技術(shù)領(lǐng)域和目的

在生物醫(yī)學(xué)(即，藥品傳遞納米載體和骨再生)和牙醫(yī)學(xué)中所關(guān)注的生物材料。

本發(fā)明的目的是用于獲得檸檬酸鹽(形成骨的有機相的一部分的分子)涂敷的并且摻雜有氟化物的無定形磷酸鈣納米顆粒的方法。由于該材料除了促進細胞附著和骨骼生成以外，還具有優(yōu)異的生物降解能力和生物活性，所以其在生物醫(yī)學(xué)(即，藥品傳遞納米載體和骨再生)領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用。同樣，所述的材料在牙醫(yī)學(xué)中具有多種應(yīng)用，其中其作為牙本質(zhì)和牙釉質(zhì)的再礦化劑可以用于牙膏、漱口劑、氟化物涂膜、口香糖以及凝膠中。

所述的方法是基于兩種溶液：一方面，通過氯化鈣和檸檬酸鈉形成的溶液；另一方面，通過磷酸氫二鈉和碳酸鈉與氟化物形成的溶液，將它們在室溫下混合。關(guān)于現(xiàn)有技術(shù)，有利的是由于所述的方法不殘留任何酸性殘余物(在所述的合成中未使用強酸)，在單一的階段中合成(在合成中使用檸檬酸鈉作為反應(yīng)試劑)，并且首次獲得檸檬酸鹽涂敷的并且摻雜氟化物的無定形磷酸鈣(因此具有比無定形磷酸鈣具有更強的再礦化活性)，所以其是生態(tài)高效的并且是生態(tài)友好的。

背景技術(shù)：

在活的有機體中，無定形相是礦物質(zhì)磷酸鈣(cap)不常見的形式。無定形磷酸鈣(acp)在真核細胞和原核細胞的線粒體中發(fā)現(xiàn)，并且被認為是骨的礦物質(zhì)相(納米晶體碳磷灰石)的形成過程中的前體階段。近來發(fā)現(xiàn)，這種骨磷灰石的表面涂敷由檸檬酸鹽。在使用不同方法制備多種cap的過程中，acp還起到中間相的作用。由于這種材料的受關(guān)注的性質(zhì)，例如優(yōu)異的生物活性，促進細胞附著，還有利于骨骼傳導(dǎo)性和骨骼生成，所以其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用。同樣，所述的材料在牙醫(yī)學(xué)中具有多種應(yīng)用，其中其作為牙本質(zhì)和牙釉質(zhì)的再礦化劑可以用于牙膏、漱口劑、口香糖、凝膠以及氟化物涂膜中。

wo98/40406公開了一種產(chǎn)物，其是由使用酪蛋白穩(wěn)定的無定形磷酸鈣(一種在乳液中存在的磷蛋白)構(gòu)成的。該產(chǎn)物目前在牙膏、口香糖和牙齒美白治療后用作研磨材料。但是，尚未證實其在預(yù)防齲齒和再礦化受損的涂膜中的效力。在齒狀物(dentalpiece)的制備中，acp還作為填充材料而用于復(fù)合的聚合材料中。特別是由于以下事實，acp刺激牙齒修復(fù)：ca和磷酸根離子響應(yīng)于酸性ph而被釋放，其中所述的酸性ph是由牙菌斑產(chǎn)生的，牙菌斑以羥磷灰石形式沉積在牙齒結(jié)構(gòu)上，從而形成琺瑯質(zhì)(主要由羥磷灰石結(jié)晶構(gòu)成)。表1概括了acp作為生物材料的主要用途。

表1.用作生物材料的無定形磷酸鈣。

這些用途中的一些用途在j.zhaoetal.,amorphouscalciumphosphateanditsapplicationindentistry；chemistrycentraljournal(2011),5:40(doi:10.1186/1752-153x-5-40)中有所描述。

關(guān)于acp的制備，已知在足以沉淀的ph下由可溶性ca²⁺和po4^3-前體獲得多種形式，其中通常使用其陽離子不會產(chǎn)生其他物質(zhì)的可溶性前體，其中所述的其他物質(zhì)會后驗干擾終產(chǎn)物的組成，例如ca(oh)2,h3po4,磷酸鹽或磷酸氫銨。通常使用ca(no3)2。

