專利名稱：一種用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的pei修飾的金磁微粒的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種有機(jī)聚合物與無機(jī)材料復(fù)合物的制備工藝，特別涉及一種用于細(xì) 胞轉(zhuǎn)染的PEI修飾的金磁微粒的制備方法。
背景技術(shù)：
體內(nèi)基因治療80%采用病毒載體系統(tǒng)作為基因傳輸載體，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病 毒、腺相關(guān)病毒等，非病毒載體包括脂質(zhì)體和陽離子聚合物。病毒載體與非病毒載體相比轉(zhuǎn) 染率高，但存在著一些安全隱患，如對特異的細(xì)胞有限制性靶向性，DNA裝載量有限，潛在的 病毒重組和成本較高等問題使得它的實(shí)際應(yīng)用受到限制。非病毒載體如陽離子脂質(zhì)體和陽 離子共聚物可克服目前病毒載體在安全性、免疫原性和價格方面等問題。
在目前應(yīng)用的非病毒載體中，多聚陽離子共聚物聚乙烯亞胺(polyethylenimine. PEI)，在體內(nèi)外都表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)染率。PEI的重復(fù)結(jié)構(gòu)單體中每兩個碳原子就連接含氮 原子的伯胺和仲胺，支鏈型的/01還包括叔胺，都可質(zhì)子化生成正電性氨基，成為與DNA上 帶負(fù)電荷的磷酸根結(jié)合的作用點(diǎn)，形成納米級的聚合物、DNA復(fù)合物，可被細(xì)胞攝取。并且 由于這些氮原子構(gòu)成的伯氨、仲氨和叔氨基團(tuán)的pKa值不同，使PEI幾乎在任何pH條件下 都有吸收質(zhì)子的能力(即質(zhì)子海綿作用)。這一特性使PEI能在內(nèi)涵體(endosome)的酸 性環(huán)境中吸收H+，使其滲透壓增高，導(dǎo)致膜不穩(wěn)定甚至破裂，從而使被吞噬的復(fù)合物遂逸出 來，避免DNA降解。但PEI的轉(zhuǎn)染效率與與病毒載體仍有較大差距，且細(xì)胞毒性強(qiáng)也不具有 靶向性，這些缺陷限制了 PEI的使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是 為了解決背景技術(shù)中存在的上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種用PEI修飾的金磁 微粒，該P(yáng)EI與金磁微粒的復(fù)合物作為基因載體可以在有外加磁場存在的條件下，增加了 復(fù)合體的沉淀，增加轉(zhuǎn)染效率；通過金磁微粒的偶聯(lián)作用可以降低細(xì)胞毒性；在外加磁場 中可以使PEI/金磁微粒具有靶向性。
本發(fā)明的技術(shù)方案 用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的PEI修飾的金磁微粒的制備方法，其特征在于該方法包括以下 步驟 1)將金磁微粒加入到巰基丙酰甘氨酸溶液中，室溫下攪拌8 10小時；
2)用清洗液清洗經(jīng)步驟1)處理后的金磁微粒； 3)將步驟2)清洗后的金磁微粒懸浮于0. 5M NaCl和0. 1M pH = 6. 0的MES的混 合溶液中，加入催化劑，室溫下劇烈震蕩15min，反應(yīng)后再用清洗液清洗金磁微粒；
4)將步驟3)清洗后的金磁微粒懸浮于PEI溶液中，室溫下劇烈震蕩lh，反應(yīng)后用 去離子水清洗金磁微粒，得到PEI修飾的金磁微粒。 上述步驟l)所加金磁微粒與巰基丙酰甘氨酸溶液的質(zhì)量比最好為20 : 1。
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上述步驟3)催化劑為EDC溶液或者是EDC和N_羥基琥珀酰亞胺的混合液，用EDC 和N-羥基琥珀酰亞胺的混合液效果最佳。 上述步驟2)和步驟3)的清洗液為NaCl和pH = 6. 0的MES的混合溶液。
上述步驟4)PEI溶液溶解于pH = 11. 5的PBS溶液中。
上述PEI的分子量在750-60000之間。 上述金磁微粒包括粒徑為30nm的金磁微粒、粒徑為50nm的金磁微粒。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn) 1、本發(fā)明通過將PEI與金磁微粒共價連接，在外加磁場的作用下可提高對細(xì)胞的 轉(zhuǎn)染效率。 2、本發(fā)明通過金磁微粒將小分子量的PEI偶聯(lián)，可降低PEI的毒性。 3、本發(fā)明在用于體內(nèi)基因治療時，可通過外加磁場賦予PEI/金磁微粒靶向性。


