本發(fā)明屬于兩棲類動物病毒檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種大鯢虹彩病毒CPA檢測引物，還涉及該引物的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

大鯢(Andrias davidianus)俗稱娃娃魚，是我國特有的珍稀兩棲類動物，1988年被列為國家二級保護(hù)動物，2007年《瀕危野生動植物物種國際貿(mào)易公約》(CITES)中被列為Ⅰ類瀕危物種。因大鯢具有極高的營養(yǎng)價值和藥用價值，我國自上世紀(jì)80年代突破了大鯢的人工繁育技術(shù)以后，開始了大鯢的規(guī)?；斯ゐB(yǎng)殖。目前大鯢已作為重點開發(fā)的養(yǎng)殖品種，在全國多個省市被廣泛養(yǎng)殖。由于養(yǎng)殖集約化發(fā)展，大鯢種質(zhì)下降，養(yǎng)殖環(huán)境惡化等問題，導(dǎo)致大鯢養(yǎng)殖中病害頻發(fā)，除了細(xì)菌性病原以外，由大鯢虹彩病毒(Giant salamander iridovirus，GSIV)感染引起大鯢虹彩病毒病是目前唯一發(fā)現(xiàn)的大鯢病毒性疾病，該病給大鯢養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，已成為制約大鯢養(yǎng)殖業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的瓶頸。

對于大鯢虹彩病毒，目前的診斷方法有細(xì)胞培養(yǎng)分離、電鏡技術(shù)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、TaqMan實時熒光定量PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)等。細(xì)胞培養(yǎng)法不能直接對病毒進(jìn)行檢測，只能利用細(xì)胞培養(yǎng)物的病變特征進(jìn)行初步判定并進(jìn)行進(jìn)一步病毒檢測才能進(jìn)行準(zhǔn)確診斷；電子顯微鏡技術(shù)雖然可以直接觀察到病毒粒子的存在，但其操作復(fù)雜、耗費時間長、準(zhǔn)確性低。常規(guī)PCR和TaqMan實時熒光定量PCR技術(shù)依賴昂貴的儀器設(shè)備，上述方法均只適合在專業(yè)實驗室的應(yīng)用。LAMP法是一種現(xiàn)場的快速診斷技術(shù)，但通常其檢測結(jié)果依靠人肉眼對反應(yīng)液顏色的變化進(jìn)行判斷，具有一定的主觀性?？梢?，上述方法都有各自的局限性，為了及早發(fā)現(xiàn)和確診大鯢虹彩病毒病，有必要建立一種不僅準(zhǔn)確、快速、靈敏，而且結(jié)果判斷客觀、直觀的檢測方法，為疾病的診斷與防控提供技術(shù)手段，也為大鯢養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展提供技術(shù)保障。

交叉引物恒溫擴(kuò)增技術(shù)(Cross priming amplification，CPA)是由杭州優(yōu)思達(dá)公司發(fā)明的一種新型的恒溫核酸擴(kuò)增方法(發(fā)明專利授權(quán)號：ZL 200810134583.1)，針對靶基因設(shè)計特異性引物，利用鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)在恒溫條件下反應(yīng)一小時即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。通過標(biāo)記特異性探針使其擴(kuò)增產(chǎn)物可用一次性核酸檢測裝置進(jìn)行檢測，有效防止擴(kuò)增產(chǎn)物帶來的污染，減少假陽性結(jié)果。該技術(shù)作為一種基礎(chǔ)方法，在應(yīng)用到具體檢測對象時，需要針對檢測對象基因結(jié)構(gòu)的特點，針對性地選擇靶基因及擴(kuò)增位點，合理設(shè)計交叉引物、檢測引物及剝離引物以提高方法的特異性與靈敏度，并且優(yōu)化各引物濃度比例以及反應(yīng)體系中其他物質(zhì)的濃度，獲得最佳反應(yīng)條件，進(jìn)而才能獲得較好的檢測效果。本發(fā) 明將該技術(shù)應(yīng)用到GSIV的檢測中，根據(jù)GSIV的特點進(jìn)行方法的優(yōu)化，建立了GSIV的CPA檢測方法。本方法通過在引物設(shè)計環(huán)節(jié)進(jìn)行改進(jìn)以及對反應(yīng)體系部分物質(zhì)濃度進(jìn)行優(yōu)化，以提高方法的特異性和檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。本發(fā)明具有很高的特異性和靈敏度，快速、簡便，結(jié)果判定直觀、客觀、準(zhǔn)確可靠，適合大鯢虹彩病毒病的現(xiàn)場快速檢測。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供了一種大鯢虹彩病毒CPA檢測引物，根據(jù)GenBank公布的GSIV毒株的主衣殼蛋白基因(MCP)編碼序列(JN516141)設(shè)計CPA引物，同時對部分堿基進(jìn)行改變以避免引物間錯配進(jìn)而提高反應(yīng)的特異性，利用CPA技術(shù)擴(kuò)增靶基因的特定區(qū)域，從分子水平對大鯢虹彩病毒進(jìn)行快速檢測，具有簡便、快速、高特異性和靈敏性的特點。

