本發(fā)明涉及在原核宿主細(xì)胞中可表達(dá)的載體，其包含麥芽糖可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子用于編碼例如多肽、重組蛋白的核酸的異源表達(dá)。具體的，本發(fā)明涉及用于在宿主中進(jìn)行異源表達(dá)的新的載體，其包含可操作地連接于轉(zhuǎn)錄單元的麥芽糖操縱子的啟動(dòng)子區(qū)域，所述轉(zhuǎn)錄單元包含對(duì)于所述宿主而言為異源的核酸序列，而所述核酸序列的表達(dá)受到所述麥芽糖操縱子的啟動(dòng)子區(qū)域的控制。此外，本發(fā)明涉及利用這些載體用于異源編碼表達(dá)例如多肽、重組蛋白的核酸的用途。

背景技術(shù)：

多肽及重組蛋白的異源表達(dá)生產(chǎn)在蛋白質(zhì)工程中具有重要的意義，其中利用原核生物進(jìn)行多肽及重組蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)具有蛋白表達(dá)量高、發(fā)酵密度大、發(fā)酵成本低廉等優(yōu)勢(shì)。

目前在原核細(xì)胞中建立的表達(dá)載體以及表達(dá)系統(tǒng)很多，其中利用誘導(dǎo)物進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)因其表達(dá)強(qiáng)度高、表達(dá)時(shí)間可控等優(yōu)勢(shì)而被用于建立相應(yīng)的誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，例如革蘭氏陰性菌大腸桿菌中的T7、阿拉伯糖(Arabinose)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，革蘭氏陽(yáng)性菌芽孢桿菌中的木糖誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)等。

這些系統(tǒng)中通過(guò)將可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子序列連接于目標(biāo)蛋白核酸序列，構(gòu)建含有目標(biāo)蛋白核酸序列的誘導(dǎo)型表達(dá)載體，并通過(guò)將此誘導(dǎo)型表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌進(jìn)行不同條件下的培養(yǎng)，在未添加誘導(dǎo)物的培養(yǎng)條件下，阻遏子與啟動(dòng)子結(jié)合并阻止目的基因的轉(zhuǎn)錄，或者另一種情況下激活子由于缺乏誘導(dǎo)物無(wú)法結(jié)合于啟動(dòng)子上激活目的基因的轉(zhuǎn)錄；在添加適當(dāng)誘導(dǎo)物的培養(yǎng)條件下，阻遏子被誘導(dǎo)物失活從而轉(zhuǎn)錄被起始，或者另一種情況下誘導(dǎo)物與激活子結(jié)合后激活啟動(dòng)子，從而目的基因轉(zhuǎn)錄被起始。

目前典型的誘導(dǎo)物可以是原核宿主細(xì)胞代謝所需的底物，例如不同種類的糖。然而某些誘導(dǎo)物如半乳糖類似物IPTG、四環(huán)素等具有細(xì)胞毒性，某些誘導(dǎo)物如乳糖、阿拉伯糖、木糖等價(jià)格較為昂貴，限制了相應(yīng)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)在大規(guī)模多肽及重組蛋白工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明通過(guò)提供一種新型的在原核宿主中的表達(dá)載體，所述的新載體包含 可操作的連接于轉(zhuǎn)錄單元的麥芽糖操縱子的啟動(dòng)子區(qū)或其互補(bǔ)序列或突變體序列，所述轉(zhuǎn)錄單元包含對(duì)于所述宿主而言為異源的核酸序列，而所述核酸序列的表達(dá)受到所述麥芽糖操縱子的啟動(dòng)子區(qū)的控制。

