一種高效的dc細(xì)胞xbp1基因敲除方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的涉及一種高效的DC細(xì)胞XBP1基因敲除方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic Cell，DC)對(duì)于激發(fā)和維持T細(xì)胞依賴的抗腫瘤免疫反應(yīng) 至關(guān)重要。然而，腫瘤可通過(guò)削弱DC細(xì)胞功能從而逃避免疫系統(tǒng)的殺傷作用。有研究表明DC 細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力感受因子X(jué)BP1的激活導(dǎo)致DC細(xì)胞抗腫瘤免疫活性降低，最終導(dǎo)致腫瘤 的進(jìn)展。XBP1可調(diào)控DC細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)代謝，脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的副產(chǎn)品可以激發(fā)DC細(xì)胞內(nèi)三 酰甘油的生物合成反應(yīng)，導(dǎo)致異常的脂質(zhì)堆積，最終抑制DC的功能，不能有效激發(fā)出抗腫瘤 活性的T細(xì)胞。因此，若能有效抑制DC細(xì)胞內(nèi)XBP1基因的表達(dá)，將為腫瘤的靶向治療提供有 效的途徑。
[0003] 目前抑制DC細(xì)胞內(nèi)XBP 1基因的表達(dá)是采用傳統(tǒng)siRNA法對(duì)XBP 1基因進(jìn)行抑制，但 是只能抑制大約50%的XBP1基因表達(dá)，抑制效率較低。因此，如果能找到一種新的抑制DC細(xì) 胞內(nèi)XBP1基因表達(dá)方法將有重要的生物學(xué)和醫(yī)學(xué)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種DC細(xì)胞中XBP1基因的敲除 方法，旨在解決DC細(xì)胞中由于XBP1基因的存在并被激活而導(dǎo)致DC細(xì)胞抗腫瘤免疫活性降低 的不利現(xiàn)象。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種DC細(xì)胞XBP1基因敲除方法。本發(fā)明實(shí) 施例DC細(xì)胞XBP1基因敲除方法包括如下步驟：
[0006] 以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力感受因子X(jué)BP1為靶基因進(jìn)行CRISPR靶向序列設(shè)計(jì)，并根據(jù)所述 CRISPR靶向序列設(shè)計(jì)正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；
[0007] 將所述正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列進(jìn)行退火反應(yīng)處理形成雙鏈寡核 苷酸；
[0008] 酶切pCas9/gRNAl載體獲得線性化載體；
[0009] 將所述雙鏈寡核苷酸與所述線性化載體在連接反應(yīng)體系中進(jìn)行連接反應(yīng)處理，獲 得連接產(chǎn)物；
[0010] 將所述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，并將被轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行質(zhì)粒 提取處理，獲得pCas9/gRNAl -XBP1質(zhì)粒；
[0011]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明DC細(xì)胞XBP1基因敲除方法采用CRISPR/pCas9基因敲除系 統(tǒng)，以XBP1為靶基因進(jìn)行CRISPR靶向序列設(shè)計(jì)并制備出pCas9/gRNAl-XBPl質(zhì)粒，使其對(duì)DC 細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，從而能高效的敲除DC細(xì)胞內(nèi)的XBP1基因，從而有效保證了DC細(xì)胞的免疫刺 激作用，有效發(fā)揮了 DC細(xì)胞抗腫瘤免疫作用。
[0012] 進(jìn)一步地，通過(guò)向轉(zhuǎn)染培養(yǎng)體系中還加入L189試劑，該L189試劑能夠與CRISPR/ pCas9基因敲除系統(tǒng)發(fā)揮增效作用，顯著提高了有效提高了CRISPR/pCas9基因敲除系統(tǒng)敲 除XBP1基因的效率。
【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1為改進(jìn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)作用原理示意圖；
