白時易形成包涵體，并且表達(dá)的酶活性比較低及缺乏糖基化修飾等。另一方面，酵母表達(dá)系統(tǒng)存在著過度糖基化和蛋白折疊問題，會影響所表達(dá)酶的活性。相比較而言，里氏木霉是表達(dá)同源和異源蛋白的理想宿主。首先，里氏木霉具有極好的合成蛋白和分泌蛋白的能力，并具有真核的分泌機制，很可能還具有與哺乳動物系統(tǒng)相似的蛋白修飾性能，如高甘露糖型和N-糖基化等。其次，里氏木霉易于培養(yǎng)，而且培養(yǎng)成本低，培養(yǎng)體積即使達(dá)到230m³，里氏木霉的發(fā)酵性質(zhì)保持良好而且不容易受到污染。里氏木霉還被認(rèn)為是安全的產(chǎn)品生產(chǎn)者，因為它在酶產(chǎn)品生產(chǎn)所需的環(huán)境條件下沒有致病性和不會產(chǎn)生真菌毒素和抗生素。由于里氏木霉具有以上優(yōu)良性能，再加之其工業(yè)化規(guī)模發(fā)酵條件已比較成熟，這些都促進(jìn)了對里氏木霉的遺傳改造，為同源或異源蛋白的高效生產(chǎn)提供了一條行之有效的途徑。

木聚糖酶在許多工業(yè)中被廣泛應(yīng)用，如飼料行業(yè)、造紙行業(yè)和食品行業(yè)。然而，在這些應(yīng)用中，往往需要酶具有良好的耐熱性，寬廣的pH和較高的比活。所以，人們不斷去尋找新的具有優(yōu)良性能的可用木聚糖酶，并通過隨機突變或者理性設(shè)計方法來提高它的性能。其中，來源于瘤胃真菌（Neocallimastix patriciarum）的木聚糖酶催化結(jié)構(gòu)域xyn-CD，通過易錯PCR將其隨機突變得到的重組木聚糖酶Xyn-CDBFV擁有較高的酶活、較寬的pH和良好的耐熱性。因此，重組木聚糖酶Xyn-CDBFV在工業(yè)產(chǎn)品中具有廣泛的應(yīng)用前景。目前，Cheng, Y.S等詳細(xì)解析了該蛋白的結(jié)構(gòu)，并結(jié)合實驗提出了該蛋白的耐熱因素。（Cheng，Y.S. et al.（2014）Structural Analysis of a Glycoside Hydrolase Family 11 Xylanase from Neocallimastix patriciarum: Insights into the Molecular Basis of a Thermophilic Enzyme. J. Biol. Chem. ）。Xyn-CDBFV具有11家族木聚糖酶典型的β-jelly-roll折疊結(jié)構(gòu)，但是Xyn-CDBFV具有延伸出來的N端結(jié)構(gòu)域（N-terminal region，NTR），這在11家族木聚糖酶結(jié)構(gòu)中是罕見的。NTR是依靠堆積相互作用、氫鍵和一個二硫鍵穩(wěn)定的附著在Xyn-CDBFV的催化中心，而不是做為一個靈活的片段自由的懸掛在外面。Cheng，Y.S等的研究表明：僅刪除由11個氨基酸組成的NTR后，Xyn-CDBFV突變株的酶活在55℃和75℃分別降為原來的61.5%和19.5%；僅刪除由NTR和催化中心形成的二硫鍵后，Xyn-CDBFV突變株的酶活在55℃和75℃分別降為原來的86.8%和23.3%。由此可見，NTR在該酶熱穩(wěn)定性中有著重要作用，尤其是NTR和催化中心形成的二硫鍵更是起著關(guān)鍵作用，在二硫鍵的作用下，NTR像個夾子一樣夾住催化中心，使它在高溫下能穩(wěn)定。

中國專利CN 102757947公開了一種熱穩(wěn)定性改良的木聚糖酶Xyn-CDBFV-m及其基因，其中，對木聚糖酶Xyn-CDBFV的改良之一是將33位的丙氨酸和58位的苯丙氨酸分別替換為半胱氨酸，并稱其是在木聚糖酶Xyn-CDBFV的N端引入二硫鍵。但隨著Cheng，Y.S等解析了木聚糖酶Xyn-CDBFV蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其NTR僅由11個氨基酸組成，因此，對于中國專利CN 102757947中公開的的N端引入二硫鍵提高木聚糖酶Xyn-CDBFV的熱穩(wěn)定性的結(jié)果值得懷疑，因為33位的丙氨酸和58位的苯丙氨酸并非位于木聚糖酶Xyn-CDBFV的N端結(jié)構(gòu)域。

目前，眾多學(xué)者進(jìn)行里氏木霉中表達(dá)木聚糖酶的研究，但對于將木聚糖酶xyn-CDBFV進(jìn)行了改造后得到的木聚糖酶在里氏木霉中表達(dá)以提升表達(dá)產(chǎn)量的研究還未見報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種高產(chǎn)熱穩(wěn)定性木聚糖酶的里氏木霉基因工程菌的制備方法，將改造得到的木聚糖酶xyn-LVK在里氏木霉中表達(dá)后，與木聚糖酶xyn-LVK在畢赤酵母中的表達(dá)相比，產(chǎn)量顯著得升，木聚糖酶xyn-LVK的產(chǎn)量提升約40%。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是提供一種高產(chǎn)熱穩(wěn)定性木聚糖酶的里氏木霉基因工程菌的制備方法，包括以下步驟：

（1）合成依次由里氏木霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子、里氏木霉cbh1信號肽序列、木聚糖酶xyn-LVK基因序列和里氏木霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶終止子組成的表達(dá)框序列；

