一種鈣磷鹽基因載體、CaP/PEI/DNA納米載體及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于復(fù)合材料技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種鈣磷鹽基因載體、CaP/PEI/DNA納米 載體及制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 對于致殘及難以恢復(fù)的疾病，基因治療是一種的預(yù)防，治療及可能治愈這類疾病 的有前景的根本性革新手段。然而，基因治療的發(fā)展因細(xì)胞轉(zhuǎn)染及基因表達(dá)的技術(shù)不足而 被限制。然而，基因治療的發(fā)展因細(xì)胞轉(zhuǎn)染及基因表達(dá)的技術(shù)不足而被限制。
[0003] 克服基因轉(zhuǎn)染的屏障
[0004] 基因傳遞的最終目標(biāo)是使基因材料安全及有效的到達(dá)靶細(xì)胞核。達(dá)到此目標(biāo)因外 源基因到達(dá)細(xì)胞核的重重屏障而受阻，而使基因表達(dá)以治療或預(yù)防疾病又必須到達(dá)細(xì)胞 核。這類屏障包括載體胞外穩(wěn)定性，體內(nèi)分布，細(xì)胞的攝取及胞內(nèi)入核的途徑。
[0005] 理想的載體性質(zhì)
[0006] 為克服這些屏障，以介導(dǎo)安全有效的基因傳遞，基因載體需有以下性質(zhì)：與基因結(jié) 合牢固及攜帶大量基因，保護基因，儲存及生物穩(wěn)定性，靶向運輸，被細(xì)胞內(nèi)化的能力及從 內(nèi)涵體逃逸以釋放基因，胞內(nèi)對于核的定向運輸及入核，足夠的停留時間使基因表達(dá)，無毒 性，無免疫原性，可生物降解及生物相容性。具有這些性質(zhì)的載體目前還不存在，目前存在 的載體因其一些難以接受的副作用及不足夠的轉(zhuǎn)染效率而難以廣泛應(yīng)用。
[0007] 當(dāng)前載體的挑戰(zhàn)
[0008] 過去，病毒載體因其本身具備的轉(zhuǎn)染多種細(xì)胞的能力而成為一種主要的基因轉(zhuǎn)染 載體，但是，病毒載體的應(yīng)用卻因為其制備復(fù)雜，低運載量，包括其致炎癥反應(yīng)，具有免疫原 性，病毒重組，激活原癌基因及難以控制等潛在安全問題而受限。近期的研究主要專注于非 病毒載體，因其低毒，無免疫原性且合成步驟簡易，運載量大。但相比較于病毒載體，非病毒 載體仍有低轉(zhuǎn)染率及較低的基因表達(dá)效率等問題。
[0009] 非病毒載體包括陽離子脂質(zhì)體，陽離子聚合物及無機材料以保護基因不被核酶降 解及促使基因被細(xì)胞攝取，然而這些方式均是非特異性的且載體會在胞外與蛋白結(jié)合而消 耗了基因。
[0010]陽離子脂質(zhì)體及陽離子聚合物因其能與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜吸附進而被攝取而成 為主要研究的非病毒載體。但是，考慮到其毒性，這兩類載體在體內(nèi)模型的基因表達(dá)量并不 令人滿意。陽離子脂質(zhì)體亦因其不穩(wěn)定性，免疫應(yīng)答性及易被血流清除而應(yīng)用進一步受限。 殼聚糖亦具有生物相容性，可降解性，易于合成，及可被帶電荷基團連接從而可以結(jié)合胞外 或胞內(nèi)靶向配體。然而，目前的殼聚糖及其衍生物的轉(zhuǎn)染俠侶相比于病毒轉(zhuǎn)染效率仍很低。 新型納米顆粒載體例如碳納米管已被證明重現(xiàn)性好，且可制備出所需的不同粒徑及形狀的 顆粒，然而其低溶解性及潛在毒性限制了它的臨床應(yīng)用。
[0011] 鈣磷鹽(CaP)作為基因載體
