（一般為綠色和白色分界位置） 到最長的根尖部分記作根長。
[0087] 葉綠素含量測定：稱取0.2g新鮮葉片于研鉢中，加少量石英砂及碳酸巧粉末，用 95 %乙醇研磨，過濾定容至25ml。W95 %乙醇為空白對照，在665皿和649皿波長條件下，ii 定吸光度值。
[0088] Ca=13.95A665-6.8A649
[0089] Cb = 24.96A649-7.32A6 化
[0090] Cx=Ca+Cb
[0091]
[0092] 其中，色素的濃度為Ct;提取液體積為25ml;樣品鮮重為0.2g;稀釋倍數(shù)為測定吸 光度值時將提取液稀釋的倍數(shù)。
[0093] SOD活性測定：稱取0.5g試驗材料葉片，加入少量碳酸巧和石英砂，用預(yù)冷的50μ mol · [1的憐酸緩沖液(pH 7.0,含有1%PVP，0.1%琉基乙醇)5血于冰浴上研磨(研鉢在-20 °C預(yù)冷30min)，定容至lOmL，然后在4°C下12，OOOg離屯、20min，取上清液為粗酶提取液。
[0094] 取4支試管，兩支作為測定試管，兩支為對照管。按表4.1加入相應(yīng)試劑，混勻。其中 一支對照管罩上錫錐紙避光，與其他各個試管同時放置于40001UX日光燈下反應(yīng)20~ 30min，溫度25~35°C，反應(yīng)時間視酶活而定，光照樣品至少要稀釋5倍。
[0095] 表4.1 SOD活性測定反應(yīng)體系
[0096]
[0097] 反應(yīng)結(jié)束后，用侶錐紙罩上各個試管，終止反應(yīng)。W遮光對照為空白對照，在560皿 波長條件下分別測定各管的吸光度，按照下式計算SOD活性：
[009引
[0099] 其中，Ao為空白對照的吸光值;As為樣品吸光值;Vt為樣品的總體積;Vi為測定時樣 品用量(mU;W為樣品鮮重(g)。
[0100] 具體檢測見過結(jié)果見圖5。
[0101] 在棘抱木霉對鹽脅迫下大豆幼苗生長的影響實驗中，棘抱木霉在不加鹽，和濃度 0.5 %的鹽脅迫下大部分指標顯著高于對照。
[0102] 2、棘抱木霉KpS對海濱錦葵幼苗的生長影響
[0103] 參照上述方法，W棘抱木霉KpS培養(yǎng)液侵染海濱錦葵幼苗，分別設(shè)置無鹽組和化C1 濃度為100mm〇l/、200mmol/L和300mmol/L鹽處理組，其中又分為菌處理組和對照組。無鹽組 中，菌處理組用1/2化agland營養(yǎng)液和棘抱木霉時S培養(yǎng)液交替誘灌，對照組只用1/2 化agland營養(yǎng)液誘灌;鹽處理組中，菌處理組用含有相應(yīng)濃度化C1的1/2化agland營養(yǎng)液 和棘抱木霉KpS培養(yǎng)液交替誘灌，對照組只用含有相應(yīng)濃度化Cl的1/2化agland營養(yǎng)液誘 灌。W上誘灌每次每鉢誘20mL，2d-次。lOd后對照組(CK，Ommol/L NaCl)和lOOmmol/L化C1 條件下，對照組與棘抱木霉和鹽共同處理下海濱錦葵無明顯差異，而在200mmol/L化Cl和 300mmol/L化C1處理下，棘抱木霉KpS接種海濱錦葵后，顯著減輕鹽處理對海濱錦葵的毒害 作用。
[0104]巧慢鮮重結(jié)果如圖6所示，棘抱木霉接種后，Ommol/L化C1+菌（指棘抱木霉KpS)、 200mmol/LNaCl+菌、300mmol/LNaCl+菌處理的植株鮮重比單獨相同鹽濃度處理植株的鮮重 要高，其中無鹽條件下的差異顯著(P<〇.〇5)，300mmol/L化C1差異極顯著(P<0.01)。測量 干重結(jié)果如圖7,300mmol/L化C1處理組中菌處理組和對照組差異顯著(P<0.05)。含水量 如圖8所示，Ommol/L NaU和200mmol/L化C1鹽處理組中對照組與接種棘抱木霉KpS相比差 異顯著(P<0.05)，100mmol/L化C1鹽處理組中菌處理組和對照組差異不顯著(P>0.05)， 300mmol/L化Cl鹽處理組中菌處理組與對照組差異極顯著（P<0.01)，0mmol/L NaCl、 200mmol/L化Cl和300mmol/L化Cl處理組中，菌處理組化I)比對照組的含水量分別增加 10.77%、10.：34%和20.11%。