本發(fā)明還提供了多種用于所述新型表達(dá)載體進(jìn)行異源表達(dá)的宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞經(jīng)過(guò)分子遺傳學(xué)改造，包括缺失了6-磷酸麥芽糖水解酶基因MalA、6-磷酸麥芽糖水解酶基因及其3’端后方的莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列、α-葡萄糖苷酶基因MalL、麥芽糖磷酸化酶基因yvdK的單一基因缺失菌株或組合基因缺失菌株；同時(shí)包括麥芽糖轉(zhuǎn)錄激活因子基因MalR、麥芽糖磷酸化轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因MalP單一基因增強(qiáng)表達(dá)或組合增強(qiáng)表達(dá)的菌株。

本發(fā)明還通過(guò)新的表達(dá)載體提供了核酸序列在原核宿主中的異源表達(dá)用途，即將需進(jìn)行表達(dá)的分離純化的核酸序列連接至所述的新的表達(dá)載體中，其包含麥芽糖操縱子的啟動(dòng)子區(qū)域，將構(gòu)建的攜帶分離純化的核酸序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至原核宿主細(xì)胞，通過(guò)改變培養(yǎng)條件在宿主細(xì)胞中生產(chǎn)多肽及重組蛋白的方法。

附圖說(shuō)明

圖1：是來(lái)源于枯草芽孢桿菌(B.subtilis)的麥芽糖操縱子的MalA啟動(dòng)子區(qū)域的核酸序列及結(jié)構(gòu)，其中轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)以星號(hào)表示，推定的-35區(qū)域和-10區(qū)域以方框表示，推定的cre序列以虛線表示，核糖體結(jié)合序列以下劃線表示，MalA基因起點(diǎn)以箭頭表示。

圖2：是用于檢測(cè)麥芽糖啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度的載體pDG的質(zhì)粒圖譜。

圖3：是本發(fā)明的表達(dá)載體pMATE-rep和pMATE-int的質(zhì)粒圖譜。

圖4：是包含攜帶不同麥芽糖啟動(dòng)子突變體質(zhì)粒pDG的枯草芽孢桿菌1A751的綠色熒光蛋白熒光信號(hào)強(qiáng)度(RFU)作圖。

圖5：是包含攜帶不同麥芽糖啟動(dòng)子突變體質(zhì)粒pDG的枯草芽孢桿菌1A751遺傳改造菌株的綠色熒光蛋白熒光信號(hào)強(qiáng)度(RFU)作圖。

圖6：是質(zhì)粒pDG的構(gòu)建流程圖。

圖7：是質(zhì)粒pMATE-rep和pMATE-int的構(gòu)建流程圖。

圖8：是攜帶有表達(dá)綠色熒光蛋白基因GFP基因的pMATE-int質(zhì)粒的枯草芽孢桿菌1A751的SDS-PAGE圖。

圖9：是攜帶有表達(dá)綠色熒光蛋白基因GFP基因的pMATE-rep質(zhì)粒的枯草芽 孢桿菌1A751的SDS-PAGE圖。

具體實(shí)施方式

如果沒(méi)有其它說(shuō)明，則使用的是如下的材料和方法：

細(xì)菌菌株和生長(zhǎng)條件：

大腸桿菌DH5α和枯草芽抱桿菌1A751(BGSC，USA)用作主要宿主，用于克隆和表達(dá)。大腸桿菌于37℃生長(zhǎng)于LB液體培養(yǎng)基(Luria S.E.等人,Virology 12,1960,348-390)和LB瓊脂平板，其中補(bǔ)充了100μg/ml氨芐青霉素?？莶菅挎邨U菌于37℃生長(zhǎng)于LB液體培養(yǎng)基和SR發(fā)酵培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基和瓊脂平板分別補(bǔ)充了20μg/ml卡那霉素或5μg/ml氯霉素。為了誘導(dǎo)麥芽糖啟動(dòng)子，加入無(wú)菌過(guò)濾的或高壓滅菌的D-麥芽糖至1％(w/v)的最終濃度。

材料：

所有的化學(xué)品都獲自Sigma-Aldrich或Merck。合成的DNA寡核昔酸購(gòu)自金唯智Genewiz。限制性酶和DNA修飾酶購(gòu)自New England Biolabs.。以來(lái)自Fermentas的高保真DNA聚合酶在來(lái)自Eppendorf的熱循環(huán)儀上進(jìn)行PCR。