[0012] 鈣磷鹽具備許多能夠成為理想載體的特性。鈣磷鹽還是牙齒及骨骼最主要的成 分，因此其有高度生物相容性，且不會導(dǎo)致變態(tài)及炎癥反應(yīng)。因帶負(fù)電荷的基因骨架與Ca2+ 電荷吸引作用，基因與鈣磷鹽有很高的親和性從而發(fā)生縮合及包裝。同時，也使得鈣磷鹽能 夠攜帶大段的基因調(diào)控序列以提高基因表達(dá)水平，并使鈣磷鹽基因復(fù)合物能穩(wěn)定穿過次薄 膜。因鈣磷鹽在酸性條件下溶解，基因在內(nèi)涵體中與CaP解離。鈣磷鹽可用于各種不同組織 并可通過連接配體實現(xiàn)靶向轉(zhuǎn)運。此外，其可通過簡單廉價的方式合成。因此，CaP納米顆粒 具有能夠克服多重基因運輸屏障的潛力。
[0013]盡管鈣磷鹽有上述多種優(yōu)勢，但因其一些關(guān)鍵性缺陷限制了其成為基因載體:顆 粒不均一性，易沉淀，不穩(wěn)定及分散性差。到目前為止，合成的鈣磷鹽因其對溫度，pH值，鈣 離子及磷酸根離子濃度，溶液攪拌速率及方式以及添加劑的加入的高度敏感性，其大小，新 裝，表面電荷及結(jié)晶性存在差異。如上所述，形態(tài)及理化性質(zhì)對轉(zhuǎn)染及細(xì)胞攝取起到了關(guān)鍵 作用。顆粒的不均一性導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效果不一致，并可使機體產(chǎn)生難以預(yù)測的后果，這將限制其 作為基因載體的應(yīng)用。
[0014]快速沉淀法制備CaP
[0015 ]為了制備出形態(tài)及理化性質(zhì)較均一的CaP納米，So ko 1 〇 va等人利用快速沉淀法制 備CaP納米，其所制備CaP納米穩(wěn)定性好，重復(fù)性高，其課題組采用多種修飾方式，在多種細(xì) 胞系進行轉(zhuǎn)染，然而，其轉(zhuǎn)染率低于50%。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)上述的不足，提供一種鈣磷鹽基因載體、CaP/PEI/DNA納 米載體及制備方法
[0017] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[0018] 所述鈣磷鹽基因載體包括作為載體本體的鈣磷鹽，所述鈣磷鹽(CaP)表面被聚乙 烯亞胺(PEI)修飾。
[0019] 所述鈣磷鹽基因載體粒徑為245-255nm，電荷在0.2-0.3mv，PDI為0.2-0.3。優(yōu) 選地，所述鈣磷鹽基因載體粒徑為251.6nm，電荷在0.22mv，Η)Ι為0.211。
[0020] 所述鈣磷鹽基因載體的制備方法包括如下步驟：
[0021 ] (1)制備鈣磷鹽：制備濃度為6-6.5mM硝酸鈣溶液和濃度為3-4mM磷酸氫二銨溶 液，調(diào)整硝酸鈣溶液和磷酸氫二銨溶液的pH為9一9.2，將等體積的硝酸鈣溶液和磷酸氫二 銨溶液混合，形成作為載體本體的鈣磷鹽溶液；
[0022] (2)聚乙烯亞胺修飾鈣磷鹽：向步驟（1)制備的鈣磷鹽溶液中加入體積濃度為 1.8-2.2mg/mL聚乙烯亞胺溶液，鈣磷鹽溶液與聚乙烯亞胺溶液的體積比為(9一 11):1，振 蕩后即得鈣磷鹽基因載體懸浮液。
[0023]優(yōu)選地，方法中，是將等體積的硝酸鈣溶液和磷酸氫二銨溶液用蠕動栗以34ml/ min的速度同速栗入容器以混合，所述硝酸鈣溶液濃度為6.25mM;所述磷酸氫二銨溶液濃度 為3.74mM;所述聚乙烯亞胺溶液體積濃度為2mg/mL;所述鈣磷鹽溶液與聚乙烯亞胺溶液的 體積比為10:1。
[0024]所述CaP/PEI/DNA納米載體是由上述f丐磷鹽基因載體與質(zhì)粒結(jié)合而成。
[0025]所述CaP/PEI/DNA納米載體粒徑為225-235nm，電荷在25-30mv，PDI為0.1-0.2。 優(yōu)選地，所述CaP/PEI/DNA納米載體粒徑為233. lnm，電荷在27.7mv，Η)Ι為0.123。