[01化]海濱錦葵幼苗的葉綠素結(jié)果如圖9所示，Ommol/L化C1和lOOmmol/L化C1鹽處理 組中對照組和接種棘抱木霉組差異不顯著(P>0.05)，200mmol/L化C1鹽處理組中菌處理 組和對照組差異顯著(P<0.05)，300mmol/L化C1鹽處理組中菌處理組和對照組差異極顯 著(P<0.01)，200mmol/L化C1鹽處理組和300mmol/L化C1鹽處理組中菌處理組比對照組 分別高出14.27 %和33.69%。在低鹽或無鹽情況下，葉綠素含量沒有明顯差異，高鹽濃度 下，菌處理組的葉綠素含量顯著高于對照組，運可能是由于低鹽或無鹽時內(nèi)生真菌不敏感， 高鹽環(huán)境中內(nèi)生真菌激活了植物的防御系統(tǒng)，通過菌絲等途徑促進根系對水分的吸收，有 利于氣體交換，增強植物的光合作用。
[0106] 實施例3棘抱木霉ACC脫氨酶畢赤酵母表達載體
[0107] 1、棘抱木霉的ACC脫氨酶(acdS)基因的克隆和測序
[0108] 提取棘抱木霉KpS基因組DNA，作為模板，根據(jù)Genbank中已經(jīng)注釋的Trichoderma asperellum strain T203 ACC脫氨酶基因（登錄號：FJ751936)的序列，設(shè)計特異性引物 八〇：，正向引物4〇：斗口（5'-〔4〇：4了66(：了4〔〇：1^44〔4了〇：〇：644(：-3'，569 10^.4)、反向引物 ACC-RP(5'-GTCTAAAAGAGAGGAATACGCGTTCAAC-3'，SEQ ID 備.5)，克隆目的基因日。(15。
[0109] PCR反應(yīng)體系25yl:2XEs Taq MasterMix 12.扣 1、基因組DNA 0.5μ1、Α(Χ-ΡΡ(10μ Μ)和 ACC-RP(lOyM)各 0.化1，補水到25μ1。
[0110] PCR 反應(yīng)程序:94°C 預(yù)變性 4min; 94°C 變性 30s，53°C 退火 30s，72°C 延伸 Imin，38 個 循環(huán);72°C延伸8min。
[0111] PCR擴增產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，Glodviewl型核酸染色劑染色，320nm紫 外光下觀察得到單一目的條帶，大小約為1118bp。將PCR產(chǎn)物回收純化，并連接pMD 18-T載 體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，涂布含IPTG和X-gal的LB平板，培養(yǎng)篩選單克隆，挑取單克隆 接種LB液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，得到大腸桿菌菌液，進行質(zhì)粒抽提并測序，結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進 行BLAST比對分析。與Genbank中已經(jīng)注釋的Trichoderma asperellum strain T203 ACC脫 氨酶基因的序列進行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)完全吻合，測序基因堿基配對率100%。
[0112] 2、載體質(zhì)粒和具有酶切位點的acdS基因的獲得
[0113] 根據(jù)測序結(jié)果，設(shè)計在畢赤酵母中表達所需的棘抱木霉acdS基因擴增特異引物Τ- acdS，在引物兩端加特異的酶切位點。
[0114] 正向引物T-acdS-FP:5'-TACGTAATGGCTACCCTCAACATCCCCGAAC-3'（沈Q ID NO.6)， 下劃線為SnaBI酶切位點；
[0115] 反向引物T-acdS-RP:5'-雌唯哩雌GTCTAAAAGAGAGGAATACGCGT-3'（SEQ ID NO.7)， 下劃線為Notl酶切位點。