除了(例如)其他多聚羧酸(例如酒石酸)以外，檸檬酸作為ca²⁺陽離子復(fù)合體的功能也是已知的，就制藥觀點而言，其也是可接受的。鑒于此，這些酸也用于穩(wěn)定acp的無定形組合物。這在公開專利wo03059304的權(quán)利要求書中列出，其中在具有ca²⁺陽離子的其他螯合劑前體中，建議檸檬酸，其占制備物的0.1重量％至5重量％，其中所述的制備物包含與磷肽結(jié)合的acp。

jp2001169121提出檸檬酸作為acp的穩(wěn)定劑的用途，其中所述的acp已經(jīng)通過以下過程形成：由磷酸和氫化鈣沉淀，在上述檸檬酸存在下使其經(jīng)歷隨后的磨制。

因此，這些公開文獻均未提及制備，例如本發(fā)明的方法主題，其中檸檬酸鹽作為用于acp沉淀的反應(yīng)試劑加入(在單階段方法中)，并且在沉淀后并非作為相中的穩(wěn)定劑加入(在二階段方法中)。

由dorozhkins.v.[nanosizedandnanocrystallinecalciumorthophsphates,actabiomaterialia(2010),no.6(3),715-734]；combesc.andreyc.[amorphouscalciumphosphates:synthesis,propertiesandusesinbiomaterials,actabiomaterialia(2010),no.6(9),3362-3378]進行的修改以及由dorozhkins.v.[amorphouscalciumphosphates,actabiomaterialia(2010),no.6(12),4457-4475進行的另一種修改公開了多種濕法，但是其中未采用本發(fā)明的方法主題的相同的條件、方法階段和反應(yīng)試劑。事實上，在這些制備中，檸檬酸通常被設(shè)想為分散劑，并且偶爾被設(shè)想為具有相似功能的碳酸根陰離子。

j.m.delgado-lópezetal.crystallizationofbioinspiredcitrate-functionalizednanoapatitewithtailoredcarbonatecontent(actabiomaterialia(2012)no.8,page3491)的公開物建立了磷灰石和檸檬酸鹽涂敷的納米晶體碳磷灰石的沉淀方法。在本領(lǐng)域的狀態(tài)下，本發(fā)明的方法主題與上述文件之間的主要差異如下：

(1)沉淀溫度。

(2)檸檬酸鹽涂敷的且氟化物摻雜的acp納米顆粒作為穩(wěn)定相的沉淀。

(3)不具有完備的沉淀方法。

(4)在沉淀物中未形成磷酸鈣的磷灰石或任何其他的晶體相。

發(fā)明概述

本發(fā)明的第一個目的是用于會的氟化物摻雜的檸檬酸鹽涂敷的無定形磷酸鈣(facp)的方法，其包括：

-濃度為0.08m至0.12m的cacl2溶液以及濃度為0.35m至0.50m的na3c6h5o7(檸檬酸鈉)的制備；

-第二溶液的制備，該第二溶液是由濃度為0.10m至0.15m的na2hpo4與na2co30.2m和氟化物形成；

-將之前階段中制備的2種溶液在ph為8.3至8.7(例如使用hcl調(diào)節(jié))和室溫下以1:1v/v的比例攪拌少于2分鐘的時間進行混合；

-通過離心進行3次連續(xù)的沉降循環(huán)，除去上清液，并使用超純水洗滌沉淀物；以及

-將濕態(tài)的沉淀物冷凍干燥。

在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，在第一溶液中使用的反應(yīng)試劑的濃度如下：cacl2，0.1m；na3c6h5o7，0.4m；而用于第二溶液的濃度如下：na2hpo4，0.12m；na2co3，0.2m。

所述的氟化物選自caf2,naf或kf，并且以濃度為0.01m至0.1m加入。在優(yōu)選的實施方案中，氟化物為caf2，并且以濃度為0.05m加入。

本發(fā)明的另一個目由通過之前的方法獲得的氟化物摻雜的無定形磷酸鈣納米顆粒以及na、ca、p、檸檬酸鹽、碳酸鹽、氟化物和結(jié)構(gòu)水內(nèi)含物構(gòu)成，其中所述的顆粒具有球形，大小為30nm至80nm，其中所述的內(nèi)含物由以下構(gòu)成：