（2）將所述表達(dá)框序列克隆至pUC19中，得到重組表達(dá)質(zhì)粒；

（3）將所述重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行DNA測序，測序表明序列正確的轉(zhuǎn)化子用于大量制備所述重組表達(dá)質(zhì)粒；

（4）抽提所述重組表達(dá)質(zhì)粒，將所述重組表達(dá)質(zhì)粒和pAN7-1載體混勻，共轉(zhuǎn)里氏木霉原生質(zhì)體，涂布于含抗生素的PDA固體平板上，進(jìn)行培養(yǎng)；

（5）將長出的轉(zhuǎn)化子接種于不含抗生素的PDA固體平板上長孢子；

（6）用無菌水制備孢子懸液，取孢子接種于基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時后轉(zhuǎn)接到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)196小時；取菌液離心，得上清液用于酶活性檢測，從中篩選出高木聚糖酶活性的轉(zhuǎn)化子，即得到高產(chǎn)熱穩(wěn)定性木聚糖酶xyn-LVK的里氏木霉基因工程菌；

其中，所述木聚糖酶xyn-LVK的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述木聚糖酶基因xyn-LVK的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

木聚糖酶xyn-CDBFV的改造如下：通過Disulfide by Design軟件對xyn-CDBFV上的二硫鍵進(jìn)行了在線分析預(yù)測。經(jīng)分析，存在26個可以形成二硫鍵的潛在位點。它們分別是：4位/172位；7位/217位；7位/218位；11位/45位；28位/65位；29位/42位；50位/60位；55位/58位；57位/204位；61位/198位；70位/74位；83位/172位；83位/218位；91位/208位；95位/117位；95位/118位；97位/115位；100位/200位；102位/195位；129位/145位；131位/143位；141位/164位；176位/179位；184位/189位；199位/219位；205位/208位。其中，NTR和催化中心之間除了已形成的4位/172位二硫鍵外，還有7位/217位和11位/45位可以設(shè)計形成二硫鍵。結(jié)合預(yù)測結(jié)果，理性的在NTR和催化中心之間設(shè)計引入7位/217位和11位/45位二硫鍵，這樣在木聚糖酶xyn-LVK中，NTR和催化中心之間將有三個二硫鍵，它們使NTR這個“夾子”更穩(wěn)固的夾住催化中心，使木聚糖酶xyn-LVK在高溫下更加穩(wěn)定。木聚糖酶xyn-CDBFV通過改造后得到木聚糖酶xyn-LVK，木聚糖酶xyn-LVK的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，木聚糖酶基因xyn-LVK的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述SEQ ID NO.1的序列如下：

QSFCSSCSHSCQSVKVTGNKVGTIGGVGYELWADSGNNSATFYScGSFSCTFQNAGDYLCRSGLSFDSTKTPSQIGRMKADFKLVKQNSSNVGYSYVGVYGWTRSPLVEYYIVDNWLSPFPPGDWVGNKKHGSFTIDGAQYTVYENTRTGPSIDGDTTFNQYFSIRQQARDCGTIDISAHFDQWEKLGMTMGKLHEAKVLGEAGNVNGGASGTADFcYAKVYIGD。

所述SEQ ID NO.2的序列如下：

CAAAGTTTCTGTAGTTCATGTTCTCACTCTTGTCAAAGTGTAAAGGTAACCGGCAACAAGGTTGGAACTATTGGTGGTGTTGGTTACGAATTATGGGCTGATAGTGGTAATAACAGTGCTACTTTCTATTCTTGTGGTTCCTTCTCATGTACTTTCCAAAATGCTGGGGATTACTTATGTCGTAGTGGTCTTTCTTTCGATAGTACTAAGACCCCATCTCAAATTGGTCGTATGAAGGCTGATTTCAAACTTGTCAAACAAAATAGTTCCAATGTTGGTTATTCCTATGTTGGTGTTTACGGTTGGACTAGAAGTCCACTTGTCGAATACTACATTGTCGATAATTGGCTTAGTCCATTCCCACCAGGTGATTGGGTTGGTAACAAGAAGCATGGTTCTTTCACTATTGATGGTGCTCAATACACTGTTTATGAAAACACTCGTACTGGTCCATCTATTGATGGTGATACCACCTTCAATCAATACTTTAGTATTCGTCAACAAGCTCGTGATTGTGGTACCATTGATATTTCTGCTCACTTTGATCAATGGGAAAAGCTTGGTATGACTATGGGTAAATTACATGAAGCCAAGGTTTTAGGTGAAGCCGGTAACGTTAACGGTGGTGCCAGTGGTACTGCTGATTTCTGTTACGCAAAGGTTTACATTGGTGATTAA。

所述的里氏木霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子的序列如SEQ ID NO.3所示，為：