圖1是金磁微粒經(jīng)PEI修飾后的電鏡照片。
圖2是金磁微粒經(jīng)PEI修飾后的Zeta電位圖。
具體實(shí)施例方式
下面用具體實(shí)施例對該發(fā)明作進(jìn)一步地說明，該實(shí)施例并不限制本發(fā)明的保護(hù)范 圍。
實(shí)施例 將10毫克金磁微粒加入到20毫升25mg/ml巰基丙酰甘氨酸溶液中，室溫下攪拌 10小時。再用O. 5M NaCl、0. 1M MES(p朋.O)溶液清洗金磁微粒三遍。將金磁微粒懸浮于 0. 5M NaCl、0. 1M MES(p朋.0)溶液中，加入20mM EDC和50mM N_羥基琥珀酰亞胺的混合溶 液，室溫下劇烈震蕩15min。反應(yīng)后用0. 5MNaC1、0. 1M MES(p朋.0)清洗金磁微粒兩遍。將 金磁微粒懸浮于20毫升5% (w/v) PEI (分子量2000)的PBS溶液中(pHll. 5)，室溫下劇烈 震蕩lh。反應(yīng)后用去離子水清洗金磁微粒兩遍，得到PEI修飾的金磁微粒。分析表明經(jīng)PEI 修飾的金磁微粒形貌為球形，粒徑均一，見圖1所示，圖2為金磁微粒經(jīng)PEI修飾后的Zeta 電位圖，反映了磁粒的帶電性質(zhì)和帶電量，經(jīng)PEI修飾的金磁微粒帶有較高的正電荷，Zeta 電位值大約在+30左右。
權(quán)利要求
用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的PEI修飾的金磁微粒的制備方法，其特征在于該方法包括以下步驟1)將金磁微粒加入到巰基丙酰甘氨酸溶液中，室溫下攪拌8～10小時；2)用清洗液清洗經(jīng)步驟1)處理后的金磁微粒；3)將步驟2)清洗后的金磁微粒懸浮于0.5M NaC1和0.1M pH＝6.0的MES的混合溶液中，加入催化劑，室溫下劇烈震蕩15min，反應(yīng)后再用清洗液清洗金磁微粒；4)將步驟3)清洗后的金磁微粒懸浮于PEI溶液中，室溫下劇烈震蕩1h，反應(yīng)后用去離子水清洗金磁微粒，得到PEI修飾的金磁微粒。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的PEI修飾的金磁微粒的制備方法，其特征在于驟i)所加金磁微粒與巰基丙酰甘氨酸溶液的質(zhì)量比為io : i i : 50 ;驟3)催化劑為EDC溶液或者是EDC和N-羥基琥珀酰亞胺的混合液；驟2)和步驟3)的清洗液為NaCl和pH = 6. 0的MES的混合溶液；驟4)PEI溶液溶解于pH8. 0 11. 5的PBS溶液中；
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的PEI修飾的金磁微粒的制備方法，其特征在于所述PEI的分子量在750-60000之間。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的PEI修飾的金磁微粒的制備方法，其特征在于所述金磁微粒包括粒徑為15nm 100nm的金磁微粒。步步步步
全文摘要
本發(fā)明涉及一種有機(jī)聚合物與無機(jī)材料復(fù)合物的制備工藝，尤其涉及一種用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的PEI修飾的金磁微粒的制備方法。該方法包括將金磁微粒加入到巰基丙酰甘氨酸溶液中反應(yīng)；用清洗液清洗；清洗后的金磁微粒加入催化劑反應(yīng)，再用清洗液清洗金磁微粒；將清洗后的金磁微粒懸浮于PEI溶液中，室溫下劇烈震蕩，反應(yīng)后用去離子水清洗金磁微粒，得到PEI修飾的金磁微粒。本方法通過將PEI與金磁微粒共價連接，在外加磁場的作用下可提高對細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率；通過金磁微粒將小分子量的PEI偶聯(lián)，可降低PEI的毒性；在用于體內(nèi)基因治療時，可通過外加磁場賦予PEI/金磁微粒靶向性。
文檔編號C12N15/64GK101717780SQ200910254439
公開日2010年6月2日 申請日期2009年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月22日
發(fā)明者華愷, 崔亞麗, 惠文利, 石峰, 陳超 申請人:陜西北美基因股份有限公司