本發(fā)明的另一個目的在于提供了一種大鯢虹彩病毒CPA檢測引物在制備大鯢虹彩病毒CPA檢測試劑盒中的應(yīng)用。利用本發(fā)明提供的試劑盒，僅需一個金屬浴或水浴鍋即可在1.5小時內(nèi)準(zhǔn)確檢測出樣品中的GSIV，能檢測GSIV感染的病鯢組織，能檢測GSIV感染的細(xì)胞培養(yǎng)物(如EPC細(xì)胞)，特別適用于GSIV的現(xiàn)場快速檢測。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種大鯢虹彩病毒CPA檢測引物：

CPF:5’-GCCTCAGCGAACAGCGTGGCACCACCTCTACTCCTAT-3’

CPR:5’-GGCACCACCTCTACTCCTATGCCTCAGCGAACAGCGT-3’

DF:5’-(Biotin)CCTCAGCCTACAGCACCC-3’

DR:5’-(FITC)CTGGCGTTGGTCAGTCCG-3’

DPF:5’-TCCATCCCAGTCAGCA-3’

DPR:5’-TACCCAGAGTCGTCACCT-3’。

一種大鯢虹彩病毒CPA檢測引物在制備大鯢虹彩病毒CPA檢測試劑盒中的應(yīng)用，所述的試劑盒包括：Reaction Buffer；Bst DNA聚合酶；dNTPs；MgSO₄；Betaine；交叉引物CPF、CPR；檢測引物DF、DR；剝離引物DPF、DPR；核酸檢測試紙條。

CPF:5’-GCCTCAGCGAACAGCGTGGCACCACCTCTACTCCTAT-3’

CPR:5’-GGCACCACCTCTACTCCTATGCCTCAGCGAACAGCGT-3’

DF:5’-(Biotin)CCTCAGCCTACAGCACCC-3’

DR:5’-(FITC)CTGGCGTTGGTCAGTCCG-3’

DPF:5’-TCCATCCCAGTCAGCA-3’

DPR:5’-TACCCAGAGTCGTCACCT-3’。

利用大鯢虹彩病毒CPA檢測引物或試劑盒非診斷性檢測大鯢虹彩病毒的方法：

1、病毒DNA的獲取：

2、CPA擴(kuò)增：

采用25μL反應(yīng)體系，包括：Reaction Buffer 2.5μL，交叉引物CPF、CPR各1.0μM，檢測引物DF、DR各0.2～1.0μM，剝離引物DPF、DPR各0.2～1.0μM，Mg SO₄4～12mM，dNTPs 0.2～1.0mM，Betaine 0.6M，Bst DNA聚合酶8U，模板DNA 1μL，ddH₂O補足至25μL；55～65℃的溫度范圍，反應(yīng)30～90分鐘后，80℃滅活2分鐘。

3、檢測結(jié)果判定，可以用下述二種方法之一進(jìn)行結(jié)果的判定：

1)取擴(kuò)增產(chǎn)物，用2.0％(W/V)的瓊脂糖凝膠電泳后，置于凝膠成像系統(tǒng)中成像，電泳圖片顯示CPA特征性梯狀條帶，則結(jié)果為陽性；無任何條帶，則結(jié)果為陰性。

