一種與男性不育癥相關(guān)的遺傳標(biāo)記的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種與男性不育癥相關(guān)的遺傳標(biāo)記，其序列是UBE2B基因的序列，所述UBE2B基因的啟動(dòng)子區(qū)域與轉(zhuǎn)錄因子SP1的結(jié)合位點(diǎn)突變，突變位點(diǎn)選自Chr.133706771T>A、Chr.133706876T>G和Chr.133706925A>G中的一個(gè)或多個(gè)。通過大規(guī)模測序在男性不育癥病人中篩選出了UBE2B基因啟動(dòng)子區(qū)域的四個(gè)新的突變位點(diǎn)，將轉(zhuǎn)錄因子質(zhì)粒分別與野生型質(zhì)粒和突變體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其功能有明顯差異，表明UBE2B基因啟動(dòng)子區(qū)域的突變與男性不育癥(尤其是無精子癥)具有相關(guān)性，從而能夠通過該突變來實(shí)現(xiàn)對男性不育癥的診斷檢測。
【專利說明】一種與男性不育癥相關(guān)的遺傳標(biāo)記

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本申請涉及男性不育癥檢測領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 不孕不育癥越來越受到關(guān)注，已成為一個(gè)亟待解決的世界性難題。男性不育發(fā)病 因素具有復(fù)雜性和多樣性的特點(diǎn)，但其具體發(fā)病機(jī)制仍不清楚。目前對男性不育發(fā)病機(jī)制 的探索主要集中在遺傳因素上，全球15%的不育病例是由基因突變引起的。
[0003] 目前研究認(rèn)為男性不育很大程度上是參與精子發(fā)生過程的相關(guān)基因功能障礙導(dǎo) 致生精異常所致。精子的發(fā)生和成熟過程伴隨著一系列的睪丸特異性基因的表達(dá)，這些基 因被稱作"沙文基因 "（chauvinist gene)，這些基因在精子的生成過程中發(fā)揮決定性的作 用。泛素結(jié)合酶E2B(Ubiquitin-conjugati-ng enzyme E2B，UBE2B)是與人類精子發(fā)生相關(guān) 的一個(gè)基因，目前對該基因在精子發(fā)生過程中的作用有較為深入的研究。UBE2B，又名RAD6B 和HR6B，屬于泛素蛋白酶體系（Ubiquitin Proteasome System UPS)中的一部分，其編碼 的E2B泛素結(jié)合酶與泛素激活酶、泛素連接酶一起將SKDa大小的泛素蛋白共軛結(jié)合在特定 的蛋白底物上，通常對目的蛋白進(jìn)行泛素化作用，通過蛋白酶體將泛素化的目的蛋白降解， 而單一的泛素化作用卻參與許多生命過程，包括機(jī)體代謝平衡、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞器的生物合 成、細(xì)胞周期調(diào)控、DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡、抗原加工和基因表達(dá)等。
[0004] UBE2B基因編碼的蛋白序列在小鼠、大鼠和人完全相同，表明該基因在真核細(xì)胞中 高度保守。小鼠 UBE2B基因定位于染色體llq31. 3位點(diǎn)，其cDNA長度2141bp，開放閱讀框 458bp，編碼一個(gè)152個(gè)氨基酸，分子量為17. 3KDa的蛋白質(zhì)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，該基 因在小鼠睪丸支持細(xì)胞和圓形精子高表達(dá)。UBE2B基因敲除小鼠表現(xiàn)為雄性不育，精子數(shù)目 顯著減少，畸形精子數(shù)目明顯增多，精子運(yùn)動(dòng)力基本消失；進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，UBE2B基因 敲除小鼠精母細(xì)胞聯(lián)會(huì)復(fù)合體（Synaptonemal complex)、精子細(xì)胞核和鞭毛軸絲結(jié)構(gòu)均發(fā) 生異常。隨后的研究表明，組蛋白H2A是UBE2B作用的底物之一，UBE2B通過參與精母細(xì)胞 和精子細(xì)胞的組蛋白修飾，調(diào)節(jié)精子發(fā)生的過程。在精母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中，X與Y染色 體形成XY復(fù)合體（XY body),而失去轉(zhuǎn)錄活性,這一過程與組蛋白的修飾密切相關(guān)。