GACGCAGAAGAAGGAAATCGCCCCGCCGGTTCCGTAAAAAAAATATGAGCGCAGGGACAAGCACAGCCTTGGCCCTGGGCCTAGCCTTGCGCCTTGTTTGATGCAATCGGCGACATGTCGAATGCTGTAATTTTTTTTGTTTAGGTTCCCCTTTTCCTTTTGTGTTAATAATAATTCTCGAAGGGCGCTGATTTTGAAATTTGTCGGTGAGAGCCAAACGGATATACAGGCGCGGCTGATGAATAATGATGAATCGAGCTGACTTGATGCTGTATGTACAATATTGACTGCGAGGACCATCAGGTGTTGTATGGATGGAATCATTCTGTAACCACCAAGGTGCATGCATCATAAGGTATTCTCCTCAGCTCACCAACAACGAACGATGGCCATGTTAGTAAAGGCACCGTGATGGCAAGATAGAACCACTATTGCATCTGCGCTTCCCACGCACAGTACGTCAATGTAACGTCAAAGCCGCCCTCCCGTAACCTCGCCCGTTGTTGCTCCCCCCGATTGCCTCAATCACATAGTACCTACCTATGCATTATGGCGCCTCAACCCACCCCCCCAGATTGAGAGCTACCTTACATCAATATGGCCAGCACCTCTTCGGCGATACATACTCGCCACCCCAGCCGGGGCGATTGTGTGTACTAGGTAGGCTCGTACTATACCAGCAGGAGAGGTGCTGCTTGGCAATCGTGCTCAGCTGTTAGGTTGTACTTGTATGGTACTTGTAAGGTGGTCATGCAGTTGCTAAGGTACCTAGGGAGGGATTCAACGAGCCCTGCTTCCAATGTCCATCTGGATAGGATGGCGGCTGGCGGGGCCGAAGCTGGGAACTCGCCAACAGTCATATGTAATAGCTCAAGTTGATGATACCGTTTTGCCAGGATTAGGATGCGAGAAGCAGCATGAATGTCGCTCATCCGATGCCGCATCACCGTTGTGTCAGAAACGACCAAGCTAAGCAACTAAGGTACCTTACCGTCCACTATCTCAGGTAACCAGGTACTACCAGCTACCCTACCTGCCGTGCCTACCTGCTTTAGTATTAATCTTTCCACCTCCCTCCTCAATCTTCTTTTCCCTCCTCTCCTCTTTTTTTTTTCTTCCTCCTCTTCTTCTCCATAACCATTCCTAACAACATCGACATTCTCTCCTAATCACCAGCCTCGCAAATCCTCAGGTTAGTATTACTACTACTACAATCATCACCACGATGCTCCGCCCGACGATGCGGCTTCTGTTCGCCTGCCCCTCCTCTCACTCGTGCCCTTGACGAGCTACCCCGCCAGACTCTCCTGCGTCACCAATTTTTTTCCCTATTTACCCCTCCTCCCTCTCTCCCTCTCGTTTCTTCCTAACAAACAACCACCACCAAAATCTCTTTGGAAGCTCACGACTCACGCAAGCTCAATTCGCAGATACAAA。

所述的里氏木霉cbh1信號肽序列如SEQ ID NO.4所示，為：

ATGTATCGGAAGTTGGCCGTCATCACGGCCTTCTTGGCCACAGCTCGTGCT。

所述的里氏木霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶終止子如SEQ ID NO.5所示，為：

GTGCTGTGTTCCTCAGAATGGGCCCCAGAAGGGCGTCGAGCATTGTCTATGAATGCAAACAAAAATAGTAAATAAATAGTAATTCTGGCCATGACGAATAGAGCCAATCTGCTCCACTTGACTATCCTTGTGACTGTATCGTATGTCGAACCCTTGACTGCCCATTCAAACAATTGTAAAGGAATATGAGCTACAAGTTATGTCTCACGTTTGCGTGCGAGCCCGTTTGTACGTTATTTTGAGAAAGCGTTGCCATCACATGCTCACAGTCACTTGGCTTACGATCATGTTTGCGATCTTTCGGTAAGAATACACAGAGTAACGATTATACATCCATCGCTTTCTATGATTAGGTACTCAGACAACACATGGGAAACAAGATAACCATCGCATGCAAGGTCGATTCCAATCATGATCTGGACTGGGGTATTCCATCTAAGCCATAGTACCCTCGAGAGAAGGAATGGTAGGACCTCTCAGGCGTCCACCATCTGTGCTGCAAATCCAAGAAACCCCCCAAAAGCACCTACCTATCTACCTAGAGTAATCTGCACGAGAAAAGAAAAGGAGCAGAAGAAGAATGATCTCAAGAGGCCGTGAACGCAGAAACACACTCCTCCCAACTTTTCAAGTTTTGAACAAAAAAAGAAAGATGAGGACTAGAAGATGGAGTATTTCCTTCTTAGAGAGCTCTCGGTGAGGTGACCTGTCAGGGTTTACCTCAAACCGTCTGTGGTTCTATCCAATTAATCAAGTCCCTCTCCTCTCCTCTTCTCTCCTGTCCTTTCATAGAATCCCTTTTCCTTGTTGCTTGATCGAAGCGGGTTATCGACGCCACCAAAGTATTGTCTTGGTGACTTATCAAATCCCTTTGGTGATCAAACAGCCCCCGAGTGATCAGATCCGTAA。

具體地，所述高產(chǎn)熱穩(wěn)定性木聚糖酶xyn-LVK的里氏木霉基因工程菌的制備方法，包括以下步驟：

（1）合成依次由里氏木霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子、里氏木霉cbh1信號肽序列、木聚糖酶xyn-LVK基因序列和里氏木霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶終止子組成的表達(dá)框序列；

（2）利用PCR技術(shù)擴增所述表達(dá)框序列，然后利用限制性內(nèi)切酶EcoRI ，Xba 將所述表達(dá)框序列克隆至pUC19中，得到重組表達(dá)質(zhì)粒；表達(dá)載體構(gòu)建引物序列如下：

上游引物：CCGGAATTCGACGCAGAAGAAGGAAATCGCC（下劃線為EcoRI切位點），下游引物：GCTCTAGATTACGGATCTGATCACTCGGG（下劃線為，Xba酶切位點）；