2)取擴(kuò)增產(chǎn)物，用核酸檢測試紙條檢測，僅在質(zhì)控區(qū)C出現(xiàn)一條紅線，表示樣品檢測結(jié)果陰性。出現(xiàn)兩條紅線，一條檢測線，一條質(zhì)控線，表示樣品檢測結(jié)果陽性。在質(zhì)控區(qū)C無紅色線條出現(xiàn)，表明核酸檢測試紙條失效，檢測結(jié)果無效。

以上所述的步驟，步驟2的CPA擴(kuò)增中，其體系優(yōu)選為：

采用25μL反應(yīng)體系，包括：Reaction Buffer 2.5μL，交叉引物CPF、CPR各1.0μM，檢測引物DF、DR各0.4μM，剝離引物DPF、DPR各0.4μM，MgSO₄8.0mM，dNTPs 1.0mM，Betaine 0.6M，Bst DNA聚合酶8U，模板DNA 1μL，ddH₂O補足至25μL；63℃反應(yīng)60分鐘后，80℃滅活2分鐘。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

1、特異性好，能有效檢測出大鯢虹彩病毒；

2、快速高效，檢測時間約1.5小時，非常適用于GSIV的現(xiàn)場快速檢測；

3、不依賴昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)檢測人員，檢測成本低；

4、檢測結(jié)果判定簡單、客觀、直觀。

5.靈敏度高，可檢測至10copies/μL的GSIV。

具體實施方式

下列實例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不應(yīng)該當(dāng)做對本發(fā)明的限制。本發(fā)明所述技術(shù)方案，如未特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方案；所述試劑或材料，如未特別說明，均已公開或來源于商業(yè)渠道。

實施例1：

一種大鯢虹彩病毒CPA檢測試劑盒，包括：

Reaction Buffer；Bst DNA聚合酶(NEB)；dNTPs；MgSO₄；Betaine(Sigma)；交叉引物CPF、CPR；檢測引物DF、DR；剝離引物DPF、DPR；核酸檢測試紙條(杭州優(yōu)思達(dá)公司)。

CPF:5’-GCCTCAGCGAACAGCGTGGCACCACCTCTACTCCTAT-3’

CPR:5’-GGCACCACCTCTACTCCTATGCCTCAGCGAACAGCGT-3’

DF:5’-(Biotin)CCTCAGCCTACAGCACCC-3’

DR:5’-(FITC)CTGGCGTTGGTCAGTCCG-3’

DPF:5’-TCCATCCCAGTCAGCA-3’

DPR:5’-TACCCAGAGTCGTCACCT-3’。

實施例2：

一種大鯢虹彩病毒CPA檢測試劑盒中不同引物濃度及比例的優(yōu)化：

一、取待檢樣品提取病毒DNA：

取感染GSIV(中國典型培養(yǎng)物保藏中心，CCTCC NO:V201134)的病鯢脾、腎組織勻漿液300μL，用試劑或Viral DNA Kit試劑盒，按照說明書提取DNA，最后溶于30μL滅菌水，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

二、CPA擴(kuò)增的反應(yīng)體系：

采用25μL反應(yīng)體系，在PCR管中加病毒DNA模板1μL，Reaction Buffer 2.5μL，交叉引物CPF、CPR，檢測引物DF、DR，剝離引物DPF、DPR，MgSO₄8.0mM，dNTPs 1.0mM，Betaine 0.6M，Bst DNA聚合酶8U，無核酸酶水補足至25μL。同時設(shè)置空白對照。

其中交叉引物(CPF、CPR)，檢測引物(DF、DR)，剝離引物(DPF、DPR)采用不同的濃度比例：

1)CPF/R：1.0μM，DF/R：0.2μM，DPF/R：0.2μM

2)CPF/R：1.0μM，DF/R：0.4μM，DPF/R：0.4μM

3)CPF/R：1.0μM，DF/R：0.6μM，DPF/R：0.6μM

4)CPF/R：1.0μM，DF/R：0.8μM，DPF/R：0.8μM

5)CPF/R：1.0μM，DF/R：1.0μM，DPF/R：1.0μM

三、CPA擴(kuò)增的反應(yīng)條件：

反應(yīng)管于63℃溫育60min，80℃滅活2min。

四、檢測結(jié)果判定：

取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物，用2.0％的瓊脂糖凝膠電泳后，置于凝膠成像系統(tǒng)中成像，電泳圖片顯示引物濃度組合2擴(kuò)增效果最好，即：CPF/R：1.0μM，DF/R：0.4μM，DPF/R：0.4μM。