DNA的制備和轉(zhuǎn)化：

使用Tiangen或Omega的DNA制備試劑盒，根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書，從大腸桿菌和枯草芽抱桿菌或從瓊脂糖凝膠分離DNA。在所有實(shí)施例中均使用標(biāo)準(zhǔn)的分子技術(shù)。使用如Chung C.T.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,1989,21722175描述的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌。根據(jù)改進(jìn)的“Paris方法”(HarwoodC.R.Molecular Biological Methods for Bacillus,1990,John Wiley&Sons Ltd.,England)，使用質(zhì)粒DNA或DNA片段轉(zhuǎn)化枯草芽抱桿菌。

綠色熒光蛋白熒光強(qiáng)度RFU的測(cè)定：

將培養(yǎng)至OD600約為0.6-0.8的待測(cè)菌株于4℃，4000rpm離心10分鐘收集菌體，用預(yù)冷的PBS溶液洗滌菌體2次，轉(zhuǎn)移150μL至96孔黑色底透酶標(biāo)板(Corning,USA)中，放置于微孔板SpectraMax M2酶標(biāo)儀(Molecular Devices,USA)于室溫條件下483nm/525nm激發(fā)并檢測(cè)熒光發(fā)射光強(qiáng)度RFU，于600nm測(cè)定菌體濃度，熒光強(qiáng)度計(jì)算按照RFU/OD600計(jì)算。

定點(diǎn)突變或隨機(jī)突變：

使用Strategene的Qucikchange II質(zhì)粒DNA突變?cè)噭┖?，根?jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書，對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行定點(diǎn)突變或基于簡(jiǎn)并引物的隨機(jī)突變。突變引物的上/ 下游引物為反向互補(bǔ)序列，在突變位點(diǎn)5’端設(shè)計(jì)不少于8個(gè)與模板DNA匹配的核苷酸，在突變位點(diǎn)3’端設(shè)計(jì)不少于12個(gè)與模板DNA匹配的核苷酸。突變PCR的程序與常規(guī)PCR相似但略有改動(dòng)，反應(yīng)循環(huán)數(shù)依據(jù)突變位點(diǎn)的多少進(jìn)行調(diào)節(jié)，突變位點(diǎn)≤3個(gè)，循環(huán)數(shù)為12；4≤突變位點(diǎn)≤6個(gè)，循環(huán)數(shù)為16；突變位點(diǎn)≥6個(gè)，循環(huán)數(shù)為20。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)DpnI限制性內(nèi)切酶酶切后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到的轉(zhuǎn)化子經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后提取質(zhì)粒DNA留存。

枯草芽孢桿菌基因無(wú)痕敲除：

根據(jù)改進(jìn)的“基于AraR的枯草芽孢桿菌基因敲除方法”(Liu S,Endo K,et al.Microbiology.2008；154(Pt 9):2562–2570.)進(jìn)行基因無(wú)痕敲除。首先利用同源重組原理將攜帶同源臂的受阿拉伯糖啟動(dòng)子調(diào)控的壯觀霉素抗性基因片段“P_ara-spc”通過(guò)轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌1A751菌株中，替換基因組上的AraR基因，構(gòu)建原始的基因敲除原始菌，其帶有壯觀霉素抗性。需要敲除基因X時(shí)，分別克隆X基因的上游1Kb片段(命名為UP)、下游1Kb片段(命名為DN)、待敲除基因X片段(命名為G)以及帶有AraR基因和氯霉素抗性基因cat的篩選片段(命名為CR)，利用overlap-PCR方法將上述4個(gè)片段以“UP-DN-CR-G”的順序融合為一個(gè)片段，并通過(guò)轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌1A751中進(jìn)行同源重組，以氯霉素抗性篩選轉(zhuǎn)化子。將得到的轉(zhuǎn)化子在壯觀霉素抗性LB平板上驗(yàn)證，選取在氯霉素上生長(zhǎng)、而在壯觀霉素上不生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子作為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子在無(wú)抗性的LB培養(yǎng)基中以37℃，200rpm培養(yǎng)16小時(shí)，取10uL菌液涂布于壯觀霉素抗性平板上進(jìn)行篩選，將得到的轉(zhuǎn)化子通過(guò)菌落PCR進(jìn)行驗(yàn)證，確定基因是否敲除。將菌落PCR驗(yàn)證正確的菌株作為敲除X基因的菌株進(jìn)行保存。

