Timp-1基因在制備治療糖尿病皮膚創(chuàng)面產(chǎn)品中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及TIMP-1基因在制備治療糖尿病皮膚創(chuàng)面產(chǎn)品中的應(yīng)用。用TIMP-1基因和腺病毒載體或慢病毒載體構(gòu)建攜帶TIMP-1基因的重組表達(dá)載體；將攜帶TIMP-1基因的重組表達(dá)載體和腺病毒載體穿梭質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，獲得攜帶TIMP-1基因的重組腺病毒；將攜帶TIMP-1基因的重組腺病毒轉(zhuǎn)染到糖尿病人或動(dòng)物模型皮膚細(xì)胞，提高TIMP-1表達(dá)水平；本發(fā)明證明TIMP-1可以抑制由于高糖導(dǎo)致糖尿病人皮膚中成纖維細(xì)胞過(guò)多凋亡，從而加速糖尿病皮膚創(chuàng)面的愈合，也為發(fā)明TIMP-1基因作為防治糖尿病足部慢性潰瘍新的治療靶點(diǎn)和藥物提供依據(jù)。
【專利說(shuō)明】TIMP-1基因在制備治療糖尿病皮膚創(chuàng)面產(chǎn)品中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及--ΜΡ-1基因在制備治療糖尿病皮膚創(chuàng)面產(chǎn) 品中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著人們生活方式的改變以及人均壽命的延長(zhǎng)，糖尿病發(fā)病率急劇增加。在我們 國(guó)家，糖尿病已經(jīng)成為慢性皮膚傷口的主要病因。糖尿病足潰瘍是糖尿病足的主要表現(xiàn)，也 是導(dǎo)致糖尿病患者截肢的重要原因。糖尿病患者皮膚易損傷，且足潰瘍一旦發(fā)生，治療非常 困難，很難愈合，而且治療周期長(zhǎng)，醫(yī)療費(fèi)用高，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。因此，糖尿病皮 膚病變的防治研宄是臨床急待探討的重要課題之一。
[0003] 生物因子失調(diào)是糖尿病創(chuàng)面愈合延遲的重要原因之一。多種細(xì)胞因子被證明可 以局部應(yīng)用在糖尿病創(chuàng)面，加速創(chuàng)面愈合，達(dá)到預(yù)防或者治療糖尿病足的作用。組織金屬 蛋白酶抑制劑 _1 (tissue inhibitor of metalloproteinase-l，TIMP-l)基因 （Genbank No. NC_000023. 11)編碼的--ΜΡ-1因具有廣泛地抑制金屬蛋白酶活性的作用而得到大家的 關(guān)注，但未見(jiàn)其本身作為一種蛋白因子作用于皮膚成纖維細(xì)胞，發(fā)揮抗凋亡作用而促進(jìn)糖 尿病皮膚慢性潰瘍愈合的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足，提供--ΜΡ-1基因在制備治療糖 尿病皮膚創(chuàng)面產(chǎn)品中的應(yīng)用，該--ΜΡ-1基因編碼的--ΜΡ-1蛋白可以作為糖尿病足治療的 生物因子之一，加速糖尿病皮膚創(chuàng)面愈合，降低糖尿病足導(dǎo)致的截肢率減少醫(yī)療費(fèi)用和提 高患者生活質(zhì)量。
[0005] 本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0006] --ΜΡ-1基因在制備治療糖尿病皮膚創(chuàng)面產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述的--ΜΡ-1基因作為 糖尿病足治療的生物因子之一，抑制由于高糖（糖基化終末產(chǎn)物）導(dǎo)致糖尿病人皮膚中成 纖維細(xì)胞過(guò)多凋亡，從而加速糖尿病皮膚創(chuàng)面的愈合。
[0007] 所述的治療糖尿病皮膚創(chuàng)面產(chǎn)品包括：用--ΜΡ-1基因和腺病毒載體或慢病毒 (HIV)載體構(gòu)建攜帶--ΜΡ-1基因的重組表達(dá)載體；將攜帶--ΜΡ-1基因的重組表達(dá)載體（骨 架質(zhì)粒）和腺病毒載體穿梭質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染ΗΕΚ293細(xì)胞，獲得攜帶--ΜΡ-1基因的重組腺病毒； 將攜帶--ΜΡ-1基因的重組腺病毒轉(zhuǎn)染到糖尿病人或動(dòng)物模型皮膚細(xì)胞，提高--ΜΡ-1表達(dá) 水平；
[0008] 所述的攜帶--ΜΡ-1基因的重組表達(dá)載體，是將--ΜΡ-1基因序列與腺病毒載體或 慢病毒（HIV)載體連接得到的；
[0009] 所述的腺病毒載體優(yōu)選為pDC316-mCMV-EGFP ;
[0010] 所述的攜帶--ΜΡ-1基因的重組表達(dá)載體的制備方法，包含如下步驟：
[0011] ⑴引物設(shè)計(jì)：
[0012] 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中--ΜΡ-1基因的⑶S序列信息，設(shè)計(jì)帶有Not I、EcoRV酶切位 點(diǎn)的擴(kuò)增引物，引物序列如下：
[0013] TIMP-INotIF ：
[0014] 5'-ATAAGAATGCGGCCGCGCCACCATGGCCCCCTTTGAGCCCCTG-3' ；
[0015] TIMP-lEcoRVIR ：
[0016] 5'-ACGGATATCTCAGGCTATCTGGGACCGCAGG-3' ；
[0017] (2)--ΜΡ-1基因 CDS片段的獲得：
[0018] 以人cDNA為模板，使用步驟（1)設(shè)計(jì)的引物--ΜΡ-lNotIF和HMPlEcoRVIR擴(kuò)增 回收--ΜΡ-1基因⑶S片段；
[0019] (3)攜帶--ΜΡ-1基因的重組表達(dá)載體的構(gòu)建