[0026]所述CaP/PE I/DNA納米載體的制備方法是用與鈣磷鹽基因載體懸浮液等體積的水 將鈣磷鹽基因載體懸浮液稀釋，振蕩后加入體積濃度為0.8-1.2mg/mL的質(zhì)粒溶液，稀釋后 的鈣磷鹽基因載體懸浮液與質(zhì)粒溶液的體積比為（34-38): 1，混勻后即得CaP/PEI/DNA納 米載體。優(yōu)選地，方法中所述質(zhì)粒溶液的體積濃度為lmg/mL;所述稀釋后的鈣磷鹽基因載體 懸浮液與質(zhì)粒溶液的體積比為36:1。
[0027]下面對本發(fā)明作進一步說明：
[0028]本發(fā)明采用以Sokolova等人發(fā)明快速沉淀反應(yīng)制備CaP為核心，該快速沉淀反應(yīng) 將硝酸鈣、磷酸氫二銨及PEI用蠕動栗同速(34mL/min)栗入混勻;而本發(fā)明調(diào)整了硝酸鈣溶 液及磷酸氫二銨溶液的pH值，硝酸鈣溶液及磷酸氫二銨溶液混勻后形成CaP，再加入PEI，利 用電荷吸引原理與CaP結(jié)合，抑制CaP繼續(xù)結(jié)晶，同時控制了粒徑，提高轉(zhuǎn)染系統(tǒng)穩(wěn)定性提高 并使其整體帶正電荷，與DNA結(jié)合后，轉(zhuǎn)染體系(CaP/PEI/DNA)的使用Nano zs90粒度分析儀 測試，粒徑為233. lnm，zeta電位為27.7mv。本發(fā)明制備的以CaP為核心的納米載體的轉(zhuǎn)染率 穩(wěn)定高于50%的納米載體，已具備投入實際應(yīng)用的可能。
【附圖說明】
[0029] 圖1是質(zhì)粒與CaP/PEI結(jié)合實驗結(jié)果圖，圖中：1道:marker 2道p-EGFP-Nl 3道CaP/ PEI/DNA。
【具體實施方式】
[0030] 實施例1
[0031] 所述鈣磷鹽基因載體包括作為載體本體的鈣磷鹽，所述鈣磷鹽表面被聚乙烯亞胺 修飾。所述鈣磷鹽基因載體粒徑為251.6nm，電荷在0.22mv，Η)Ι為0.211。
[0032] 實施例2
[0033]制備實施例1所述鈣磷鹽基因載體的制備方法包括如下步驟：
[0034] (1)制備鈣磷鹽:制備濃度為6.25mM硝酸鈣及3.74mM磷酸氫二銨溶液，采用用超純 水溶解，用〇. 1M氫氧化鈉溶液調(diào)整硝酸媽及磷酸氫二銨溶液pH為9一9.2，各取5ml pH調(diào)整 為9-9.2的6.25mM硝酸鈣及3.74mM磷酸氫二銨溶液，利用蠕動栗(34mL/min)同速栗入小燒 杯中，混合以形成作為載體本體的鈣磷鹽溶液，制備過程中用磁力攪拌器攪拌；
[0035] (2)聚乙烯亞胺修飾鈣磷鹽:待硝酸鈣及磷酸二氫銨溶液全部栗入小燒杯中，等待 5秒，加入體積濃度為2mg/mL聚乙烯亞胺溶液溶液，鈣磷鹽溶液與聚乙烯亞胺溶液的體積比 為10:1，以終止CaP繼續(xù)結(jié)晶，充分振蕩30s。取一定量CaP/PEI，加入等體積超純水稀釋，充 分振蕩30s，振蕩后即得鈣磷鹽基因載體懸浮液。
[0036] 實施例3
[0037]所述CaP/PEI/DNA納米載體是由實施例1所述f丐磷鹽基因載體與質(zhì)粒結(jié)合而成。所 述CaP/PEI/DNA納米載體粒徑為233. lnm，電荷在27.7mv，TOI為0.123。
[0038] 實施例4
[0039]制備實施例3所述CaP/PEI/DNA納米載體的制備方法是用與鈣磷鹽基因載體懸浮 液等體積的水將鈣磷鹽基因載體懸浮液稀釋，振蕩后加入體積濃度為lmg/mL的質(zhì)粒溶液， 稀釋后的鈣磷鹽基因載體懸浮液與質(zhì)粒溶液的體積比為36:1，混勻后即得CaP/PEI/DNA納 米載體。
[0040]實施例5 PEI修飾CaP搭載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實驗報告 [0041 ] 1、材料與方法
[0042] 材料
[0043] pEGFP-Nl質(zhì)粒;pEGFP-N-XIAP質(zhì)粒；293t細(xì)胞系；HeLa細(xì)胞系；5-8F細(xì)胞系）；6-10B 細(xì)胞系；質(zhì)粒大量提取盒購自美國Qiagen公司;PBS緩沖液、DMEM高糖培基、0.2