所用到的寡核苷酸：

表1

實(shí)施例1缺失啟動(dòng)子序列并攜帶綠色熒光蛋白GFP的pDG載體的構(gòu)建。

以枯草芽孢桿菌中常用的整合型質(zhì)粒pDL(BGSC，USA)為骨架，利用CPEC PCR cloning方法(Nature Protocols,6,242–251,2011,doi:10.1038/nprot.2010.181)將pDL質(zhì)粒上的bgaB基因替換為GFP基因，具體 方法為在pDL質(zhì)粒的bgaB基因上下游分別設(shè)計(jì)引物pDG-vector.for/pDG-vector.rev反向PCR擴(kuò)增pDL質(zhì)粒，同時(shí)設(shè)計(jì)引物gfp-insert.for/gfp-insert.rev從pSG1729質(zhì)粒(BGSC，USA)上PCR擴(kuò)增gfp基因，其中g(shù)fp-insert.for/gfp-insert.rev引物的5’末端分別帶有pDL質(zhì)粒目的插入位點(diǎn)兩側(cè)20bp的同源序列。將擴(kuò)增得到的gfp插入片段和pDL載體片段切膠回收后，按照摩爾比1:1的比例添加到PCR體系中進(jìn)行PCR反應(yīng)，所得的PCR產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，利用氨芐青霉素抗性篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒后送金唯智公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pDG，圖譜結(jié)果見(jiàn)圖2，圖6為pDG質(zhì)粒的構(gòu)建流程。

實(shí)施例2來(lái)源于枯草芽孢桿菌的麥芽糖操縱子的MalA啟動(dòng)子的分離與鑒定。

(一)來(lái)源于枯草芽孢桿菌的麥芽糖操縱子的MalA啟動(dòng)子的分離。

采用Tiangen的細(xì)菌染色體提取試劑盒(Beijing，China)分離提取枯草芽孢桿菌1A751的染色體DNA。使用引物Pglv.for/Pglv.rev從枯草芽孢桿菌1A751的染色體DNA中通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得yfiA與MalA基因間約340bp的DNA片段。將此片段通過(guò)BanHI/KpnI位點(diǎn)克隆于所述的pDG質(zhì)粒綠色熒光蛋白GFP基因的上游，獲得了攜帶有來(lái)源于枯草芽孢桿菌的麥芽糖操縱子MalA啟動(dòng)子的pDG質(zhì)粒，命名為pDG-G1。

(二)麥芽糖操縱子MalA啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)鑒定。

根據(jù)測(cè)序所得的MalA啟動(dòng)子序列SEQ ID NO：1，利用在線原核生物啟動(dòng)子預(yù)測(cè)分析軟件BPROM(V.Solovyev,A Salamov,2011,Nova Science Publishers,p.61-78)對(duì)MalA啟動(dòng)子進(jìn)行分析，分別標(biāo)注出啟動(dòng)子序列中-35區(qū)、-10區(qū)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS以及cre元件，結(jié)果顯示于圖1。