實施例3：

一種大鯢虹彩病毒CPA檢測試劑盒中不同濃度的MgSO₄的優(yōu)化：

一、取待檢樣品提取病毒DNA：

制備方法同實施例2。

二、CPA擴(kuò)增的反應(yīng)體系：

采用25μL反應(yīng)體系，在PCR管中加入病毒DNA模板1μL，Reaction Buffer 2.5μL，CPF/R 1.0μM，DF/R 0.4μM，DPF/DPR 0.4μM，MgSO₄，dNTPs 1.0mM，Betaine 0.6M，Bst DNA聚合酶8U，無核酸酶水補足至25μL。同時設(shè)置空白對照。

其中MgSO₄的濃度分別為4.0、6.0、8.0、10.0、12.0mM。

三、CPA擴(kuò)增的反應(yīng)條件：

反應(yīng)管于63℃溫育60min，80℃滅活2min。

四、檢測結(jié)果判定：

取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物，用2.0％的瓊脂糖凝膠電泳后，置于凝膠成像系統(tǒng)中成像，電泳圖片顯示MgSO₄的濃度為8.0mM時效果最好。

實施例4：

一種大鯢虹彩病毒CPA檢測試劑盒中不同濃度dNTPs的優(yōu)化：

一、取待檢樣品提取病毒DNA：

制備方法同實施例2。

二、CPA擴(kuò)增的反應(yīng)體系：

采用25μL反應(yīng)體系，在PCR管中加病毒DNA模板1μL，Reaction Buffer 2.5μL，CPF/R 1.0μM，DF/R 0.4μM，DPF/DPR 0.4μM，MgSO₄8.0mM，dNTPs，Betaine 0.6M，Bst DNA聚合酶8U，無核酸酶水補足至25μL。同時設(shè)置空白對照。

其中dNTPs的濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mM。

三、CPA擴(kuò)增的反應(yīng)條件：

反應(yīng)管于63℃溫育60min，80℃滅活2min。

四、檢測結(jié)果判定：

取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物，用2.0％的瓊脂糖凝膠電泳后，置于凝膠成像系統(tǒng)中成像，電泳圖片顯示dNTPs濃度為1.0mM時效果最好。

實施例5：

一種大鯢虹彩病毒CPA檢測試劑盒中不同反應(yīng)溫度的優(yōu)化：

一、取待檢樣品提取病毒DNA：

制備方法同實施例2。

二、CPA擴(kuò)增的反應(yīng)體系：

采用25μL反應(yīng)體系，在PCR管中加病毒DNA模板1μL，Reaction Buffer 2.5μL，CPF/R 1.0μM，DF/R 0.4μM，DPF/DPR 0.4μM，MgSO₄8.0mM，dNTPs 1.0mM，Betaine 0.6M，Bst DNA聚合酶8U，無核酸酶水補足至25μL。同時設(shè)置空白對照。

三、CPA擴(kuò)增的反應(yīng)條件：

反應(yīng)管分別置于55℃、57℃、59℃、61℃、63℃、65℃溫育60min后，80℃滅活2min。

四、檢測結(jié)果判定：

取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物，用2.0％的瓊脂糖凝膠電泳后，置于凝膠成像系統(tǒng)中成像，電泳圖片顯示反應(yīng)溫度為63℃時效果最好。

實施例6：

一種大鯢虹彩病毒CPA檢測試劑盒的特異性：

1、取待檢樣品提取病毒DNA或細(xì)菌核酸：

GSIV感染的病鯢脾、腎組織勻漿液，鯉皰疹病毒2型(CyHV-2)(徐進(jìn)，曾令兵，楊德國，等.鯉皰疹病毒2型武漢株的分離與鑒定[J].中國水產(chǎn)科學(xué),2013,20(6):1303-1309)感染的病魚鰓、脾、腎等組織勻漿液、錦鯉皰疹病毒(KHV)(朱霞,李新偉,王好,等.一株錦鯉皰疹病毒的分離與鑒定[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2011,33(5):340-343)感染的Koi-Fin細(xì)胞、鰻皰疹病毒(HVA)(Jakob E,Neuhaus H,Steinhagen D,et al.Monitoring of Herpesvirus ang uillae(HVA)infections in European eel,Anguilla anguilla(L.),in northern Germany[J].J Fish Dis,2009,32(6):557-561)感染的EPC細(xì)胞、白斑綜合征病毒(WSSV)(徐進(jìn)，范玉頂，周勇，等.常規(guī)PCR與巢式PCR法快速檢測克氏原螯蝦白斑綜合征病毒[J].淡水漁業(yè)，2008，38(6)：52－54.)感染的病蝦組織勻漿液，于-80℃至室溫反復(fù)凍融3次，5000r/min離心30min，取上清300μL，用Viral DNA Kit試劑盒按照說明書提取DNA，最后溶于30μL滅菌水，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