[0005] 人的UBE2B基因定位于染色體5q31. 1，含有6個(gè)外顯子。人類HR6A(UBE2A)和 HR6B (UBE2B)是與酵母菌Rad6基因非常相似的兩種同源染色體，在隨后的研究中發(fā)現(xiàn)HR6A 基因敲除小鼠有正常的生育能力，但是，當(dāng)敲除小鼠的UEB2B基因時(shí)，雄性小鼠表現(xiàn)為不 育，由此可推斷UBE2B基因在雄性小鼠生育能力上有重要作用。在人的UEB2B基因中，目 前已知有476個(gè)基因多態(tài)性，其中一些與男性不育有關(guān)。Suryavathi等比較530例男性不 育患者和300例健康男性UBE2B基因 SNP差異，發(fā)現(xiàn)與男性不育癥發(fā)生相關(guān)的5個(gè)SNP位 點(diǎn)，在患者和健康男性的發(fā)生率分別為37. 5%和7. 3%。上述結(jié)果表明UBE2B基因?qū)τ谛?鼠和人的精子發(fā)生具有重要的調(diào)節(jié)作用。近來，國外的一些研究認(rèn)為UBE2B基因啟動(dòng)子5' 端非編碼區(qū)（5'UTR)的突變同樣導(dǎo)致男性不育的風(fēng)險(xiǎn)增加，該研究發(fā)現(xiàn)同野生型相比，在 UBE2B基因的5' UTR區(qū)，不管是一個(gè)還是兩個(gè)CGG序列的缺失都將增強(qiáng)特異性β 1糖蛋白 (specific^ lglycoprotein SP1)與UBE2B啟動(dòng)子的親和力，這可能導(dǎo)致男性不育。而Spl 作為廣泛存在的轉(zhuǎn)錄激活因子在既往的研究中表明其在人類精子發(fā)生過程中的多個(gè)步驟 發(fā)揮重要作用。
[0006] 基因多態(tài)性可能會(huì)增加男性不育的易感性，最近的研究分析表明啟動(dòng)子多態(tài)性可 能作為損害精子發(fā)生過程的一個(gè)潛在危險(xiǎn)因素，例如雌激素 α受體啟動(dòng)子多態(tài)性可導(dǎo)致 精子數(shù)量顯著下降，而伊朗國家不育患者的HO-I基因啟動(dòng)子GT序列的重復(fù)擴(kuò)張與少精子 癥和無精子癥相關(guān)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供一種與男性不育癥相關(guān)的遺傳標(biāo)記。
[0008] 本發(fā)明提供一種與男性不育癥相關(guān)的遺傳標(biāo)記，其序列是UBE2B基因的序列，所 述UBE2B基因的啟動(dòng)子區(qū)域突變，突變位點(diǎn)選自Chr. 133706771T>A、Chr. 133706876T>G、 Chn 133706925A>G 和 Chr. 133706996T>G 中的一個(gè)或多個(gè)。
[0009] 一種與男性不育癥相關(guān)的遺傳標(biāo)記，其序列是UBE2B基因的序列，所述UBE2B 基因的啟動(dòng)子區(qū)域與轉(zhuǎn)錄因子SPl的結(jié)合位點(diǎn)突變，突變位點(diǎn)選自Chr. 133706771T>A、 Chr. 133706876T>G 和 Chr. 133706925A>G 中的一個(gè)或多個(gè)。
[0010] 不育癥是無精子癥。
[0011] 一般的，突變位點(diǎn)選自上述突變位點(diǎn)中的一個(gè)。
[0012] 所述突變位點(diǎn)是 Chr. 133706925A>G。
[0013] 檢測所述遺傳標(biāo)記的引物對，其上游引物的序列如SEQ ID N0:7所示，其下游引物 的序列如SEQ ID N0:8所示。
[0014] 一種男性不育癥的檢測試劑盒，能夠特異性識別所述的遺傳標(biāo)記。
[0015] 一種所述引物對的用于檢測男性不育癥的試劑盒。
[0016] 一種所述遺傳標(biāo)記在制備男性不育癥檢測試劑盒上的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明的有益效果是：通過大規(guī)模測序在男性不育癥病人中篩選出了 UBE2B基因 啟動(dòng)子區(qū)域的四個(gè)新的突變位點(diǎn)，將轉(zhuǎn)錄因子質(zhì)粒分別與野生型質(zhì)粒和突變體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 到細(xì)胞內(nèi)，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其功能有明顯差異，表明UBE2B基因啟動(dòng)子區(qū)域的突變與男性不 育癥（尤其是無精子癥）具有相關(guān)性，從而能夠通過該突變來實(shí)現(xiàn)對男性不育癥的診斷檢 測。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1是UBE2B啟動(dòng)子區(qū)域的基因突變鑒定結(jié)果圖；
[0019] 圖2是雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的結(jié)果圖，橫坐標(biāo)分別表示對照組、野生型、 mutl、mut2及mut3突變體，對于每組，左側(cè)方柱表示轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，右側(cè)方柱表示轉(zhuǎn)染 293FT細(xì)胞；