(三)麥芽糖操縱子MalA啟動(dòng)子中轉(zhuǎn)錄激活因子MalR結(jié)合位點(diǎn)序列的鑒定。

來(lái)源于枯草芽孢桿菌的麥芽糖操縱子MalA啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始有賴于誘導(dǎo)物麥芽糖和轉(zhuǎn)錄激活因子MalR的同時(shí)存在，轉(zhuǎn)錄激活因子MalR結(jié)合啟動(dòng)子DNA序列后激活啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，若啟動(dòng)子缺失了與轉(zhuǎn)錄激活因子MalR的結(jié)合序列，則啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性無(wú)法激活。為了定位枯草芽孢桿菌麥芽糖操縱子MalA啟動(dòng)子中轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)合位點(diǎn)序列，根據(jù)實(shí)驗(yàn)2中MalA啟動(dòng)子序列 結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果，在pDG-G1質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，從啟動(dòng)子序列起始處至-35區(qū)序列之前，以18bp為單位分別缺失此區(qū)域間的啟動(dòng)子序列，構(gòu)建啟動(dòng)子缺失突變體，轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌1A751并通過(guò)檢測(cè)培養(yǎng)后菌體的熒光強(qiáng)度，判斷缺失DNA序列對(duì)MalA啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄激活能力的影響，若缺失后菌體無(wú)熒光信號(hào)，則說(shuō)明此片段包含轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)合位點(diǎn)，從而確定轉(zhuǎn)錄激活因子MalR在MalA啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn)序列。最終獲得的轉(zhuǎn)錄激活因子MalR在MalA啟動(dòng)子的結(jié)合位點(diǎn)序列見(jiàn)SEQ ID NO：2。

實(shí)施例3整合型表達(dá)載體pMATE-int的構(gòu)建。

構(gòu)建了含有來(lái)源于枯草芽孢桿菌的麥芽糖操縱子MalA啟動(dòng)子或其突變體的，能夠整合在枯草芽孢桿菌基因組amyE基因位點(diǎn)的整合型表達(dá)載體并命名為pMATE-int。構(gòu)建方法為：以pDL質(zhì)粒(BGSC，USA)為基礎(chǔ)，以KpnI和BamHI切割來(lái)源于枯草芽孢桿菌的麥芽糖操縱子MalA啟動(dòng)子或其突變體DNA片段并連入pDL質(zhì)粒。使用寡核苷酸pMATE-int-vector.for/pMATE-int-vector.rev和superMCS-insert.for/superMCS-insert.rev分別擴(kuò)增質(zhì)粒骨架和插入片段，以實(shí)施例1中的CPEC PCR cloning方法將質(zhì)粒上的bgaB基因替換為來(lái)源于pSE420質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)superMCS片段，構(gòu)建出整合型表達(dá)載體pMATE-int，質(zhì)粒圖譜見(jiàn)圖3，質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖6，所使用的寡核苷酸如表1所示。

實(shí)施例4復(fù)制型表達(dá)載體pMATE-rep的構(gòu)建。

構(gòu)建了含有來(lái)源于枯草芽孢桿菌的麥芽糖操縱子MalA啟動(dòng)子或其突變體的，能夠在枯草芽孢桿菌和大腸桿菌中復(fù)制的穿梭表達(dá)載體并命名為pMATE-rep。構(gòu)建方法為：以帶有pUB110復(fù)制子的pMA5質(zhì)粒為骨架，利用寡核苷酸pMATE-rep-vector.for/pMATE-rep-vector.rev和PmalA-insert.for/PmalA-insert.rev分別擴(kuò)增質(zhì)粒骨架和來(lái)源于枯草芽孢桿菌麥芽糖操縱子MalA啟動(dòng)子或其突變體的插入片段，以實(shí)施例1中的CPEC PCR cloning方法將MalA啟動(dòng)子插入pMA5載體中。同時(shí)按照實(shí)施例3中的方法，將來(lái)源于pSE420質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)superMCS片段插入MalA啟動(dòng)子或其突變體后，構(gòu)建出復(fù)制型表達(dá)載體pMATE-rep，質(zhì)粒圖譜見(jiàn)圖3，質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖6，所使用的寡核苷酸如表1所示。