（3）將所述重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行DNA測序，測序表明序列正確的轉(zhuǎn)化子用于大量制備所述重組表達(dá)質(zhì)粒；

（4）抽提所述重組表達(dá)質(zhì)粒，將10微克的所述重組表達(dá)質(zhì)粒和10 微克的pAN7-1載體混勻，共轉(zhuǎn)里氏木霉原生質(zhì)體，涂布于5個含抗生素的PDA固體平板上，28℃培養(yǎng)兩天，待平板上長出菌絲，將菌絲轉(zhuǎn)接到新的含抗生素的PDA固體平板上，28℃培養(yǎng)五天；

（5）將長出的轉(zhuǎn)化子接種于不含抗生素的PDA固體平板上長孢子；

（6）用無菌水制備孢子懸液，取10⁵個孢子接種于30ml的基本培養(yǎng)基中，28℃，250 r/min培養(yǎng)48小時后取1.5ml菌液后轉(zhuǎn)接到30ml的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，28℃，250 r/min培養(yǎng)196小時；取菌液，12,000×g 離心 5min，得上清液用于酶活性檢測，從中篩選出高木聚糖酶活性的轉(zhuǎn)化子，即得到高產(chǎn)熱穩(wěn)定性木聚糖酶xyn-LVK的里氏木霉基因工程菌；

本發(fā)明的有益效果是：將改造得到的木聚糖酶xyn-LVK在里氏木霉中表達(dá)后，與木聚糖酶xyn-LVK在畢赤酵母中的表達(dá)相比，產(chǎn)量顯著提升，木聚糖酶xyn-LVK的產(chǎn)量提升約40%。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述：

本發(fā)明中，木聚糖酶的酶活檢測方法參照《GB/T23874-2009飼料添加劑木聚糖酶活力的測定分光光度法》。

實施例：高產(chǎn)熱穩(wěn)定性木聚糖酶xyn-LVK的里氏木霉基因工程菌的制備

一、實驗條件

（1） 菌株與載體

大腸桿菌E. coli Top10購自Invitrogen公司，里氏木霉QM9414購自美國模式菌種收藏中心（ATCC），pUC19、pMD19-T simple vector購自TaKaRa。質(zhì)粒pAN7-1（帶有真菌篩選標(biāo)記潮霉素抗性基因hph和大腸桿菌篩選標(biāo)記氨芐青霉素抗性基因Ap）。

（2）酶類及其他生化試劑

各種DNA工具酶，DNA Marker，DNA膠回收純化試劑盒（Agarose Gel DNA Purification Kit）、DNA純化試劑盒（Fragment Purification Kit Ver. 2.0）購自TaKaRa。T4 DNA連接酶購自Fermetas公司。其它生化試劑購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

（3）培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：用于培養(yǎng)大腸桿菌，含1%胰化蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%氯化鈉；用NaOH調(diào)pH值至7.0；加1.5%（w/v）瓊脂粉（固體培養(yǎng)基）。

里氏木霉液體基本培養(yǎng)基：含100 mL/L Mandels營養(yǎng)液濃縮液，1.0 mL/L Mandels微量元素濃縮液，18 g/L無水葡萄糖，1.0 g/L蛋白胨，50 mL/L pH 4.5的1 mol/L的檸檬酸緩沖液，1.0-2.0 g/L吐溫80。

Mandels 營養(yǎng)鹽濃縮液配制：(NH₄)₂SO₄：14 g/L，尿素：3 g/L，KH₂PO₄：20 g/L，CaCl₂·2H₂O：4 g/L（或CaCl₂：3 g/L），MgSO4·7H2O：3 g/L，加水至1000 mL。

Mandels 微量元素濃縮液配制：FeSO₄·7H₂O：5 g/L，ZnSO₄·7H₂O：1.7 g/L(或ZnCl₂：0.7 g/L)，CoCl₂·6H₂O：3.7 g/L（或CoCl₂：2 g/L），MnSO₄·H₂O：1.6 g/L（或MnCl₂：1.67 g/L，或MnSO4·7H₂O：2.6 g/L），加水至1000 mL。

1mol/L檸檬酸緩沖液配制：檸檬酸：210 g，加NaOH(純度96%)約78 g，加水750 mL，冷卻后加水至1000 mL。

PDA固體培養(yǎng)基：用于里氏木霉的固體培養(yǎng)，含20 %土豆浸出液，2 %葡萄糖，1.5 % Agar。20%土豆浸出液作法如下：將土豆去皮切碎，每20 g土豆加水100 mL，煮沸30 min，用三層紗布過濾，加入葡萄糖后定容。篩選里氏木霉轉(zhuǎn)化子時加入終濃度為100 g/mL的潮霉素。

產(chǎn)酶培養(yǎng)基：50 g/L黃豆餅粉，70 g/L葡萄糖，10 g/L蛋白胨，100 ml/L Mandels營養(yǎng)鹽濃縮液，1 ml/L Mandels微量元素濃縮液，50 mL/L pH 4.5的1 mol/L的檸檬酸緩沖液，0.5 g/L吐溫80，加水到1000 ml。

二、高產(chǎn)熱穩(wěn)定性木聚糖酶xyn-LVK的里氏木霉基因工程菌的制備方法如下：

（1）合成依次由里氏木霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子、里氏木霉cbh1信號肽序列、木聚糖酶xyn-LVK基因序列和里氏木霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶終止子組成的表達(dá)框序列；表達(dá)框序列如下：