[0020] 圖3是含有UBE2B mut3突變的患者的病理切片的組織形態(tài)學(xué)結(jié)果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面通過【具體實(shí)施方式】結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0022] 1實(shí)驗(yàn)材料
[0023] I. 1男性不育患者和有正常生育能力男性的血液標(biāo)本
[0024] 收集北京大學(xué)深圳醫(yī)院300例特發(fā)性無精子癥（IA)患者和300例有正常生育能 力男性的血液標(biāo)本。根據(jù)WHO的IA診斷標(biāo)準(zhǔn)納入患者，其標(biāo)準(zhǔn)如下：1) 3次離心鏡檢精液 仍未見到精子，2)骨盆腔和生殖系統(tǒng)無驗(yàn)證和損傷，3)無內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，4)無染色體核 型異常和Y染色體微缺失。對于無精子癥患者盡可能行睪丸活檢和組織類型分析，對照組 入選的每例正常男性至少生育一個(gè)孩子。每例受試者均認(rèn)真簽署知情同意書，本次研究由 醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。
[0025] 1. 2人外周血組織DNA的提取
[0026] 用枸櫞酸鈉抗凝管收集研究對象的外周血，迅速置于_80°C冰箱中備用，用QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒提取外周血DNA。
[0027] 1. 3普通PCR擴(kuò)增UBE2B基因編碼區(qū)上游啟動(dòng)子和5' UTR區(qū)域
[0028] 以提取的外周血DNA為模板，使用特異性引物針對UBE2B基因編碼區(qū)上游啟動(dòng)子 和5' UTR區(qū)域進(jìn)行特異性擴(kuò)增，該啟動(dòng)子和5' UTR區(qū)域的長度為2551bp。UBE2B啟動(dòng)子序 列從NCBI數(shù)據(jù)庫中查得。引物由Invitrogen公司合成，合成用的4種引物對見表1。采用 promoter 1引物對的PCR產(chǎn)物的序列如SEQ ID NO: 11所示。采用promoter 2引物對的 PCR產(chǎn)物的序列如SEQ ID NO: 12所示。采用promoter 3引物對的PCR產(chǎn)物的序列如SEQ ID NO: 13所示。采用promoter 4弓丨物對的PCR產(chǎn)物的序列如SEQ ID NO: 14所示。上述 promoter 1?4引物涵蓋UBE2B基因的整個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域，可檢測該區(qū)域的突變，且篩選出的 promoter 4引物能夠檢測出本發(fā)明的四種突變。UBE2B基因在NCBI數(shù)據(jù)庫中的編號Gene ID:7320。
[0029] 表1UBE2B啟動(dòng)子引物
[0030]

【權(quán)利要求】
1. 一種與男性不育癥相關(guān)的遺傳標(biāo)記，其序列是UBE2B基因的序列，所述UBE2B基因的 啟動(dòng)子區(qū)域突變，突變位點(diǎn)選自 Chr. 133706771T>A、Chr. 133706876T>G、Chr. 133706925A>G 和Chr. 133706996T>G中的一個(gè)或多個(gè)。
2. -種與男性不育癥相關(guān)的遺傳標(biāo)記，其序列是UBE2B基因的序列，所述UBE2B基 因的啟動(dòng)子區(qū)域與轉(zhuǎn)錄因子SP1的結(jié)合位點(diǎn)突變，突變位點(diǎn)選自Chr. 133706771T>A、 Chr. 133706876T>G 和 Chr. 133706925A>G 中的一個(gè)或多個(gè)。
3. 如權(quán)利要求2所述的遺傳標(biāo)記，其特征在于，所述突變位點(diǎn)是Chr. 133706925A>G。
4. 檢測權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的遺傳標(biāo)記的引物對，其上游引物的序列如SEQ ID N0:7所示，其下游引物的序列如SEQ ID N0:8所示。
5. -種男性不育癥的檢測試劑盒，其特征在于，能夠特異性識別權(quán)利要求1-3中任意 一項(xiàng)所述的遺傳標(biāo)記。
6. -種含有權(quán)利要求4所述引物對的用于檢測男性不育癥的試劑盒。
7. -種權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的遺傳標(biāo)記在制備男性不育癥檢測試劑盒上的 應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/11GK104293781SQ201410444434
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月2日
【發(fā)明者】牟麗莎, 黃衛(wèi)人, 刁瑞英, 吳漢偉, 蔡志明 申請人:深圳市第二人民醫(yī)院