實(shí)施例5來(lái)源于枯草芽孢桿菌的麥芽糖操縱子MalA啟動(dòng)子的突變體篩選。

以實(shí)施例1中的pDG載體為基礎(chǔ)，通過(guò)定點(diǎn)突變或隨機(jī)突變構(gòu)建來(lái)源于枯 草芽孢桿菌的麥芽糖操縱子MalA啟動(dòng)子的突變體文庫(kù)，轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌后通過(guò)檢測(cè)啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)的綠色熒光蛋白基因gfp來(lái)評(píng)價(jià)MalA啟動(dòng)子突變體轉(zhuǎn)錄活性的高低。具體方法為，利用定點(diǎn)突變技術(shù)(Strategene,USA)設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變引物或簡(jiǎn)并引物，針對(duì)MalA啟動(dòng)子的-35區(qū)、-15區(qū)、-10區(qū)、RBS區(qū)、cre區(qū)、轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合位點(diǎn)(operator)區(qū)域進(jìn)行定點(diǎn)突變或簡(jiǎn)并引物隨機(jī)突變PCR，構(gòu)建帶有不同質(zhì)粒文庫(kù)，所用到的寡核苷酸如表2所示。

將獲得的定點(diǎn)突變質(zhì)粒以PstI限制性內(nèi)切酶酶切線性化后轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌1A751，利用帶有氯霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基平板進(jìn)行篩選，所獲得的轉(zhuǎn)化子經(jīng)過(guò)PCR驗(yàn)證正確后保存。經(jīng)劃線培養(yǎng)活化后挑取單克隆接種于含有0.5mL培養(yǎng)基的96孔深孔板中進(jìn)行過(guò)夜發(fā)酵。次日，吸取5μL過(guò)夜培養(yǎng)物分別接種于不含/含有1％(w/w)麥芽糖誘導(dǎo)物的新鮮LB培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，而后以攜帶未突變的MalA啟動(dòng)子的GFP表達(dá)菌株作為對(duì)照，進(jìn)行熒光強(qiáng)度的測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4A。

將獲得的兼并引物隨機(jī)突變質(zhì)粒文庫(kù)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α并涂布于抗性平板，培養(yǎng)后利用細(xì)胞刮子將平板上的菌落刮下并重懸于新鮮LB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，而后提取帶有不同MalA啟動(dòng)子突變體的pDG混合質(zhì)粒，PstI限制性內(nèi)切酶酶切線性化后轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌1A751，利用帶有氯霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基平板進(jìn)行篩選，得到單拷貝整合于枯草芽孢桿菌基因組上的受不同MalA啟動(dòng)子突變體誘導(dǎo)的GFP表達(dá)菌株。將此GFP表達(dá)菌株經(jīng)含有1％(w/w)麥芽糖誘導(dǎo)物的LB培養(yǎng)活化后，取1mL新鮮菌液于4℃，12000rpm離心2分鐘收集菌體，以磷酸鹽緩沖溶液PBS重懸洗滌菌體3次，用等體積PBS緩沖液重懸后稀釋50倍，利用流式細(xì)胞儀(Beckman,USA)進(jìn)行FACS單細(xì)胞綠色熒光分選，選取RFU熒光值最高的1％細(xì)胞進(jìn)行收集。將收集到的細(xì)胞重復(fù)上述FACS分選過(guò)程2次以獲得穩(wěn)定的受不同MalA啟動(dòng)子突變體誘導(dǎo)的GFP表達(dá)菌株。將此單細(xì)胞菌株接種于含有150μL新鮮LB培養(yǎng)基的96孔板(Corning,USA)中過(guò)夜培養(yǎng)，次日，吸取5μL過(guò)夜培養(yǎng)物分別接種于不含/含有1％(w/w)麥芽糖誘導(dǎo)物的新鮮LB培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，而后以攜帶未突變的MalA啟動(dòng)子的GFP表達(dá)菌株作為對(duì)照，進(jìn)行熒光強(qiáng)度的測(cè)定。根據(jù)測(cè)定結(jié)果選取熒光強(qiáng)度明顯增高的15株菌株，提取基因組擴(kuò)增MalA啟動(dòng)子片段序列進(jìn)行測(cè)序，以獲得突變序列的位點(diǎn)信息，將此15個(gè)MalA啟動(dòng)子命名為^mut01PmalA-^mut015PmalA。 熒光強(qiáng)度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4B，MalA啟動(dòng)子突變體的序列見(jiàn)SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：17。