GACGCAGAAGAAGGAAATCGCCCCGCCGGTTCCGTAAAAAAAATATGAGCGCAGGGACAAGCACAGCCTTGGCCCTGGGCCTAGCCTTGCGCCTTGTTTGATGCAATCGGCGACATGTCGAATGCTGTAATTTTTTTTGTTTAGGTTCCCCTTTTCCTTTTGTGTTAATAATAATTCTCGAAGGGCGCTGATTTTGAAATTTGTCGGTGAGAGCCAAACGGATATACAGGCGCGGCTGATGAATAATGATGAATCGAGCTGACTTGATGCTGTATGTACAATATTGACTGCGAGGACCATCAGGTGTTGTATGGATGGAATCATTCTGTAACCACCAAGGTGCATGCATCATAAGGTATTCTCCTCAGCTCACCAACAACGAACGATGGCCATGTTAGTAAAGGCACCGTGATGGCAAGATAGAACCACTATTGCATCTGCGCTTCCCACGCACAGTACGTCAATGTAACGTCAAAGCCGCCCTCCCGTAACCTCGCCCGTTGTTGCTCCCCCCGATTGCCTCAATCACATAGTACCTACCTATGCATTATGGCGCCTCAACCCACCCCCCCAGATTGAGAGCTACCTTACATCAATATGGCCAGCACCTCTTCGGCGATACATACTCGCCACCCCAGCCGGGGCGATTGTGTGTACTAGGTAGGCTCGTACTATACCAGCAGGAGAGGTGCTGCTTGGCAATCGTGCTCAGCTGTTAGGTTGTACTTGTATGGTACTTGTAAGGTGGTCATGCAGTTGCTAAGGTACCTAGGGAGGGATTCAACGAGCCCTGCTTCCAATGTCCATCTGGATAGGATGGCGGCTGGCGGGGCCGAAGCTGGGAACTCGCCAACAGTCATATGTAATAGCTCAAGTTGATGATACCGTTTTGCCAGGATTAGGATGCGAGAAGCAGCATGAATGTCGCTCATCCGATGCCGCATCACCGTTGTGTCAGAAACGACCAAGCTAAGCAACTAAGGTACCTTACCGTCCACTATCTCAGGTAACCAGGTACTACCAGCTACCCTACCTGCCGTGCCTACCTGCTTTAGTATTAATCTTTCCACCTCCCTCCTCAATCTTCTTTTCCCTCCTCTCCTCTTTTTTTTTTCTTCCTCCTCTTCTTCTCCATAACCATTCCTAACAACATCGACATTCTCTCCTAATCACCAGCCTCGCAAATCCTCAGGTTAGTATTACTACTACTACAATCATCACCACGATGCTCCGCCCGACGATGCGGCTTCTGTTCGCCTGCCCCTCCTCTCACTCGTGCCCTTGACGAGCTACCCCGCCAGACTCTCCTGCGTCACCAATTTTTTTCCCTATTTACCCCTCCTCCCTCTCTCCCTCTCGTTTCTTCCTAACAAACAACCACCACCAAAATCTCTTTGGAAGCTCACGACTCACGCAAGCTCAATTCGCAGATACAAAATGTATCGGAAGTTGGCCGTCATCACGGCCTTCTTGGCCACAGCTCGTGCTCAAAGTTTCTGTAGTTCATGTTCTCACTCTTGTCAAAGTGTAAAGGTAACCGGCAACAAGGTTGGAACTATTGGTGGTGTTGGTTACGAATTATGGGCTGATAGTGGTAATAACAGTGCTACTTTCTATTCTTGTGGTTCCTTCTCATGTACTTTCCAAAATGCTGGGGATTACTTATGTCGTAGTGGTCTTTCTTTCGATAGTACTAAGACCCCATCTCAAATTGGTCGTATGAAGGCTGATTTCAAACTTGTCAAACAAAATAGTTCCAATGTTGGTTATTCCTATGTTGGTGTTTACGGTTGGACTAGAAGTCCACTTGTCGAATACTACATTGTCGATAATTGGCTTAGTCCATTCCCACCAGGTGATTGGGTTGGTAACAAGAAGCATGGTTCTTTCACTATTGATGGTGCTCAATACACTGTTTATGAAAACACTCGTACTGGTCCATCTATTGATGGTGATACCACCTTCAATCAATACTTTAGTATTCGTCAACAAGCTCGTGATTGTGGTACCATTGATATTTCTGCTCACTTTGATCAATGGGAAAAGCTTGGTATGACTATGGGTAAATTACATGAAGCCAAGGTTTTAGGTGAAGCCGGTAACGTTAACGGTGGTGCCAGTGGTACTGCTGATTTCTGTTACGCAAAGGTTTACATTGGTGATTAAGTGCTGTGTTCCTCAGAATGGGCCCCAGAAGGGCGTCGAGCATTGTCTATGAATGCAAACAAAAATAGTAAATAAATAGTAATTCTGGCCATGACGAATAGAGCCAATCTGCTCCACTTGACTATCCTTGTGACTGTATCGTATGTCGAACCCTTGACTGCCCATTCAAACAATTGTAAAGGAATATGAGCTACAAGTTATGTCTCACGTTTGCGTGCGAGCCCGTTTGTACGTTATTTTGAGAAAGCGTTGCCATCACATGCTCACAGTCACTTGGCTTACGATCATGTTTGCGATCTTTCGGTAAGAATACACAGAGTAACGATTATACATCCATCGCTTTCTATGATTAGGTACTCAGACAACACATGGGAAACAAGATAACCATCGCATGCAAGGTCGATTCCAATCATGATCTGGACTGGGGTATTCCATCTAAGCCATAGTACCCTCGAGAGAAGGAATGGTAGGACCTCTCAGGCGTCCACCATCTGTGCTGCAAATCCAAGAAACCCCCCAAAAGCACCTACCTATCTACCTAGAGTAATCTGCACGAGAAAAGAAAAGGAGCAGAAGAAGAATGATCTCAAGAGGCCGTGAACGCAGAAACACACTCCTCCCAACTTTTCAAGTTTTGAACAAAAAAAGAAAGATGAGGACTAGAAGATGGAGTATTTCCTTCTTAGAGAGCTCTCGGTGAGGTGACCTGTCAGGGTTTACCTCAAACCGTCTGTGGTTCTATCCAATTAATCAAGTCCCTCTCCTCTCCTCTTCTCTCCTGTCCTTTCATAGAATCCCTTTTCCTTGTTGCTTGATCGAAGCGGGTTATCGACGCCACCAAAGTATTGTCTTGGTGACTTATCAAATCCCTTTGGTGATCAAACAGCCCCCGAGTGATCAGATCCGTAA。

