棘孢木霉acc脫氨酶畢赤酵母表達載體、構建方法及其蛋白表達方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及一種棘抱木霉ACC脫氨酶畢赤酵母表達載體、構建方法及其蛋白表達 方法，屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 內生菌是指一定階段或全部階段生活于健康植物的組織和器官內部的真菌或細 菌。研究表明，內生菌的用途非常廣泛，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面，人們利用內生菌來增強其宿主的 抗逆性，抗蟲害，促進植物的生長，增強宿主植物的環(huán)境適應能力，避免宿主受到迫害，運樣 既減少了化學農(nóng)藥的大面積污染，又保證了農(nóng)作物的天然性。在醫(yī)學方面，從內生菌中尋找 更多抗癌和抗病的基因也成為現(xiàn)在的研究熱點。在工業(yè)方面，內生菌產(chǎn)生的某些活性物質， 如具有抗性的特殊的酶類，在工業(yè)上也具有較大的應用潛力。
[0003] -般情況下，內生真菌與宿主是W互惠的方式進行共生，所W通常認為兩者是互 利共生的關系。一方面，宿主植物為寄生的內生真菌提供生存環(huán)境和生長必須的養(yǎng)分;另一 方面，內生真菌會產(chǎn)生有利于宿主植物生長和發(fā)育的次級代謝產(chǎn)物，運些代謝產(chǎn)物在宿主 植物應對抗病蟲害、抗旱和對病原體的括抗時發(fā)揮了重要作用。
[0004] 迄今為止已被發(fā)現(xiàn)的內生真菌包括接合菌、卵菌、擔子菌、子囊菌、有絲分裂抱子 真菌和其無抱菌等多種菌群，其中曲霉屬、鑲抱霉屬和擬莖點霉屬為較優(yōu)勢的菌種。而從耐 鹽植物種直接分離棘抱木霉還屬于空白。
[0005] 植物在逆境下產(chǎn)生的大量逆境乙締阻礙其正常生長發(fā)育，嚴重時可導致植株死 亡。ACC脫氨酶可將植物乙締合成的直接前體ACC水解為α-酬下酸和氨，阻止植物內體乙締 的過量產(chǎn)生，有效促進逆境下植物的正常生長發(fā)育及延緩植物組織的衰老。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種棘抱木霉ACC脫氨酶畢赤酵母表達載體、 構建方法及其蛋白表達方法，該畢赤酵母表達載體能夠成功表達ACC脫氨酶，具有良好的耐 鹽性。
[0007] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術方案是提供一種棘抱木霉ACC脫氨酶畢 赤酵母表達載體，將棘抱木霉的ACC脫氨酶基因和質粒PPIC9K連接后，轉化畢赤酵母構建而 成。
[000引所述棘抱木霉為棘抱木霉(Trichoderma asperellunOKpS，保藏單位：中國典型培 養(yǎng)物保藏中屯、，保藏地址：中國武漢武漢大學，保藏編號:CCTCC N0:M 2015770,保藏日期： 2015年12月23日。
[0009] 本發(fā)明所采用的技術方案還在于提供一種棘抱木霉ACC脫氨酶畢赤酵母表達載體 的構建方法，包括W下步驟：
[0010] (1)根據(jù)棘抱木霉菌株T203 ACC脫氨酶基因，設計特異性引物ACC，W棘抱木霉KpS 基因組DM為模板，進行PCR擴增，將PCR擴增產(chǎn)物回收純化，并連接Τ載體，轉化大腸桿菌感 受態(tài)細胞，培養(yǎng)篩選單克隆，挑取單克隆擴大培養(yǎng)，得到大腸桿菌菌液，進行質粒抽提并測 序；
[0011] (2)根據(jù)步驟（1)的測序結果，設計特異性引物T-acdS，W步驟（1)大腸桿菌菌液為 模板，進行PCR擴增，將PCR擴增產(chǎn)物和載體質粒PPIC9K同時雙酶切，兩個酶切產(chǎn)物連接，連 接產(chǎn)物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，培養(yǎng)篩選單克隆，挑取單克隆擴大培養(yǎng)，質粒抽提并酶切 鑒定，酶切鑒定正確的命名為重組質粒pPIC9K-acds;