-3.1重量％至3.5重量％的na；

-27.0重量％至27.4重量％的ca；

-37.0重量％至37.8重量％的p；

-3.5重量％至5.0重量％的檸檬酸鹽；

-5.4重量％至7.0重量％的碳酸鹽；

-6重量％至10重量％的水；

-2重量％至5重量％的氟化物。

在本發(fā)明的所述的方面中，術(shù)語“水”是指吸附水和結(jié)構(gòu)水。

在第三個方面中，本發(fā)明的另一個目的是納米顆粒在以下應(yīng)用中的用途，例如：

-生物分子和/或藥品的運輸；

-生物材料用于整形外科應(yīng)用中。

-在牙醫(yī)學(xué)中，優(yōu)選地作為用于制備填充和/或密封根管和牙齒修復(fù)的膠合劑的材料，或者作為牙膏、口香糖、漱口劑、氟化物涂膜、以及凝膠，從而通過磷酸鈣和氟化物離子的逐漸釋放而有利于琺瑯質(zhì)的再礦化。

附圖簡述

圖1示出檸檬酸鹽涂敷的acp(a)和facp(b)納米顆粒的透射電子顯微鏡(tem)圖像。針對各個納米顆粒所獲得的所選區(qū)域的電子衍射圖案(saed)也以插入物的方式示出。a中左側(cè)的插入物顯示單個納米顆粒的tem圖像。面板c和d分別代表acp和facpx-射線能量色散(eds)光譜。

圖2示出納米顆粒的x-射線衍射圖(a)和raman光譜(b)。

圖3示出與acp納米顆粒(100μg/ml,500μg/ml,1,000μg/ml)溫育1、3和7天的人類成骨細胞上實施的mtt細胞增殖測試。*p≤0:05；***p≤0:001；n＝3。

本發(fā)明的實施方案

通過將2種溶液混合，通過沉淀方法而獲得acp納米顆粒，其中所述的2種溶液包含：

(i)0.1mcacl2+0.4mna3c6h5o7；以及

(ii)0.12mna2hpo4+0.2mna2co3，

其中所述的2種溶液以1:1v/v的比例混合，總計200ml，并且使用hcl在環(huán)境溫度下將ph調(diào)節(jié)至8.5。

當混合物呈現(xiàn)乳白色外觀(在混合物后大約30s)時，通過離心使顆粒經(jīng)歷3次連續(xù)的沉降循環(huán)，除去上清液，并使用超純水(millipore)洗滌沉淀物。隨后，將濕態(tài)的沉淀物冷凍干燥，并隨后對該顆粒進行表征。

為了獲得這些氟化物摻雜的顆粒，將caf20.05m加入溶液(ii)中。

表征技術(shù)

使用scanningtransmissionelectronmicroscope(stemphilipscm20)在80kv下操作來分析納米顆粒。該設(shè)備還允許獲取所選區(qū)域的電子衍射(saed)圖案和x-射線能量色散(eds)光譜。就這些分析而言，冷凍干燥的樣品分散于超純水中，然后少量的這種懸液滴沉積在傳統(tǒng)的銅光柵上。

使用liberty200(varian,australia)光譜儀，使用發(fā)射光譜法(icp-oes)來定量ca和p的量。為此，將冷凍干燥的樣品溶解于濃縮的超純的硝酸(1％v/v)中。

使用sdtq600系統(tǒng)(tainstruments,newcastle,de,usa)在氮氣的恒定流動(100ml.min^-1)下并將溫度以10℃.min^-1的間隔升高至1,200℃進行熱重量分析(tga)。

使用裝配有pixcel檢測器(在45kv和40ma下操作，并具有入射cukα輻射)的x-pertpro(panalytical)衍射儀。使用輻射長度為10mm的可變光譜帶寬(反散射)。2θ范圍為5°至70°，并且2θ的增量為0.039。

使用labramhr光譜儀(jobin-yvon,horiba,japan)獲得raman光譜。該單元裝配有二極管激光器作為激發(fā)源(λ＝532nm)，以及peltier-冷卻的ccd檢測器(1026x256像素)。使用3cm^-1的光譜分辨率來獲得光譜。

使用philipsmagixpro(pw-2440)光譜儀，通過x-射線熒光光譜(xrf)來定量樣品中氟化物的量。此外，還通過復(fù)合有氯化氧鋯和鉻花青r的分光光度測定法并在570mm下測量復(fù)合物的吸光率來測定氟化物的含量。