（2）利用PCR技術(shù)擴增表達(dá)框序列，然后利用限制性內(nèi)切酶EcoRI ，XbaI將表達(dá)框序列克隆至pUC19中，得到重組表達(dá)質(zhì)粒；重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建引物序列如下：

上游引物：CCGGAATTCGACGCAGAAGAAGGAAATCGCC（下劃線為EcoRI切位點），下游引物：GCTCTAGATTACGGATCTGATCACTCGGG（下劃線為，XbaI酶切位點）。

（3）將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行DNA測序，測序表明序列正確的轉(zhuǎn)化子用于大量制備重組表達(dá)質(zhì)粒。

（4）抽提重組表達(dá)質(zhì)粒，將10微克的重組表達(dá)質(zhì)粒和10微克的pAN7-1載體混勻，共轉(zhuǎn)里氏木霉原生質(zhì)體，涂布于5個含抗生素的PDA固體平板上，28℃培養(yǎng)兩天，待平板上長出菌絲，將菌絲轉(zhuǎn)接到新的含抗生素的PDA固體平板上，28℃培養(yǎng)五天；

（5）將長出的轉(zhuǎn)化子接種于不含抗生素的PDA固體平板上長孢子。

（6）將制得的孢子用無菌水制備孢子懸液，取10⁵個孢子接種于30ml的基本培養(yǎng)基中，28℃，250 r/min培養(yǎng)48小時后取1.5ml菌液后轉(zhuǎn)接到30ml的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，28℃，250 r/min培養(yǎng)196小時；取菌液，12,000×g 離心 5min，得上清液用于酶活性檢測，從中篩選出高木聚糖酶活性的轉(zhuǎn)化子，即得到高產(chǎn)熱穩(wěn)定性木聚糖酶xyn-LVK的里氏木霉基因工程菌。

三、里氏木霉基因工程菌在發(fā)酵罐水平的小試表達(dá)

里氏木霉基因工程菌發(fā)酵用5.0L發(fā)酵罐進(jìn)行實驗，將上述獲得的高木聚糖酶活性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行發(fā)酵水平發(fā)酵試驗，產(chǎn)酶培養(yǎng)基發(fā)酵罐裝液量3.0L，接裝液量5%～10%的搖瓶種子培養(yǎng)液。發(fā)酵條件：28℃，攪拌速度300～500rpm，通氣量0.5～1vvm，pH4.5。隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵上清液中木聚糖酶酶活力顯著增加，發(fā)酵170h后木聚糖酶活性可達(dá)101260 U/mL，菌體濕重達(dá)323g/L。

比較例：木聚糖酶xyn-LVK在畢赤酵母中的高效表達(dá)

實驗條件

（1）菌株與載體

畢赤酵母 GS115、載體 pPIC9K 購自 Invitrogen 公司；大腸桿菌DH5α 菌株已在《劉靜華，包英華，陳燕飛；大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的改進(jìn)，韶關(guān)學(xué)院學(xué)報，2008，29(03) ：87-90》文獻(xiàn)中公開，大腸桿菌DH5α 菌株的感受態(tài)細(xì)胞可通過供應(yīng)商天根生化科技( 北京) 有限公司購買，貨號CB101-03。

（2）酶類及其他生化試劑

內(nèi)切酶、連接酶購自TaKaRa公司，其它都為國產(chǎn)試劑。

（3）培養(yǎng)基

大腸桿菌培養(yǎng)基為LB（1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH7.0）。酵母培養(yǎng)基為YPD（1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖）。酵母篩選培養(yǎng)基為MD（2％葡萄糖，1.5%瓊脂粉，0.00004％生物素，1.34％YNB）、MM（0.5%甲醇（體積分?jǐn)?shù)），1.5%瓊脂粉，0.00004％生物素，1.34％YNB）、RDB（1M山梨醇，2％葡萄糖，0.00004％生物素，1.34％YNB ，0.005%氨基酸）。酵母誘導(dǎo)培養(yǎng)基 BMGY（1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％生物素、1％甘油（體積分?jǐn)?shù)））和BMMY（除以0.5％甲醇（體積分?jǐn)?shù)）代替甘油，其余成份相與 BMGY 相同）。

（4）表達(dá)載體的構(gòu)建及其在酵母的表達(dá)