[0014] 圖2為pCAS9/gRNAl質(zhì)粒載體圖譜；
[0015] 圖3為實(shí)施例2、3中NC-DC、XBP1 -DC和XBP1 /LI 89-DC三組DC細(xì)胞中XBP1基因的表達(dá) 水平柱狀圖；
[0016] 圖4為NC-DC-T、XBP1-DC-T和XBP1/L189-DC-T三種DC-T細(xì)胞對(duì)RB視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤 細(xì)胞的殺傷效率圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì) 本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不 用于限定本發(fā)明。
[0018] 本發(fā)明實(shí)施例提供了一種高效的DC細(xì)胞XBP1基因敲除方法。在一實(shí)施例中，該本 發(fā)明實(shí)施例DC細(xì)胞XBP1基因敲除方法包括如下步驟：
[0019] 步驟S01.基因敲除靶點(diǎn)和寡核苷酸設(shè)計(jì)：以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力感受因子X(jué)BP1為靶基因進(jìn) 行CRISPR靶向序列設(shè)計(jì)，并根據(jù)所述CRISPR靶向序列設(shè)計(jì)正向寡核苷酸序列和反向寡核苷 酸序列；
[0020] 步驟S02.寡核苷酸退火反應(yīng)處理:將所述正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列 進(jìn)行退火反應(yīng)處理形成雙鏈寡核苷酸；
[0021 ]步驟S03.酶切線性化載體:酶切PCas9/gRNAl載體獲得線性化載體；
[0022]步驟S04.線性化載體與雙鏈寡核苷酸連接反應(yīng):將步驟S02中獲得的雙鏈寡核苷 酸與步驟S03中獲得的所述線性化載體在連接反應(yīng)體系中進(jìn)行連接反應(yīng)處理，獲得連接產(chǎn) 物；
[0023]步驟S05.轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞:將步驟S04中獲得的所述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，并 將被轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行質(zhì)粒提取處理，獲得pCas9/gRNAl-XBPl質(zhì)粒；
[0024] 步驟S06.DC細(xì)胞XBP1基因敲除：將所述pCas9/gRNAl-XBPl質(zhì)粒對(duì)DC細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染 培養(yǎng)處理。
[0025] 具體地，上述步驟S01中的CRISPR靶向序列設(shè)計(jì)是以基于CRISPR/pCas9基因敲除 系統(tǒng)。
[0026]其中，該CRISPR/pCas9基因敲除系統(tǒng)中的CRISPR指的是規(guī)律成簇的間隔短回文重 復(fù)（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 〇CRISPR/Cas是在 大多數(shù)細(xì)菌和古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的一種天然免疫系統(tǒng)，可用來(lái)對(duì)抗入侵的病毒及外源DNA。 CRISPR/Cas系統(tǒng)首先產(chǎn)生與靶標(biāo)序列對(duì)應(yīng)的RNA序列，與病毒或質(zhì)粒的DNA進(jìn)行互補(bǔ)作用， 然后引導(dǎo)Cas內(nèi)切酶對(duì)互補(bǔ)的序列進(jìn)行雙鏈切割。其中Cas基因家族中的Cas9廣泛地應(yīng)用于 該系統(tǒng)中，它是一種天然存在的內(nèi)切酶，具有兩個(gè)酶切活性結(jié)構(gòu)域:HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域和 Ruv-Clike結(jié)構(gòu)域，分別切割互補(bǔ)鏈和非互補(bǔ)鏈。切割過(guò)程需要另外兩個(gè)RNA的幫助，分別為 CRISPR RNA(crRNA)和反式CRISPR RNA(trans-acting CRISPR RNA，tracrRNA)，人們已經(jīng) 將這兩種RNA改造融合成一個(gè)向?qū)NA(single-guide RNA，sgRNA)，單個(gè)sgRNA足以幫助 Cas9實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)切割的效果。