表2

實(shí)施例6來(lái)源于枯草芽孢桿菌的麥芽糖操縱子MalA啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度優(yōu)化。

根據(jù)文獻(xiàn)(Yamamoto,H.,et al.Journal of bacteriology 183(17):5110-5121.2001)報(bào)道，通過(guò)突變枯草芽孢桿菌麥芽糖操縱子的MalA啟動(dòng)子cre元件的第六位和第七位核苷酸(即枯草芽孢桿菌MalA啟動(dòng)子序列的315和316位)的“CG”為“AT”，可以部分解除在葡萄糖存在下對(duì)麥芽糖MalA啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的抑制效應(yīng)。此外，根據(jù)實(shí)施例5中針對(duì)MalA啟動(dòng)子的-35區(qū)、-15區(qū)、-10區(qū)、RBS區(qū)域的點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果，具有-10區(qū)A303T突變的啟動(dòng)子在保持嚴(yán)謹(jǐn)性的同時(shí)提高了轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度，因此利用點(diǎn)突變技術(shù)，將上述C315A、G316T和A303T突變引入pDG質(zhì)粒，構(gòu)建出pDG2基礎(chǔ)突變質(zhì)粒。根據(jù)流式細(xì)胞儀FACS 篩選結(jié)果，其中有15株攜帶有枯草芽孢桿菌麥芽糖操縱子MalA啟動(dòng)子突變子pDG質(zhì)粒的菌株具有明顯增高的熒光強(qiáng)度，測(cè)序后獲得了其麥芽糖操縱子MalA啟動(dòng)子突變位點(diǎn)信息(序列見(jiàn)SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：17)。結(jié)果表明，突變位點(diǎn)主要發(fā)生在啟動(dòng)子的209、210、212、216、217、219-225位、227和228位，特別的，當(dāng)突變?yōu)镚209T、A210T、A212T、C216T、C217T、G219M、C220K、C222T和A224T位點(diǎn)后突變子的轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。在pDG2質(zhì)粒的基礎(chǔ)上對(duì)上述突變位點(diǎn)進(jìn)行組合突變與熒光強(qiáng)度篩選，獲得了具有更高轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度的MalA啟動(dòng)子突變體，序列見(jiàn)SEQ ID NO：18-SEQ ID NO：32。