[0116] W含有棘抱木霉acdS基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌液(步驟1的大腸桿菌菌液)為 模板，PCR擴增目的基因。
[0117] PCR反應(yīng)體系25yl:2XEs Taq MasterMix 12.扣 1，大腸桿菌菌液化l，T-acdS-FP (ΙΟμΜ)和 T-acdS-RP( ΙΟμΜ)各0.化1，補水到25μ1。
[0118] PCR 反應(yīng)程序:94°C 預(yù)變性 8min; 94°C 變性 30s，55°C 退火 30s，72°C 延伸 Imin，38 個 循環(huán);72°C延伸SmiruPCR擴增產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，Glodviewl型核酸染色劑染 色，320nm紫外光下觀察得到單一目的條帶，大小約為1129bp，符合預(yù)期（圖10)。
[0119] 將PCR產(chǎn)物和載體質(zhì)粒PPIC9K同時用SnaBI和Notl雙酶切。
[0120] 雙酶切體系為：10XQuick Cut Buffer扣1、載體質(zhì)粒PPIC9K或PCR產(chǎn)物化g，抓/μ 1的SnaBI和Notl各化1，補水到50μ1。
[0121] 雙酶切條件為:37°C金屬浴消化化。
[0122] 65°C滅活lOmin，立即將反應(yīng)體系放入冰盒中。分別進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢 測，膠回收試劑盒回收純化。
[0123] PCR擴增的目的基因 acdS片段測序，測序結(jié)果與棘抱木霉ACC脫氨酶基因進行比 對，結(jié)果表明，測序基因堿基配對率99 %。
[0124] 3、體外連接和重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌
[0125] 將回收純化的載體質(zhì)粒PPIC9K和PCR產(chǎn)物的酶切產(chǎn)物進行體外連接，具體方法為： 將200ng酶切回收的載體質(zhì)粒PPIC9K和10化g酶切回收PCR產(chǎn)物依次加入1.5ml離屯、管，補水 至Ijl化1，輕輕混勻后45°C水浴5min置冰上，加入10XT4 DNA Ligase Buffer 2μ巧日T4 DNA Ligase化g，使反應(yīng)總體系為20μ1，輕輕混勻，16°C金屬浴連接化。
[01 %] 將連接產(chǎn)物65°C加熱5min滅活，立即冰浴;加入50μ1大腸桿菌D冊α感受態(tài)細胞，冰 浴30min，42°C熱激60s，冰浴2min;加入37°C預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基1ml，37°C解育比;8000 X g 離屯、2min，棄去80化1上清，將剩余菌液吸打混勻，涂布含50mg/L氨節(jié)西林的LB固體平板;37 °〇過夜培養(yǎng)。挑單克隆接種于LB液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，W培養(yǎng)的大腸桿菌為模板，PCR擴增 目的基因。
[0127] PCR反應(yīng)體系25yl:2XEs Taq MasterMix 12.扣 1，大腸桿菌菌液化l，T-acdS-FP (ΙΟμΜ)和 T-acdS-RP( ΙΟμΜ)各0.化1，補水到25μ1。
[0128] PCR 反應(yīng)程序:94°C 預(yù)變性 8min; 94°C 變性 30s，55°C 退火 30s，72°C 延伸 Imin，38 個 循環(huán);72°C延伸8min。
[01巧]PCR擴增產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測