[0020] 將步驟（2)中回收后的--ΜΡ-1基因⑶S片段與載體pDC316-mCMV-EGFP分別用 Not I、EcoR酶切并連接，得到攜帶--ΜΡ-1基因的重組表達(dá)載體；
[0021] 所述的攜帶--ΜΡ-1基因的重組腺病毒的制備方法，包含如下步驟：
[0022] 1)重組腺病毒AD---ΜΡ-Ι的包裝
[0023] 采用Ad5腺病毒改建的AdMaxTM重組腺病毒包裝系統(tǒng)，腺病毒載體穿梭質(zhì)粒和攜 帶--ΜΡ-1基因的重組表達(dá)載體（骨架質(zhì)粒）共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，在Cre-Ioxp重組酶作 用下包裝形成E1/E3缺失的復(fù)制型腺病毒；當(dāng)大部分細(xì)胞（80%以上細(xì)胞）收縮變圓、脫落 時(shí)，離心收集細(xì)胞，反復(fù)凍融裂解細(xì)胞后收集上清，得到第一代重組腺病毒；
[0024] 2)重組腺病毒AD---ΜΡ-Ι的擴(kuò)增
[0025] 培養(yǎng)擴(kuò)增HEK293細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80?90 %時(shí)加入第一代重組腺病毒； 感染48h后收集細(xì)胞，反復(fù)凍融裂解細(xì)胞，離心、收集病毒上清，得到第二代重組腺病毒；
[0026] 3)高滴度重組腺病毒的獲得
[0027] 重復(fù)步驟2)，反復(fù)感染HEK293細(xì)胞，獲得高滴度重組腺病毒；
[0028] 步驟1)中所述的共轉(zhuǎn)染優(yōu)選采用脂質(zhì)體法進(jìn)行共轉(zhuǎn)染；
[0029] 步驟1)和步驟2)中所述的反復(fù)凍融裂解細(xì)胞的具體操作優(yōu)選為-80°C /37°C反 復(fù)凍融3次；
[0030] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：
[0031] 本發(fā)明證明--ΜΡ-1可以抑制由于高糖（糖基化終末產(chǎn)物）導(dǎo)致糖尿病人皮膚中 成纖維細(xì)胞過(guò)多凋亡，從而加速糖尿病皮膚創(chuàng)面的愈合，也為發(fā)明--ΜΡ-1基因作為防治糖 尿病足部慢性潰瘍新的治療靶點(diǎn)和藥物提供依據(jù)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0032] 圖1是實(shí)施例1中兩組足部傷口皮膚Cleaved Caspase-3免疫組化染色后免疫反 應(yīng)評(píng)分結(jié)果分析圖，其中，對(duì)照組為非糖尿病組；* :與對(duì)照組對(duì)比，P〈〇. 05。
[0033] 圖2是實(shí)施例1中兩組足部傷口皮膚TUNEL-P0D細(xì)胞凋亡染色后凋亡指數(shù)結(jié)果分 析圖，其中，對(duì)照組為非糖尿病組；* :與對(duì)照組對(duì)比，P〈〇. 05。
[0034] 圖3是實(shí)施例1中兩組足部傷口皮膚--ΜΡ-1免疫組化染色后免疫反應(yīng)評(píng)分結(jié)果 分析圖，其中，對(duì)照組為非糖尿病組；* :與對(duì)照組對(duì)比，Ρ〈〇. 05。
[0035] 圖4是實(shí)施例2中不同因素作用72h對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞凋亡率影響比較分析 圖，* :與正常濃度糖組對(duì)比，P〈〇. Ol :與持續(xù)高糖組對(duì)比，P〈〇. 05。
[0036] 圖5是實(shí)施例2中糖基化終末產(chǎn)物（AGEs)對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞--ΜΡ-1表達(dá)影響 的結(jié)果分析圖，* :與對(duì)照組對(duì)比，P〈〇. 05。
[0037] 圖6是實(shí)施例3中TUNEL法檢測(cè)rhHMP-l作用72h對(duì)糖基化終末產(chǎn)物誘導(dǎo)的原 代皮膚成纖維細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果分析圖，其中，* :與對(duì)照組對(duì)比，P〈〇. 05 :與糖基化終 末產(chǎn)物組對(duì)比，p〈0. 05。
[0038] 圖7是實(shí)施例3中Western Blot檢測(cè)rhUMP-l (10ng/mL)作用72h對(duì)糖基化終 末產(chǎn)物誘導(dǎo)的Cleaved Caspase-3表達(dá)水平的影響結(jié)果分析圖，其中，* :與對(duì)照組對(duì)比， p〈0. 05 :與糖基化終末產(chǎn)物組對(duì)比，p〈0. 05。
[0039] 圖8是實(shí)施例4中擴(kuò)增--ΜΡ-1基因片段PCR產(chǎn)物以及重組質(zhì)粒酶切鑒定瓊脂糖 凝膠電泳圖，Α，--ΜΡ-1基因片段PCR產(chǎn)物鑒定結(jié)果，M :DL2000DNAMarker，泳道1 :--ΜΡ-1基 因片段PCR產(chǎn)物；Β，重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果，M :DL2000DNA Marker ;泳道1?2 :分別為空 載酶切前后；泳道3?4 :分別為pDC316-mCMV-EGFP-TMP-l酶切前后。
[0040] 圖9是實(shí)施例4中AD---ΜΡ-Ι和AD-EGFP轉(zhuǎn)染后到獲得Pl代病毒的綠色熒光圖 (X40) 〇
[0041] 圖10是實(shí)施例4中AD---ΜΡ-Ι和AD-EGFP感染HEK293細(xì)胞擴(kuò)增病毒圖（X 40)。
[0042] 圖11是實(shí)施例4中AD---ΜΡ-Ι作用48h對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率比較分析 圖，其中，A :轉(zhuǎn)染率平均值和標(biāo)準(zhǔn)差；B :轉(zhuǎn)染流式細(xì)胞計(jì)數(shù)圖例。