實(shí)施例7枯草芽孢桿菌表達(dá)宿主菌株的遺傳改造與構(gòu)建。

利用前文所述的基因組無(wú)痕敲除法分別對(duì)枯草芽孢桿菌1A751基因組DNA中的MalA基因、MalA基因及其3’端一段類似于終止子的莖環(huán)結(jié)構(gòu)(MalA-term)、Yvdk-MalL基因進(jìn)行敲除，構(gòu)建枯草芽孢桿菌基因敲除突變體MATE02-MATE06，其目的是增強(qiáng)菌體對(duì)麥芽糖誘導(dǎo)物的敏感性，延長(zhǎng)麥芽糖誘導(dǎo)時(shí)間并減少麥芽糖誘導(dǎo)物用量。同時(shí)，以實(shí)施例3構(gòu)建的整合性表達(dá)載體pMATE-int為基礎(chǔ)，在多克隆位點(diǎn)后面處分別插入受枯草芽孢桿菌MalA啟動(dòng)子調(diào)控的MalR基因及MalR-MalP基因，并通過(guò)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入已構(gòu)建的枯草芽孢表達(dá)1A751宿主菌中，利用帶有氯霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基平板進(jìn)行篩選，所獲得的轉(zhuǎn)化子經(jīng)過(guò)PCR驗(yàn)證正確后保存，獲得遺傳改造菌株MATE07-MATE018。同步的，以復(fù)制型表達(dá)載體pMA5為基礎(chǔ)，在多克隆位點(diǎn)后面處分別插入受組成型HpaII啟動(dòng)子調(diào)控的MalR基因及MalR-MalP基因，構(gòu)建pMA5R和pMA5RP并通過(guò)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入已構(gòu)建的枯草芽孢表達(dá)宿主菌1A751中，利用帶有卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基平板進(jìn)行篩選，所獲得的轉(zhuǎn)化子經(jīng)過(guò)PCR驗(yàn)證正確后保存，獲得遺傳改造菌株MATE019-MATE024。而后將實(shí)施例1中構(gòu)建的攜帶GFP基因的pDG質(zhì)粒整合至上述遺傳改造菌株中，通過(guò)測(cè)量熒光強(qiáng)度評(píng)價(jià)不同基因的遺傳改造對(duì)MalA啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄效率影響。構(gòu)建得到的芽孢桿菌遺傳改造菌株如表3所示，所使用的寡核苷酸如表4所示，不同菌株的熒光強(qiáng)度對(duì)比圖如圖5所示。

實(shí)施例8利用所述新型表達(dá)載體及表達(dá)宿主進(jìn)行綠色熒光蛋白的發(fā)酵表達(dá)。

以實(shí)施例5獲得的15個(gè)枯草芽孢桿菌MalA啟動(dòng)子突變體為基礎(chǔ)，按照實(shí)施例3的方法，構(gòu)建帶有以上突變啟動(dòng)子和綠色熒光蛋白GFP基因的pMATE-int 整合型質(zhì)粒，通過(guò)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入枯草芽孢桿菌1A751，利用帶有氯霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基平板進(jìn)行篩選，得到單拷貝整合于枯草芽孢桿菌基因組的受不同MalA啟動(dòng)子突變體誘導(dǎo)的GFP表達(dá)菌株，所獲得的轉(zhuǎn)化子經(jīng)過(guò)PCR驗(yàn)證正確后進(jìn)行搖瓶發(fā)酵進(jìn)行比較。菌株經(jīng)劃線培養(yǎng)活化后挑取單克隆接種于含有5mL LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h后，以1％的接種量接種到25mL不含麥芽糖誘導(dǎo)物的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，在OD600達(dá)到0.8時(shí)在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入1％(w/w)麥芽糖誘導(dǎo)物進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE結(jié)果如圖8所示。在此基礎(chǔ)上選取4株表達(dá)效果較好的菌株按照實(shí)施例4的方法構(gòu)建帶有突變啟動(dòng)子和綠色熒光蛋白GFP基因的pMATE-rep復(fù)制型質(zhì)粒，通過(guò)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入枯草芽孢桿菌1A751，利用帶有卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基平板進(jìn)行篩選，所獲得的轉(zhuǎn)化子經(jīng)過(guò)PCR驗(yàn)證正確后進(jìn)行搖瓶發(fā)酵比較，發(fā)酵過(guò)程如上文所述。整個(gè)發(fā)酵過(guò)程以攜帶野生型MalA啟動(dòng)子的GFP表達(dá)菌株作為對(duì)照，每間隔24h取樣進(jìn)行SDS-PAGE測(cè)定，SDS-PAGE如圖9所示，所使用的寡核苷酸如表4所示。

表3

表4

SEQUENCE LISTING

<110> 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所

<120> 一種包含麥芽糖啟動(dòng)子的載體以及麥芽糖啟動(dòng)子突變

<130> 2015

<160> 32

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 335

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 1

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<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

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<210> 3

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<212> DNA

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<400> 3

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