[0027] 經(jīng)過(guò)人工改造的CRISPR/Cas系統(tǒng)一般分為兩種，一種主要由Cas9、tracrRNA和 crRNA三部分構(gòu)成；另一種主要由Cas9和sgRNA兩部分構(gòu)成。載體的構(gòu)建過(guò)程簡(jiǎn)便快捷，僅需 人工合成一段和靶標(biāo)序列相同的序列，連接至載體特定位點(diǎn)即可，具有高通量高效率的特 點(diǎn)。
[0028] CRISPR/Cas9系統(tǒng)作用原理如圖1所示，其平臺(tái)是從化膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes)的II型CRISPR系統(tǒng)優(yōu)化而來(lái)，由SpCas9核酸酶和gRNA構(gòu)成。其中SpCas9核酸酶識(shí) 別基因組中的PAM(Protospacer adjacent motif ,ΡΑΜ)序列，gRNA中的長(zhǎng)約20bp的引導(dǎo)序 列決定革G向特異性。當(dāng)基因組上位于PAM5'端的前體間隔序列(Protospacer)與gRNA中的引 導(dǎo)序列互補(bǔ)時(shí)，Cas9核酸酶啟動(dòng)對(duì)DNA雙鏈進(jìn)行切割，形成DNA雙鏈斷裂缺口（Double-strand breaks,DSBs)〇
[0029] DSBs能激活細(xì)胞內(nèi)非同源末端連接(Non-homologous end joining,NHEJ)和同源 重組(Homology directed repair ,HDR)兩種DNA修復(fù)機(jī)制。NHEJ修復(fù)過(guò)程可以引入堿基的 隨機(jī)插入或者缺失（Insertion or deletion);而在外源模板存在的情況下，細(xì)胞也可以通 過(guò)HDR的方式對(duì)基因組進(jìn)行精確修復(fù)。細(xì)胞內(nèi)發(fā)生HDR的頻率比NHEJ低，只發(fā)生于細(xì)胞分裂 的S期和G2期，而NHEJ發(fā)生于整個(gè)細(xì)胞周期。HDR與NHEJ在細(xì)胞內(nèi)同時(shí)存在，但在NHEJ存在缺 陷的細(xì)胞內(nèi)HDR發(fā)生頻率更高，因此抑制NHEJ可提高HDR的發(fā)生頻率。
[0030] NHEJ包含兩種類型的途徑：（1 )DNA連接酶IV依賴性NHEJ(經(jīng)典NHEJ，C-NHEJ)途徑， 主要用于末端連接；（2)選擇性NHEJ(a 1 t-NHEJ/A-NHEJ/A-EJ)途徑，需要DNA連接酶I/III， C-NHE J途徑缺失時(shí)可誘發(fā)。
[0031 ]因此，CRISPR/Cas9基因敲除系統(tǒng)的靶點(diǎn)由19個(gè)堿基構(gòu)成。靶點(diǎn)前面為轉(zhuǎn)錄起始信 號(hào)G，靶點(diǎn)后面為PAM序列NGG。這樣可作為靶點(diǎn)的序列為GN20GG。基于此，上述步驟S01中是 以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力感受因子X(jué)BP1為革E1基因，通過(guò)在線軟件(http://crispr.mit. edu)針對(duì)XBP1 基因進(jìn)行CRISPR靶向序列設(shè)計(jì)和脫靶位點(diǎn)預(yù)測(cè)。那么根據(jù)所述CRISPR靶向序列設(shè)計(jì)寡核苷 酸序列。
[0032] 在一實(shí)施例中，該過(guò)綜合分析最終選擇的CRISPR靶向序列如下述SEQ ID NO: 1中 下劃線所示：
[0033] "··.CGGTGCGCGGTGCGTAGTCTGGAGCTATGGTGGTGGTGGCAGCCGCGCCGAACCCGGCCGACGGGACCCCTAA AGTTCTGCTTCTGTCGGGGCAGCCCGCCTCCGCCGCCGGAGCCCCGGCCGGCCAGGCCCTGCCGCTCATGGTGCCAG CCCAGAGAGGGGC..."(SEQ ID NO：1)
[0034] 在進(jìn)一步實(shí)施例中，根據(jù)所述CRISPR靶向序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸序列包括正向寡核 苷酸序列和反向寡核苷酸序列，在一具體實(shí)施例中，所述正向寡核苷酸序列如下述SEQ ID NO: 2所示：
[0035] 5，GAAACACCGCCGCGCCGAACCCGGCCGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGT CCGTT3'（SEQ ID N0:2)
[0036] 反向寡核苷酸序列如下述SEQ ID N0:3所示：
[0037] 5 ' AACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACTCGGCCGGGTTCGGCGCGGCGGT GTTTC3'（SEQ ID N0:3)
[0038] 上述步驟S02中的退火反應(yīng)處