[0043] 圖12是實(shí)施例4中人皮膚成纖維細(xì)胞感染AD---ΜΡ-Ι不同時(shí)間的存活率比較分 析圖，* :與 MOI = 0 對(duì)比，ρ〈0· 05。
[0044] 圖13是實(shí)施例4中EGFP在人皮膚成纖維細(xì)胞的表達(dá)的熒光圖（X 100)。
[0045] 圖14是實(shí)施例4中--ΜΡ-1在人皮膚成纖維細(xì)胞的表達(dá)分析圖，其中，* :與無(wú)感染 組（CON)對(duì)比，ρ〈0· 05 :與 AD-EGFP 組對(duì)比，ρ〈0· 05。
[0046] 圖15是實(shí)施例4中AD---ΜΡ-Ι轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)AGEs誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞凋亡結(jié)果 分析圖，A :凋亡率比較；B :TUNEL檢測(cè)圖例（Χ100)。與CON組對(duì)比，ρ〈0. 05 ;Λ :與AGEs對(duì) 比，ρ〈0· 05 :與 AGEs+AD-EGFP 對(duì)比，ρ〈0· 05。
[0047] 圖16是實(shí)施例5中糖尿病大鼠創(chuàng)面邊緣點(diǎn)狀注射藥物示意圖。
[0048] 圖17是實(shí)施例5中4組心肝腎組織HE染色圖（X400)。
[0049] 圖18是實(shí)施例5中不同時(shí)間4組--ΜΡ-1蛋白表達(dá)水平的比較分析圖，其中，A : PBS 對(duì)照組；B :rh-HMP-l 組；C !AD-EGFP 組；D :AD-HMP-1 組；* 與 PBS 組對(duì)比，ρ〈0· 05 ;# 與 rhUMP-l 組對(duì)比，ρ〈0· 05 ;Λ與 AD-EGFP 組對(duì)比，ρ〈0· 05。
[0050] 圖19是實(shí)施例5中不同時(shí)間4組傷口愈合情況的比較分析圖。
[0051] 圖20是實(shí)施例5中4組傷口形成第7天和14天細(xì)胞凋亡TUNEL染色分析圖 (X200)〇

【具體實(shí)施方式】
[0052] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0053] 實(shí)施例1糖尿病患者傷口皮膚細(xì)胞凋亡及--ΜΡ-1表達(dá)的檢測(cè)
[0054] 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與取材：皮膚標(biāo)本
[0055] 糖尿病足組：自2011年6月至2013年4月于我科因糖尿病足住院的2型糖尿病患 者18例，平均年齡為62± 13. 14歲；非糖尿病組：自2011年6月至2013年4月于我院骨科 因足部外傷行外科手術(shù)治療的住院的非糖尿病患者18例，平均年齡為55± 15. 45歲。所取 標(biāo)本經(jīng)患者知情同意。所有皮膚標(biāo)本均在局部感染控制后取材，距離足部傷口邊緣0. 5cm。 剪取皮膚標(biāo)本后以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛溶液固定，制作厚度5 μ m石蠟切片；
[0056] (1)糖尿病患者傷口皮膚細(xì)胞凋亡檢測(cè)
[0057] ①活化的Caspase-3 (Cleaved Caspase-3)免疫組織化學(xué)染色：
[0058] Caspase家族是細(xì)胞凋亡的介導(dǎo)者和執(zhí)行者，在引起凋亡中起關(guān)鍵作用，Cleaved Caspase-3表達(dá)增高時(shí)提示依賴Caspase途徑的細(xì)胞凋亡增加。
[0059] 采用SABC(鏈霉親和素-生物素復(fù)合物）法染色：即用型SABC試劑盒購(gòu)自武 漢博士德生物工程有限公司，一抗為兔抗人的Cleaved Caspase-3單克隆抗體（CST公 司），二抗為生物素標(biāo)記的山羊抗兔第二抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；具體的 實(shí)驗(yàn)方法和步驟按照試劑盒中的說(shuō)明進(jìn)行，染色過(guò)程中均設(shè)有陰性對(duì)照。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)： 細(xì)胞漿有棕色著色的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞，無(wú)棕色著色的為陰性細(xì)胞。免疫組化染色結(jié)果按 照 IRS 標(biāo)準(zhǔn)（參考文獻(xiàn)：Remmele ff, Stegner. Recommendation for uniform definition of an immunoreactive score (IRS)for immunohistochemical estrogen receptor detection (ER-ICA) in breast cancer tissue. Pathologe, 1987, 8 (3) :138-140.)進(jìn)行評(píng) 分，IRS = P*I。P為陽(yáng)性細(xì)胞百分比：沒(méi)有陽(yáng)性細(xì)胞，P = 0 ;陽(yáng)性細(xì)胞占 I?24%，P = I ; 陽(yáng)性細(xì)胞占25?49%，P = 2 ;陽(yáng)性細(xì)胞占50?74%，P = 3 ;陽(yáng)性細(xì)胞占75?100%，P =4。I為染色強(qiáng)度：沒(méi)有染色，I = 0 ;染色淺，I = 1 ;染色中等強(qiáng)度，I = 2 ;染色深，I = 3。每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野評(píng)分，取平均值。