以合成的木聚糖酶xyn-LVK基因為模板，設(shè)計合成了帶有EcoRI和NotI限制性酶切位點的引物xyn-LVK-F 和 xyn-LVK-R，對xyn-LVK的成熟蛋白的編碼區(qū)進(jìn)行擴增，并利用EcoRI和NotI酶切PCR產(chǎn)物，連接進(jìn)入表達(dá)載體 pPIC9K，使木聚糖酶xyn-LVK基因插入到上述表達(dá)載體的信號肽序列的下游，與信號肽形成正確的閱讀框架，構(gòu)建成酵母表達(dá)載體 pPIC9K-xyn-LVK，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α。陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行DNA測序，測序表明序列正確的轉(zhuǎn)化子用于大量制備重組質(zhì)粒。約5微克的用限制性內(nèi)切酶BglII進(jìn)行線性化的重組表達(dá)質(zhì)粒，電擊轉(zhuǎn)化酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，涂布于組氨酸缺陷性的 RDB 平板，30℃培養(yǎng)2-3天，挑取在RDB平板上生長的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行進(jìn)一步的表達(dá)實驗。

酵母表達(dá)引物序列如下 ：

xyn-LVK-F：CCGGAATTCCAAAGTTTCTGTAGTTCA（下劃線為EcoRI酶切位點）

xyn-LVK-R：ATAAGAATGCGGCCGCTTAATCACCAATGTAAACCTTTGCGTA（下劃線為NotI酶切位點）

（5）高木聚糖酶活性轉(zhuǎn)化子的篩選

用滅過菌的牙簽從長有轉(zhuǎn)化子的 RDB 平板上挑取單菌落， 按照編號先點到 MM 平板上，再點到相應(yīng)編號的MD平板上。將點有轉(zhuǎn)化子的MM、MD 平板置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2天，至菌落長出。按編號從 MD 平板上挑取轉(zhuǎn)化子接種于裝有BMGY培養(yǎng)基的搖瓶中，30℃、250rpm搖床培養(yǎng)約48h；將搖瓶中培養(yǎng)48h的菌液3,000×g離心15min，去上清，改用含有體積分?jǐn)?shù)為0.5％的甲醇的BMMY培養(yǎng)基，在30℃、260rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)；誘導(dǎo)培養(yǎng)48h后，取菌液，3,000×g 離心 5min， 取上清液用于酶活性檢測，從中篩選出高木聚糖酶活性的轉(zhuǎn)化子。

（6）高木聚糖酶活性轉(zhuǎn)化子在發(fā)酵罐水平的小試表達(dá)

高細(xì)胞密度發(fā)酵用5L發(fā)酵罐進(jìn)行實驗，按照Invirogen公司的畢赤酵母發(fā)酵過程指導(dǎo)（Pichia Fermentation Process Guidelines）操作。將上述獲得的高木聚糖酶活性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行發(fā)酵水平高密度發(fā)酵試驗。隨著甲醇誘導(dǎo)時間的延長，發(fā)酵上清液中木聚糖酶酶活力顯著增加，誘導(dǎo)180h后木聚糖酶活性可達(dá)72325 U/mL，菌體濕重達(dá)413g/L。

實施例與比較例相比，里氏木霉基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶xyn-LVK的產(chǎn)量顯著提升，產(chǎn)量提升約40%。

盡管本發(fā)明的具體實施方式已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。

序列表

<110> 深圳市綠微康生物工程有限公司

<120> 高產(chǎn)熱穩(wěn)定性木聚糖酶的里氏木霉基因工程菌的制備方法

<130> LVK201502

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 225

<212> PRT

<213> 瘤胃真菌（Neocallimastix patriciarum）

<400> 1

Gln Ser Phe Cys Ser Ser Cys Ser His Ser Cys Gln Ser Val Lys Val

1 5 10 15

Thr Gly Asn Lys Val Gly Thr Ile Gly Gly Val Gly Tyr Glu Leu Trp

20 25 30

Ala Asp Ser Gly Asn Asn Ser Ala Thr Phe Tyr Ser Cys Gly Ser Phe

35 40 45

Ser Cys Thr Phe Gln Asn Ala Gly Asp Tyr Leu Cys Arg Ser Gly Leu

50 55 60

Ser Phe Asp Ser Thr Lys Thr Pro Ser Gln Ile Gly Arg Met Lys Ala

65 70 75 80

Asp Phe Lys Leu Val Lys Gln Asn Ser Ser Asn Val Gly Tyr Ser Tyr

85 90 95

Val Gly Val Tyr Gly Trp Thr Arg Ser Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile

100 105 110

Val Asp Asn Trp Leu Ser Pro Phe Pro Pro Gly Asp Trp Val Gly Asn

115 120 125

Lys Lys His Gly Ser Phe Thr Ile Asp Gly Ala Gln Tyr Thr Val Tyr

130 135 140

Glu Asn Thr Arg Thr Gly Pro Ser Ile Asp Gly Asp Thr Thr Phe Asn

145 150 155 160

Gln Tyr Phe Ser Ile Arg Gln Gln Ala Arg Asp Cys Gly Thr Ile Asp

165 170 175

Ile Ser Ala His Phe Asp Gln Trp Glu Lys Leu Gly Met Thr Met Gly

180 185 190

Lys Leu His Glu Ala Lys Val Leu Gly Glu Ala Gly Asn Val Asn Gly

195 200 205

Gly Ala Ser Gly Thr Ala Asp Phe Cys Tyr Ala Lys Val Tyr Ile Gly

210 215 220

Asp

225

<210> 2

<211> 678

<212> DNA

<213> 瘤胃真菌（Neocallimastix patriciarum）

<400> 2

caaagtttct gtagttcatg ttctcactct tgtcaaagtg taaaggtaac cggcaacaag 60

gttggaacta ttggtggtgt tggttacgaa ttatgggctg atagtggtaa taacagtgct 120

actttctatt cttgtggttc cttctcatgt actttccaaa atgctgggga ttacttatgt 180

cgtagtggtc tttctttcga tagtactaag accccatctc aaattggtcg tatgaaggct 240

gatttcaaac ttgtcaaaca aaatagttcc aatgttggtt attcctatgt tggtgtttac 300

ggttggacta gaagtccact tgtcgaatac tacattgtcg ataattggct tagtccattc 360

ccaccaggtg attgggttgg taacaagaag catggttctt tcactattga tggtgctcaa 420

tacactgttt atgaaaacac tcgtactggt ccatctattg atggtgatac caccttcaat 480

caatacttta gtattcgtca acaagctcgt gattgtggta ccattgatat ttctgctcac 540

tttgatcaat gggaaaagct tggtatgact atgggtaaat tacatgaagc caaggtttta 600

ggtgaagccg gtaacgttaa cggtggtgcc agtggtactg ctgatttctg ttacgcaaag 660

gtttacattg gtgattaa 678

<210> 3

<211> 1437

<212> DNA

<213> 里氏木霉（Trichoderma reesei）

<400> 3

gacgcagaag aaggaaatcg ccccgccggt tccgtaaaaa aaatatgagc gcagggacaa 60

gcacagcctt ggccctgggc ctagccttgc gccttgtttg atgcaatcgg cgacatgtcg 120

aatgctgtaa ttttttttgt ttaggttccc cttttccttt tgtgttaata ataattctcg 180

aagggcgctg attttgaaat ttgtcggtga gagccaaacg gatatacagg cgcggctgat 240

gaataatgat gaatcgagct gacttgatgc tgtatgtaca atattgactg cgaggaccat 300

caggtgttgt atggatggaa tcattctgta accaccaagg tgcatgcatc ataaggtatt 360

ctcctcagct caccaacaac gaacgatggc catgttagta aaggcaccgt gatggcaaga 420

tagaaccact attgcatctg cgcttcccac gcacagtacg tcaatgtaac gtcaaagccg 480

ccctcccgta acctcgcccg ttgttgctcc ccccgattgc ctcaatcaca tagtacctac 540

ctatgcatta tggcgcctca acccaccccc ccagattgag agctacctta catcaatatg 600

gccagcacct cttcggcgat acatactcgc caccccagcc ggggcgattg tgtgtactag 660

gtaggctcgt actataccag caggagaggt gctgcttggc aatcgtgctc agctgttagg 720

ttgtacttgt atggtacttg taaggtggtc atgcagttgc taaggtacct agggagggat 780

tcaacgagcc ctgcttccaa tgtccatctg gataggatgg cggctggcgg ggccgaagct 840

gggaactcgc caacagtcat atgtaatagc tcaagttgat gataccgttt tgccaggatt 900

aggatgcgag aagcagcatg aatgtcgctc atccgatgcc gcatcaccgt tgtgtcagaa 960

acgaccaagc taagcaacta aggtacctta ccgtccacta tctcaggtaa ccaggtacta 1020

ccagctaccc tacctgccgt gcctacctgc tttagtatta atctttccac ctccctcctc 1080

aatcttcttt tccctcctct cctctttttt ttttcttcct cctcttcttc tccataacca 1140

ttcctaacaa catcgacatt ctctcctaat caccagcctc gcaaatcctc aggttagtat 1200

tactactact acaatcatca ccacgatgct ccgcccgacg atgcggcttc tgttcgcctg 1260

cccctcctct cactcgtgcc cttgacgagc taccccgcca gactctcctg cgtcaccaat 1320

ttttttccct atttacccct cctccctctc tccctctcgt ttcttcctaa caaacaacca 1380

ccaccaaaat ctctttggaa gctcacgact cacgcaagct caattcgcag atacaaa 1437

<210> 4

<211> 51

<212> DNA

<213> 里氏木霉（Trichoderma reesei）

<400> 4

atgtatcgga agttggccgt catcacggcc ttcttggcca cagctcgtgc t 51

<210> 5

<211> 909

<212> DNA

<213> 里氏木霉（Trichoderma reesei）

<400> 5

gtgctgtgtt cctcagaatg ggccccagaa gggcgtcgag cattgtctat gaatgcaaac 60

aaaaatagta aataaatagt aattctggcc atgacgaata gagccaatct gctccacttg 120

actatccttg tgactgtatc gtatgtcgaa cccttgactg cccattcaaa caattgtaaa 180

ggaatatgag ctacaagtta tgtctcacgt ttgcgtgcga gcccgtttgt acgttatttt 240

gagaaagcgt tgccatcaca tgctcacagt cacttggctt acgatcatgt ttgcgatctt 300

tcggtaagaa tacacagagt aacgattata catccatcgc tttctatgat taggtactca 360

gacaacacat gggaaacaag ataaccatcg catgcaaggt cgattccaat catgatctgg 420

actggggtat tccatctaag ccatagtacc ctcgagagaa ggaatggtag gacctctcag 480

gcgtccacca tctgtgctgc aaatccaaga aaccccccaa aagcacctac ctatctacct 540

agagtaatct gcacgagaaa agaaaaggag cagaagaaga atgatctcaa gaggccgtga 600

acgcagaaac acactcctcc caacttttca agttttgaac aaaaaaagaa agatgaggac 660

tagaagatgg agtatttcct tcttagagag ctctcggtga ggtgacctgt cagggtttac 720

ctcaaaccgt ctgtggttct atccaattaa tcaagtccct ctcctctcct cttctctcct 780

gtcctttcat agaatccctt ttccttgttg cttgatcgaa gcgggttatc gacgccacca 840

aagtattgtc ttggtgactt atcaaatccc tttggtgatc aaacagcccc cgagtgatca 900

gatccgtaa 909