[0012] (3)用Sacl線性化重組質粒pPIC9K-acdS，然后電轉化畢赤酵母感受態(tài)細胞即得。 [001引步驟(1)的特異性引物ACC為：
[0014] 正向引物ACC-FP:5'-CACCATGGCTACCCTCAACATCCCCGAAC-3'
[0015] 反向引物ACC-RP: 5 ' -GTCTAAAAGAGAGGAATACGCGTTCAAC-3 '。
[0016] 步驟(2)的特異性引物T-acdS為：
[0017] 正向引物T-acdS-FP: 5 ' -TACGTAATGGCTACCCTCAACATCCCCGAAC-3 '
[001 引 反向引物T-acdS-RP: 5 ' -GCGGCCGCGTCTAAAAGAGAGGAATACGCGT-3 '。
[0019]步驟（1)的PCR反應體系為：2XEs Taq MasterMix 12.5μ1，基因組DNA 0.扣1、10μ Μ正向引物0.扣1，ΙΟμΜ反向引物0.化1，補水到2扣1;步驟（1)的PCR反應條件為:94°C預變性 4min; 94°C 變性 30s，53°C 退火 30s，72°C 延伸 Imin，38 個循環(huán);72°C 延伸 8min。
[0020] 步驟(2)的PCR反應體系為：2XEs Taq MasterMix 12.扣1，大腸桿菌菌液化1、10μ Μ正向引物0.扣1，ΙΟμΜ反向引物0.化1，補水到2扣1;步驟(2)的PCR反應條件為:94°C預變性 8min; 94°C 變性 30s，55°C 退火 30s，72°C 延伸 Imin，38 個循環(huán);72°C 延伸 8min。
[0021] 步驟(2)的雙酶切體系為：10 X Quick Cut Buffer扣1、載體質粒pPIC9K或PCR產(chǎn) 物化g，抓/μ1的SnaBI和Notl各化1，補水到50μ1;雙酶切條件為:37°C金屬浴消化化。
[0022] 本發(fā)明所采用的技術方案還在于提供一種棘抱木霉ACC脫氨酶畢赤酵母表達載體 的蛋白表達方法，具體步驟為:將棘抱木霉ACC脫氨酶畢赤酵母表達載體接種到BMGY液體培 養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至OD600為2-6，離屯、，棄上清，加 BMMY液體培養(yǎng)基重懸，并加入100%甲醇誘 導表達即得。
[0023] 本發(fā)明有益效果
[0024] 1、本發(fā)明首次從鹽生植物海濱錦葵塊根中分離出棘抱木霉，該棘抱木霉的ACC脫 氨酶活性較高，能夠通過降解乙締合成前體，從而減少植物合成乙締，間接提高生長素和乙 締的比例，促進植物的生長。
[0025] 2、本發(fā)明從海濱錦葵塊根中分離內生真菌，并將分離純化的內生真菌接種在ADF 平板上，篩選得到10種海濱錦葵內生真菌，通過高通量比色法和2,4-二硝基苯阱比色法，最 終篩選得到菌株KpS，結合顯微鏡觀察菌落、抱子觀察及測序結果，確認菌株KpS為棘抱木霉 (Trichoderma asperellum)。實驗表明，本發(fā)明最終篩選的棘抱木霉KpS在ADF平板上的ACC 脫氨酶活性可達4557.9化Μ地Bmg-ih-i，高于其它幾種海濱錦葵塊根內生真菌，甚至是其中 絕大多數(shù)內生真菌的幾倍甚至是十幾倍。
[0026] 3、本發(fā)明的棘抱木霉KpS接種海濱錦葵根系后，能夠增強海濱錦葵的耐鹽性，在高 鹽條件下，顯著提高海濱錦葵葉綠素含量，使海濱錦葵的葉片生長加快，葉片增厚，能夠減 少水分蒸騰，提高幼苗的含水量，增加了海濱錦葵幼苗的干重和鮮重。
[0027] 4、本發(fā)明克隆了棘抱木霉KpS的acdS基因，構建含有acdS基因的重組質粒，并電轉 化畢赤酵母，最終在甲醇的誘導下利用畢赤酵母成功表達了 ACC脫氨酶，為利用酵母作為生 物反應器工業(yè)化生產(chǎn)ACC脫氨酶提供了技術支持。該技術通過生產(chǎn)ACC脫氨酶，利用ACC脫氨 酶增強植物的耐鹽性。