[0060] ② TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling)檢測(cè)：
[0061] 米用 In situ cell death detection kit-POD 法，試劑盒購(gòu)自羅氏公司（Cat. NO. 11684817910)，方法和步驟按照試劑盒中的說(shuō)明進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)過(guò)程設(shè)有陰性對(duì)照。每個(gè)標(biāo) 本隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)>1000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞核中有棕黃色者即為凋亡細(xì)胞，計(jì)算凋 亡指數(shù)（Al)，AI =凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)X 100%。
[0062] (2)糖尿病患者傷口皮膚--ΜΡ-1檢測(cè)
[0063] --ΜΡ-1主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，為多功能蛋白，廣泛表達(dá)于創(chuàng)面皮膚角質(zhì)細(xì) 胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。
[0064] 采用SABC法染色：即用型SABC試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，一抗為 兔抗人的TIMP-I單克隆抗體（EPITOMICS公司），方法和步驟按照試劑盒中的說(shuō)明進(jìn)行。
[0065] 結(jié)果分析：
[0066] (1)糖尿病患者足部傷口皮膚細(xì)胞凋亡情況
[0067] 本實(shí)施例通過(guò)Cleaved Caspase-3免疫組織化學(xué)染色法和TUNEL兩種方法檢測(cè)非 糖尿病患者和糖尿病患者足部傷口皮膚細(xì)胞凋亡情況；結(jié)果表明：糖尿病患者皮膚創(chuàng)面細(xì) 胞凋亡明顯增加，發(fā)生凋亡的細(xì)胞以真皮層中的成纖維細(xì)胞為主，有少量角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā) 生；Cleaved Caspase-3在非糖尿病組和糖尿病組的表達(dá)（IRS評(píng)分）分別為I. 04±0. 23 和3. 04±0. 31 (圖1)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p〈0. 05);兩組TUNEL檢測(cè)凋亡率分別為 3. 8±0. 8%和8. 4±1.5% (圖2)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p〈0. 05)。
[0068] (2)糖尿病患者足部傷口皮膚TIMP-I的蛋白表達(dá)情況
[0069] --ΜΡ-1蛋白主要定位在細(xì)胞漿和胞膜，在糖尿病患者和非糖尿病患者皮膚創(chuàng)面 的表皮層和真皮層成纖維細(xì)胞、巨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞均有表達(dá)，但兩者分布不同，強(qiáng)弱不 等。在非糖尿病皮膚創(chuàng)面，--ΜΡ-1在表皮靠近基底層的角質(zhì)細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，在真皮層 呈中等強(qiáng)度陽(yáng)性表達(dá)。在糖尿病患者皮膚創(chuàng)面，--ΜΡ-1在巨噬細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，在角質(zhì) 細(xì)胞和成纖維細(xì)胞呈弱陽(yáng)性表達(dá)。糖尿病組和非糖尿病組IRS評(píng)分分別為6. 2±1. 76和 3. 5± I. 01 (圖3)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p〈0. 05)，表明較之非糖尿病組，糖尿病組皮膚創(chuàng) 面--ΜΡ-1的蛋白表達(dá)水平下降。
[0070] 實(shí)施例2糖基化終末產(chǎn)物（AGEs)對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞凋亡和--ΜΡ-1表達(dá)的影響
[0071] (1)細(xì)胞來(lái)源本院泌尿外科或小兒外科正常兒童包皮環(huán)切術(shù)后的手術(shù)標(biāo)本，均經(jīng) 患者家屬同意后留取標(biāo)本。實(shí)驗(yàn)對(duì)象為第4?6代細(xì)胞；
[0072] 人皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)：通過(guò)原代培養(yǎng)獲得人皮膚成纖維細(xì)胞，按IX IO4/孔的密 度接種至6孔板，細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期60 %融合，更換體積分?jǐn)?shù)為0. 5%的胎牛血清的正 糖培養(yǎng)基進(jìn)行饑餓24h，使細(xì)胞進(jìn)入同步化狀態(tài)；細(xì)胞分為2組：一組為正常對(duì)照組（含NG 5. 6mmo/L，此處的NG是指正常濃度葡萄糖，以下細(xì)胞培養(yǎng)的所有的組都含NG的，因?yàn)镹G是 正常培養(yǎng)基的成份），一組為糖基化終末產(chǎn)物（AGEs)組（含NG 5. 6mmo/L和AGEs 150ug/ mL)，按實(shí)驗(yàn)分組更換含或不含糖基化終末產(chǎn)物的培養(yǎng)基；繼續(xù)培養(yǎng)72h ;