體外細胞培養(yǎng)物的分析

使用人類成骨細胞的細胞系(mg-63,lonza,italy)來評價納米顆粒的生物應(yīng)答。將該細胞在dmem/f12培養(yǎng)基(paa,austria)中在37℃及co2氣氛(5％)中培養(yǎng)，其中所述的培養(yǎng)基包含10％胎牛血清(fbs)和青霉素-鏈霉素(100u/ml-100μg/ml)。隨后，通過胰蛋白酶化使細胞與它們的培養(yǎng)基分離，然后離心并再懸浮。使用臺盼藍不相容檢驗來計數(shù)活細胞(細胞活力檢驗)。將細胞沉積在96孔板上，并且密度為3.0x10³細胞/孔。24小時后，將3種不同濃度的檸檬酸鹽涂敷的acp納米顆粒(事先通過25kgyγ輻射滅菌)加入至細胞培養(yǎng)物(100μg/ml,500μg/ml,1,000μg/ml)中。將該細胞在標準的條件(37℃，5％co2)溫育1、3和7天。每3天更新培養(yǎng)物的培養(yǎng)基。所有這些測試都是在操作箱(laminarflowcabinet)中實施的。

mtt細胞毒性和細胞活力

mtt方法[3-(4.5-二甲基噻唑-2-基)-2.5-二苯基四唑溴化物]用于測定納米顆粒的可能毒性作用。這測試是基于在藍色化合物(甲瓚)中通過線粒體酶的琥珀酸脫氫酶對3-(4.5-二甲基噻唑-2-基)-2.5-二苯基四唑溴化物(mtt)(其濃度可以通過比色法測定)的代謝還原作用，從而可以測定所處理細胞的線粒體的功能性。

在37℃下，將與納米顆粒接觸1、3和7天后的細胞以1:10的比例在溶解于pbs(5mgml^-1)中的mtt中溫育2小時。然后，將該細胞與200μl二甲基亞砜(sigma)溫育15min，從而溶解甲瓚晶體。multiskanfcmicroplate(thermoscientific)光譜儀用于測量吸光率，其在570nm下與代謝活細胞的數(shù)量成正比。對于各個所研究的時間間隔(1、3和7天)來分析3種樣品。

結(jié)果

tem圖像(圖1)表明未摻雜的樣品acp(a)和摻雜樣品fcap(b)均為大小為30nm至80nm的球形納米顆粒。此外，saed圖案中的衍射點的吸光率表明它們的無定形本性。相應(yīng)地，eds光譜證明它們僅由ca和p組成。在摻雜的顆粒光譜中未觀察到f峰(其應(yīng)該在大約0.68kev處出現(xiàn))，可能是因為其被氧氣峰(0.2kev)(其是更強烈的)重疊。x-射線衍射圖案中峰的缺乏證明這些材料的不定性本性(圖2a)。raman光譜也是無定形磷酸鈣的特征，其在952cm^-1處出現(xiàn)主峰，相對于晶體羥磷灰石的主峰(961cm^-1)稍微遷移。通過tga,icp和x-射線熒光獲得的acp和facp材料的化學(xué)組成之前已經(jīng)描述。

使用成骨細胞(mg-63)來研究納米顆粒的生物應(yīng)答。將3種不同濃度的納米顆粒(100,500和1,000μg/ml)加入至培養(yǎng)物培養(yǎng)基中，并且在某段溫育時期(1、3或7天)后，通過mtt測試來定量代謝活細胞的數(shù)量(圖3)。在溫育1至7天后在所有情況下均觀察到細胞增殖增加(甚至最高濃度也是如此)。此外，對于所研究的最低濃度，細胞生長相當于在缺乏納米顆粒(對照)下通過細胞所觀察的情況。然而，增加所述的濃度，細胞生長未必對照顯著，可能是由于這樣的事實：它們的納米顆粒的濃度過高。盡管如此，對于所研究的所有濃度而言，細胞活力和形態(tài)學(xué)測試(未示出)均獲得極相似的結(jié)果。這些結(jié)果清楚地表明所述的納米顆粒在與所述的人類成骨細胞的細胞系接觸時是完全生物相容的。