另外培養(yǎng)分離自大鯢的一種致病菌：嗜水氣單胞菌(Ah)(孟彥，曾令兵，楊焱清，等.大鯢腹水病病原菌的分離與鑒定研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2009，37(3)：77－81.)常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)，直接以菌液(10⁹CFU/mL)作為模板檢測。

2、CPA擴(kuò)增的反應(yīng)體系：

采用25μL反應(yīng)體系，包括：Reaction Buffer 2.5μL，CPF/R 1.0μM，DF/R 0.4μM，DPF/DPR 0.4μM，dNTPs 1.0mM，Betaine 0.6M，Bst DNA聚合酶8U，Mg SO₄8.0mM，模板DNA 1μL，無核酸酶水補足至25μL。

3、CPA擴(kuò)增的反應(yīng)條件：

反應(yīng)管分別置于63℃溫育60min后，80℃滅活2min。

4、檢測結(jié)果判定：

用核酸檢測試紙條檢測，試紙條下端滴加5～8μL擴(kuò)增產(chǎn)物，再加緩沖液(杭州優(yōu)思達(dá)公司)3滴，3～5min后可用肉眼判讀。核酸檢測試紙條顯示，針對GSIV設(shè)計的特異性CPA引物組能保證對GSIV的特異性檢測，GSIV檢測結(jié)果陽性，而CyHV-2、KHV、HVA、WSSV、Ah、空白對照(水)均為陰性。

實施例7：

一種大鯢虹彩病毒CPA檢測試劑盒靈敏度：

1、GSIV Sph基因克隆及標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒構(gòu)建：

提取GSIV病毒總DNA(制備方法同實施例2)，PCR擴(kuò)增MCP基因(JN516141)全長序列，并克隆進(jìn)pMD19-T質(zhì)粒，構(gòu)建GSIV MCP基因標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒。提取并純化重組質(zhì)粒，測定質(zhì)粒濃度，計算質(zhì)?？截悢?shù)，并用純水將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度調(diào)整到10¹⁰copies/μL。靈敏度測定時，將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒用純水進(jìn)行10倍梯度稀釋，使質(zhì)粒濃度范圍為10⁹copies/μL～10⁰copies/μL，作為CPA反應(yīng)的模板DNA。

2、CPA擴(kuò)增的反應(yīng)體系：

采用25μL反應(yīng)體系，包括：Reaction Buffer 2.5μL，交叉引物CPF、CPR各1.0μM，檢測引物DF、DR各0.4μM，剝離引物DPF、DPR各0.4μM，MgSO₄8.0mM，dNTPs 1.0mM，Betaine 0.6M，Bst DNA聚合酶8U，模板DNA 1μL，ddH₂O補足至25μL。

3、CPA擴(kuò)增的反應(yīng)條件：

反應(yīng)管于63℃溫育60min，80℃滅活2min。

4、檢測結(jié)果判定：

用核酸檢測試紙條檢測，試紙條下端滴加5～8μL擴(kuò)增產(chǎn)物，再加緩沖液3滴，3～5min后可用肉眼判讀。核酸檢測試紙條顯示最低能夠檢測到10copies/μL的GSIV。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所

<120> 一種大鯢虹彩病毒CPA檢測引物及應(yīng)用

<130> 一種大鯢虹彩病毒CPA檢測引物及應(yīng)用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gcctcagcga acagcgtggc accacctcta ctcctat 37

<210> 2

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ggcaccacct ctactcctat gcctcagcga acagcgt 37

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

cctcagccta cagcaccc 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ctggcgttgg tcagtccg 18

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

tccatcccag tcagca 16

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

tacccagagt cgtcacct 18