[0073] (2)采用流式細(xì)胞儀Annexion-FITC聯(lián)合PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；
[0074] ①用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞并用PBS洗滌；
[0075] ②重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)（數(shù)量不少于1〇5)，然后IOOOg離心5min，收集細(xì)胞；
[0076] ③加入400 μ L I X Binding Buf fer輕輕重懸細(xì)胞；
[0077] ④加入5 μ L AnnexinV-FITC (中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院醫(yī)研中心提供），輕輕混 勻，室溫避光孵育15min ;
[0078] ⑤加入10 μ L PI (中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院醫(yī)研中心提供）染色液，輕輕混勻，冰 浴避光放置5min ;
[0079] ⑥在30min內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)；
[0080] (3)采用ELISA法測(cè)定上清中--ΜΡ-1蛋白水平，測(cè)定方法如下（--ΜΡ-IELISA試劑 盒，BLUE GENE 公司）：
[0081] ①收集步驟⑵細(xì)胞培養(yǎng)后的細(xì)胞上清液后4 °C 3000rpm離心30min，上清液 于-80°C以下保存，待酶聯(lián)免疫法測(cè)定；
[0082] ②同步胰酶-EDTA消化步驟（2)培養(yǎng)的細(xì)胞，收集于離心管后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；
[0083] ③建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：取出酶標(biāo)板，按照標(biāo)準(zhǔn)品的次序（濃度分別為0、0.5、1.0、2.5、 5. 0、10ng/mL)分別加入IOOuL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液于空白微孔中；
[0084] ④加樣：待測(cè)品孔每孔各加入步驟①制備的待測(cè)樣品100yL，空白對(duì)照加入 IOOuL的蒸餾水；
[0085] ⑤在各孔中加入50uL的酶標(biāo)記溶液（不含空白對(duì)照孔），將酶標(biāo)板用封口膠密封 后，37°C孵育反應(yīng)Ih ;
[0086] ⑥充分清洗酶標(biāo)板5次，保持各孔有充足的水壓（濃縮洗滌液以1:100的比例與 蒸餾水稀釋）。酶標(biāo)板洗滌后用吸水紙徹底拍干；
[0087] ⑦各孔分別加入顯色劑A 50uL和顯色劑B 50uL ;
[0088] ⑧37°C下避光反應(yīng)15min ;
[0089] ⑨各孔加入50uL終止液，終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)測(cè)定光密度和濃度。
[0090] 結(jié)果分析：
[0091] (1)糖基化終末產(chǎn)物（AGEs)對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞凋亡的影響
[0092] 流式細(xì)胞儀Annexion-FITC聯(lián)合PI雙染法檢測(cè)結(jié)果提示：人原代皮膚成纖維細(xì)胞 在正常對(duì)照和含AGEs培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)72h，凋亡率分別為2. 43±0. 19%、6. 83±0. 36% (圖4)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p〈0. 05)。
[0093] (2)糖基化終末產(chǎn)物（AGEs)對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞--ΜΡ-1表達(dá)的影響
[0094] 在正常對(duì)照的培養(yǎng)基，人皮膚成纖維細(xì)胞上清液中--ΜΡ-1的濃度4. 84± I. 63ng/ mL;而在AGEs(150ug/mL)作用72h后的人皮膚成纖維細(xì)胞上清液中--ΜΡ-1的濃度是 2. 64±0. 98ng/mL，較之正常對(duì)照組下降45. 5% (圖5)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AGEs抑制人皮膚成 纖維細(xì)胞--ΜΡ-1蛋白表達(dá)，與實(shí)施例1中糖尿病患者足部傷口皮膚--ΜΡ-1的蛋白表達(dá)水 平下降一致。
[0095] 實(shí)施例3外源rhHMP-l對(duì)AGEs誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞凋亡的影響
[0096] (1)細(xì)胞來(lái)源：同實(shí)施例2 ;
[0097] (2)流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞凋亡檢測(cè)：