[0028] 5、本發(fā)明方法具有操作簡單，成本低，周期短和易于實現(xiàn)的優(yōu)點。同時，本發(fā)明原 料來源豐富易取，成本低，無環(huán)境污染，所用設備、試劑價格便宜，便于規(guī)模化生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0029] W下結合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0030] 圖1為海濱錦葵塊根內生菌的ACC脫氨酶活性檢測結果。
[0031] 圖2為菌株KpS的菌落形態(tài)圖。
[0032] 圖3為菌株KpS的抱子形態(tài)圖。
[0033] 圖4為菌株KpS的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖，圖中，Μ為Markera為PCR擴增產(chǎn)物。
[0034] 圖5為棘抱木霉KpS對大豆幼苗生長影響的分析圖。
[0035] 圖6為不同鹽濃度下棘抱木霉KpS對海濱錦葵幼苗鮮重影響的分析圖。
[0036] 圖7為不同鹽濃度下棘抱木霉KpS對海濱錦葵幼苗干重影響的分析圖。
[0037] 圖8為不同鹽濃度下棘抱木霉KpS對海濱錦葵幼苗含水量影響的分析圖，圖中，EF 為對照組，EI為菌處理組。
[0038] 圖9為不同鹽濃度下棘抱木霉KpS對海濱錦葵幼苗葉綠色含量影響的分析圖，圖 中，EF為對照組，EI為菌處理組。
[0039] 圖10為棘抱木霉KpS的acdS基因的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖，圖中，Μ為Marker, 1-3為 PCR擴增產(chǎn)物。
[0040] 圖11為目的基因 acdS、載體質粒PPIC9K和重組質粒pPIC9K-acdS的電泳圖，圖中，Μ 為Markera為載體質粒pPIC9K，2為重組質粒pPIC9K-acdS的雙酶切，3為線性化的重組質粒 pPIC9K-acdS，4為目的基因 acdS。
[0041 ] 圖12為畢赤酵母轉化子誘導表達產(chǎn)物電泳圖，圖中，Μ為Marker, 1、2、3、4、5分別為 畢赤酵母轉化子在甲醇誘導12h、24h、4她、72h、96h的ACC脫氨酶表達量。
[0042] 圖13為畢赤酵母轉化子在化C1濃度0%、3%、6%、9%和12%的YPD平板上的生長 情況，圖中，a、b、c、d、e分別為化C1濃度0%、3%、6%、9%和12%的YPD平板，其中，A為轉化 子A69，B為轉化子B11，C為轉化子B35，D為轉化子B43，CK為未經(jīng)轉化的的畢赤酵母（陰性對 照)。
[0043] 圖14為畢赤酵母轉化子在化C1濃度0%、3%、6%、9%和12%的液體培養(yǎng)基中的生 長情況。
【具體實施方式】
[0044] W下結合實施例對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0045] PDA平板:馬鈴馨洗凈去皮，再稱取200g馬鈴馨切成小塊，加水煮爛，過濾，濾液加 20g瓊脂，繼續(xù)加熱攬拌混勻，待瓊脂溶解完后，加入葡萄糖20g，攬拌均勻，再補足水分至 1000mL，12rC高壓滅菌20min，鋪平板，冷卻即可。
[0046] DF無氮培養(yǎng)基（IL)Jg葡萄糖，地巧樣酸，4ml 50%葡萄糖酸溶液，0.2g MgS化· 7出0，0.1ml微量元素母液，0.1ml Mo〇3母液，0. lmlFeS〇4 · 7此0母液，定容至900ml超純水， pH值調至7.2，121°C滅菌15min后，待冷卻，加入100ml已滅菌的10 X憐酸鹽母液。其中，
[0047] 微量元素母液（100ml):10mg 曲B〇3、