[0098] 人皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)：通過(guò)原代培養(yǎng)獲得人皮膚成纖維細(xì)胞，按I X IO4/孔的 密度接種至6孔板；細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期60 %融合，更換體積分?jǐn)?shù)為0. 5%的胎牛血清的 正糖培養(yǎng)基進(jìn)行饑餓24h，使細(xì)胞進(jìn)入同步化狀態(tài)；細(xì)胞分為3組：正常對(duì)照組、AGEs組和 AGEs+rhTMP-1組，按實(shí)驗(yàn)分組更換上述不同處理的培養(yǎng)基，其中，正常對(duì)照組的培養(yǎng)基中 含 NG 5. 6mmo/L ;AGEs 組的培養(yǎng)基含 NG 5. 6mmo/L+AGEs 150ug/mL ;AGEs+rhHMP-l 組培養(yǎng) 基含 NG 5. 6mmo/L+AGEs 150ug/mL+rhHMP-l (濃度分別為 l、10、50、100ng/mL，CYTOLAB/ PEPROTECH ASIA公司）；分別繼續(xù)培養(yǎng)48h、72h、96h和120h，用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞 并用PBS洗滌后，送流式細(xì)胞儀進(jìn)行Annexion-FITC聯(lián)合PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，具體方 法參照實(shí)施例2 ;
[0099] (3) TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)：
[0100] 人皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)：通過(guò)原代培養(yǎng)獲得人皮膚成纖維細(xì)胞，按IX 1〇4/孔的 密度接種至96孔板；細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期60%融合，更換0. 5% (體積分?jǐn)?shù)）胎牛血清 的正糖培養(yǎng)基進(jìn)行饑餓24h，使細(xì)胞進(jìn)入同步化狀態(tài)；細(xì)胞分為3組：正常對(duì)照組、AGEs 組和AGEs+rhHMP-Ι組，按實(shí)驗(yàn)分組更換上述不同處理的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72h，其中正 常對(duì)照組的培養(yǎng)基中含NG 5. 6mmo/L ;AGEs組的培養(yǎng)基含NG 5. 6mmo/L+AGEs 150ug/mL ; AGEs+rhHMP-1 組培養(yǎng)基含 NG 5. 6mmo/L+AGEs 150ug/mL+rhHMP-110ng/mL(CYT0LAB/ PEPROTECH ASIA公司）；TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，細(xì)胞TUNEL方法步驟如下：
[0101] ①去培養(yǎng)基，PBS洗1次；
[0102] ②吸干，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的聚甲醛固定Ih，PBS洗5minX2次；
[0103] ③加入體積分?jǐn)?shù)為0· 1 %的Triton，冰上破膜2min，PBS洗5minX 2次；
[0104] ④配置 TUNEL 反應(yīng)液（Enzyme Solution :Label Solution = 1 :9)，冰上操作，即 用即配；
[0105] ⑤加入 TUNEL 反應(yīng)液 50uL，避光，37°C孵育 60min，PBS 洗 5minX3 次；
[0106] ⑥加入 Hochast (10ug/mL) 50uL，復(fù)染 6min，PBS 洗 5minX 3 次；
[0107] ⑦吸干，熒光顯微鏡下觀察；高倍鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)算凋亡率。
[0108] 細(xì)胞核呈紅色者即為凋亡細(xì)胞。凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)X 100%。
[0109] (4) Cleaved Caspase-3Western blot 檢測(cè)：
[0110] Western blot檢測(cè)步驟（3)中3種不同處理的細(xì)胞中Cleaved Caspase-3的表達(dá) 水平；
[0111] a)總蛋白提?。ㄒ韵虏襟E均在冰上完成）：
[0112] ①吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，冷PBS輕輕沖洗2次。
[0113] ②加入0. ImL預(yù)冷的細(xì)胞裂解緩沖液（200mM Tris-HCl，600mM NaCl，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1 % 的 NaN3,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1 % 的 SDS，5mg/mL PMSF，100 μ g/mLaprotinin，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 4% 的 即-40，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫氧膽酸，均為終濃度）加入細(xì)胞單層中，冰上放置3〇11^11;
[0114] ③用細(xì)胞刮將貼壁細(xì)胞刮落，把細(xì)胞碎片連同裂解液一起轉(zhuǎn)移到微量離心管， 4°C HOOOrpm 離心 30min ;
[0115] ④將上清小心轉(zhuǎn)移到干凈無(wú)菌離心管中，-80°C保存；
[0116] b)MiniBCA法測(cè)定提取物中蛋白質(zhì)濃度：
[0117] ①用 0· 5mg/mL 牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA)制備 0 ?500 μ g/mL 系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白液；
[0118] ②步驟①系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白液（25yL)與蛋白染色液（A+B)200 yL混勻后，測(cè) 定其在562nm波長(zhǎng)處的光密度值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；其中染色液A的組成成份（終濃度）：質(zhì) 量分?jǐn)?shù)為1 %的BCA二鈉鹽，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的無(wú)水碳酸鈉，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 16%的酒石酸鈉， 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為〇. 4%的氫氧化鈉，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 95%的碳酸氫鈉，pH值11. 25 ;染色液B的組 成成份（終濃度）：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的硫酸銅；染色液A與染色液B按照體積50 :1混勻即 得到染色液（A+B);
[0119] ③每個(gè)蛋白樣品取5 μ L，用20 μ L的三蒸水稀釋至25 μ L，再與蛋白染色液 (Α+Β) 200 μ L混勻，測(cè)定其在562nm波長(zhǎng)處的光密度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到對(duì)應(yīng)的濃度值， 該濃度值X5即為待測(cè)蛋白的濃度；
[0120] c)蛋白質(zhì)印跡
[0121] ①制膠：制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的變性聚丙烯酰胺濃縮膠和8%的變性聚丙烯酰胺 分離膠；
[0122] ②上樣：10 μ L樣品或預(yù)染蛋白Marker與10 μ L 2X變性聚丙稀酰胺凝膠電泳上 樣緩沖液混勻，煮沸5min后上樣于濃縮膠；
[0123] ③電泳：以200V電泳至溴芬蘭迀移至凝膠底部，電泳槽中放置冰袋以保持凝膠溫 度不超過(guò)20°C，單面膠電泳開(kāi)始時(shí)電流應(yīng)小于60mA，結(jié)束時(shí)電流應(yīng)小于30mA ;
[0124] ④轉(zhuǎn)膜：取出分離膠，在轉(zhuǎn)膜緩沖液中與PVDF膜裝配成濕轉(zhuǎn)體系，以100V電轉(zhuǎn) 120min，濕轉(zhuǎn)槽中放置冰袋以保持轉(zhuǎn)移體系溫度不超過(guò)20°C，單面膠電轉(zhuǎn)開(kāi)始時(shí)電流應(yīng)小 于250mA，結(jié)束時(shí)電流應(yīng)小于350mA ;
[0125] ⑤小心地取出PVDF膜，可見(jiàn)預(yù)染marker已從凝膠轉(zhuǎn)移至膜上；以20mL洗膜緩沖 液洗絳5minX 3次，不斷搖晃；
[0126] ⑥封閉：封閉液15mL浸膜，常溫?fù)u晃2h ;
[0127] ⑦加入15mL兔抗人Cleaved Caspase-3單克隆抗體（1 :1000,封閉液稀釋，CST公 司），4°C搖晃過(guò)夜；
[0128] ⑧20mL洗膜緩沖液洗滌15min X 1次及5min X 2次，不斷搖晃；
[0129] ⑨加入15mL辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(l :2000，封閉液稀釋，武漢博士 德生物工程有限公司），室溫?fù)u晃Ih ;
[0130] ⑩20mL洗膜緩沖液洗滌15min X 1次及5min X 4次，不斷搖晃；
[0131] ?顯色：取ECL溶液1和溶液2 (Thermo公司）各50 μ L，與蒸餾水ImL混勻即配 成發(fā)光工作液；將發(fā)光液滴于膜上顯色1?IOmin ;
[0132] ?i曝光：在暗室中用鑷子小心地取出膜，用塑料膜包裹，將膜的蛋白面對(duì)著X光 片曝光5min，立即沖洗；
[0133] ?冼膜：曝光后，用洗膜緩沖液搖晃沖洗5minX4次；將膜置于50°C洗脫緩沖液 中搖晃30min ;再次置于洗膜緩沖液搖晃5minX6次；將一抗換成內(nèi)參照小鼠抗人單克隆 GAPDH，二抗換成辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG (武漢博士德生物工程有限公司）。
[0134] ?,用BandScan 4. 3軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度掃描，以總灰度代表蛋白的表達(dá)量，以 目的蛋白與GAPDH的比值代表目的蛋白水平。
[0135] 結(jié)果分析：
[0136] (l)rhHMP-l對(duì)AGEs誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞凋亡的影響
[0137] 通過(guò)流式細(xì)胞儀Annexion-FITC聯(lián)合PI雙染法檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：rhHMP-l作用 72h后，抗凋亡作用逐漸呈現(xiàn)，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，不同濃度rhTMP-l對(duì)AGEs (150ug/mL) 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響不同，低濃度1?10ng/mL對(duì)細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用，中等濃度50ng/ mL對(duì)凋亡無(wú)影響，而高濃度100ng/mL促進(jìn)細(xì)胞凋亡（表1)。
[0138] 表1不同濃度rhTMP-l對(duì)AGEs誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率比較（x±s, % )

【權(quán)利要求】
1. TMP-1基因在制備治療糖尿病皮膚創(chuàng)面產(chǎn)品中的應(yīng)用，其特征在于：所述的TMP-l 基因作為糖尿病足治療的生物因子之一，抑制由于高糖導(dǎo)致糖尿病人皮膚中成纖維細(xì)胞過(guò) 多凋亡，從而加速糖尿病皮膚創(chuàng)面的愈合。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的TIMP-1基因在制備治療糖尿病皮膚創(chuàng)面產(chǎn)品中的應(yīng)用，其特 征在于所述的治療糖尿病皮膚創(chuàng)面產(chǎn)品包括：用TIMP-1基因和腺病毒載體或慢病毒載體 構(gòu)建攜帶TMP-1基因的重組表達(dá)載體；將攜帶TMP-1基因的重組表達(dá)載體和腺病毒載體 穿梭質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染J1EK293細(xì)胞，獲得攜帶TMP-1基因的重組腺病毒；將攜帶TMP-1基因的 重組腺病毒轉(zhuǎn)染到糖尿病人或動(dòng)物模型皮膚細(xì)胞。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的TIMP-1基因在制備治療糖尿病皮膚創(chuàng)面產(chǎn)品中的應(yīng)用，其特 征在于： 所述的攜帶TMP-1基因的重組表達(dá)載體，是將TMP-1基因序列與腺病毒載體或慢病 毒載體連接得到的。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的TMP-1基因在制備治療糖尿病皮膚創(chuàng)面產(chǎn)品中的應(yīng)用，其特 征在于： 所述的腺病毒載體為pDC316-mCMV-EGFP。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的TIMP-1基因在制備治療糖尿病皮膚創(chuàng)面產(chǎn)品中的應(yīng)用，其特 征在于： 所述的攜帶TMP-1基因的重組表達(dá)載體的制備方法，包含如下步驟： (1) 引物設(shè)計(jì)： 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中TMP-1基因的⑶S序列信息，設(shè)計(jì)帶有Not I、EcoRV酶切位點(diǎn)的 擴(kuò)增引物，引物序列如下： TIMP-lNotIF ： 5'-ATAAGAATGCGGCCGCGCCACCATGGCCCCCTTTGAGCCCCTG~3,； TIMP-lEcoRVIR ： 5'-ACGGATATCTCAGGCTATCTGGGACCGCAGG~3,； (2) TMP-1基因⑶S片段的獲得： 以人cDNA為模板，使用步驟（1)設(shè)計(jì)的引物TMP-lNotIF和TMPlEcoRVIR擴(kuò)增回收 TMP-1基因⑶S片段； (3) 攜帶TMP-1基因的重組表達(dá)載體的構(gòu)建 將步驟（2)中回收后的TMP-1基因⑶S片段與載體pDC316-mCMV-EGFP分別用Not I、 EcoR酶切并連接，得到攜帶TMP-1基因的重組表達(dá)載體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的TMP-1基因在制備治療糖尿病皮膚創(chuàng)面產(chǎn)品中的應(yīng)用，其特 征在于： 所述的攜帶TMP-1基因的重組腺病毒的制備方法，包含如下步驟： 1)重組腺病毒AD-TMP-1的包裝 采用Ad5腺病毒改建的AdMaxTM重組腺病毒包裝系統(tǒng)，腺病毒載體穿梭質(zhì)粒和攜帶 TMP-1基因的重組表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，在Cre-loxp重組酶作用下包裝形成E1/ E3缺失的復(fù)制型腺病毒；當(dāng)大部分細(xì)胞收縮變圓、脫落時(shí)，離心收集細(xì)胞，反復(fù)凍融裂解細(xì) 胞后收集上清，得到第一代重組腺病毒； 2) 重組腺病毒AD-TMP-1的擴(kuò)增 培養(yǎng)擴(kuò)增J1EK293細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80?90%時(shí)加入第一代重組腺病毒；感染 48h后收集細(xì)胞，反復(fù)凍融裂解細(xì)胞，離心、收集病毒上清，得到第二代重組腺病毒； 3) 高滴度重組腺病毒的獲得 重復(fù)步驟2)，反復(fù)感染HEK293細(xì)胞，獲得高滴度重組腺病毒。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的TIMP-1基因在制備治療糖尿病皮膚創(chuàng)面產(chǎn)品中的應(yīng)用，其特 征在于： 步驟1)中所述的共轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體法進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的TIMP-1基因在制備治療糖尿病皮膚創(chuàng)面產(chǎn)品中的應(yīng)用，其特 征在于： 所述的反復(fù)凍融裂解細(xì)胞的具體操作為_(kāi)80°C /37°C反復(fù)凍融3次。
【文檔編號(hào)】C12N15/74GK104436214SQ201410438853
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年8月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月29日
【發(fā)明者】勞國(guó)娟, 嚴(yán)勵(lì), 任萌, 羅恒聰, 梁穎, 楊川 申請(qǐng)人:中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院