抗玻勒虹彩病毒的單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗玻勒虹彩病毒的單克隆抗體及其應(yīng)用。該抗玻勒虹彩病毒單克隆抗體是由保藏編號(hào)為CGMCC?No.8555的小鼠雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生的。該抗玻勒虹彩病毒的單克隆抗體可用于檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)中玻勒虹彩病毒。本發(fā)明還公開了一種檢測(cè)玻勒虹彩病毒的ELISA試劑盒。
【專利說明】抗玻勒虹彩病毒的單克隆抗體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種抗玻勒虹彩病毒的單克隆抗體，雜交瘤細(xì)胞株，及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]玻勒虹彩病毒(Bohle virus, BIV)屬于虹彩病毒科娃病毒屬的確定成員。娃病毒屬以蛙病毒3型(FV3)為代表種，確定成員除了玻勒虹彩病毒(Bohle virus, BIV)外還有歐鮰病毒(European catfish virus, ECV)、歐鲇病毒(European sheatfish virus, ESV)和桑蒂庫帕娃病毒(Santee-Cooper ranavirus)等。娃病毒的病毒顆粒較大(150~180nm),呈二十面體立體對(duì)稱。基因組為150~170kb的雙鏈DNA，在胞核和胞質(zhì)中均可進(jìn)行復(fù)制。
[0003]該病毒的宿主范圍很廣泛，包括魚類、兩棲類、爬行類和一些易感染的其他動(dòng)物種類。為了及時(shí)防止在水環(huán)境中玻勒虹彩病毒危害性的擴(kuò)大，需要進(jìn)一步了解其宿主的范圍，這就要求盡快發(fā)展一種有效的檢測(cè)技術(shù)。
[0004]目前，病毒分離和PCR方法是應(yīng)用于玻勒虹彩病毒診斷的常用方法。但病毒分離法耗時(shí)較長(zhǎng)，不易作為快速診斷；PCR方法，雖然用時(shí)較短，但是成本較高，不易作為大規(guī)模調(diào)查。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種抗玻勒虹彩病毒的單克隆抗體、應(yīng)用該單克隆抗體的檢測(cè)玻勒虹彩病毒的ELISA試劑盒，以及體外檢測(cè)玻勒虹彩病毒的方法。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案:
[0007]本發(fā)明所提供的抗玻勒虹彩病毒的單克隆抗體，是由保藏編號(hào)為CGMCCN0.8555的雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生的。該小鼠雜交瘤細(xì)胞株已于2013年12月4日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址是中國(guó)北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào))，其保藏編號(hào)為CGMCC N0.8555，分類命名為玻勒虹彩病毒的雜交瘤細(xì)胞株。
[0008]保藏編號(hào)為CGMCC N0.8555的小鼠雜交瘤細(xì)胞株也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0009]本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)玻勒虹彩病毒的ELISA試劑盒，該試劑盒包括已包被本發(fā)明所述的單克隆抗體的固相載體。優(yōu)選地，還包括羊抗玻勒虹彩病毒的多克隆抗體，和酶標(biāo)抗羊的抗體。所述酶為辣根過氧化酶。
[0010]本發(fā)明采用商業(yè)化購買的酶標(biāo)抗羊的抗體，是因?yàn)橐环矫?，若?biāo)記本發(fā)明中表述的單克隆抗體或者是多克隆抗體，過程比較復(fù)雜。即使成功，都可能影響抗體的效價(jià)或者抗體的其他方面，使整個(gè)試劑盒研發(fā)更加繁瑣，耗力，耗時(shí)。而應(yīng)用商業(yè)化酶標(biāo)抗羊的抗體，則不存在這個(gè)問題；另一方面，若標(biāo)記本發(fā)明中的單克隆抗體或者是多克隆抗體，整個(gè)試劑盒的成本費(fèi)用就很高，對(duì)于試劑盒推廣應(yīng)用是不可行的。應(yīng)用商業(yè)化酶標(biāo)抗羊的抗體(sigma)，每1ml費(fèi)用是1000元左右，降低了試劑盒的成本。
[0011] 進(jìn)一步地，為了便于檢測(cè)，本發(fā)明試劑盒還包括陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，以及ELISA反應(yīng)所需的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑。其中，所述陽性對(duì)照為玻勒虹彩病毒溶液，陰性對(duì)照為魚類細(xì)胞懸液或者是正常組織勻漿液。所述酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑，均為常規(guī)的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑，包括但不限于，酶的底物反應(yīng)液、洗漆液和反應(yīng)終止液。
[0012]本發(fā)明所述的羊抗玻勒虹彩病毒的多克隆抗體的制備過程如下:用玻勒虹彩病毒作為抗原，多點(diǎn)注射免疫山羊，分別是每I周免疫一次，共免疫4次，取血清，即為羊抗玻勒虹彩病毒的多克隆抗體。
[0013]本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)玻勒虹彩病毒的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟:
[0014](I)將待測(cè)樣品加樣于包被有權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的固相載體；
[0015](2)將羊抗玻勒虹彩病毒的多克隆抗體加樣于步驟(1)獲得的固相載體；
[0016](3)將酶標(biāo)抗羊的抗體加樣于步驟(2)獲得的固相載體；
[0017](4)檢測(cè)酶標(biāo)記物，確定待測(cè)樣品中玻勒虹彩病毒的存在與否或存在的量，從而確定玻勒虹彩病毒的存在與否。
[0018]本發(fā)明的有益效果如下:
[0019]1.分泌本發(fā)明所述單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株增殖后可制備大量所需的特異抗體。雜交瘤細(xì)胞注射小鼠后，產(chǎn)生的腹水單抗ELISA效價(jià)為1:1X 106。雜交瘤細(xì)胞株活性高，液氮中凍存8-10個(gè)月后，仍能快速復(fù)蘇并保持良好活性。在所述的單克隆抗體的制備中，細(xì)胞融合率為97.6%,陽性率為98.0 %。
[0020]2.免疫小鼠的抗原是根據(jù)免疫耐受的原理，以簡(jiǎn)單的差速離心方法粗提純濃縮的病毒懸液作為免疫原，免疫小鼠。該免疫方法經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)已證實(shí)其主要優(yōu)勢(shì)是即保證了細(xì)胞融合后的陽性效果，又簡(jiǎn)化了抗原的制備方法。
[0021 ] 3.在篩選過程中，應(yīng)用了間接ELISA方法，在這種方法中包埋板子采取一次性包埋了大量ELISA板子，保證整個(gè)實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)一性，進(jìn)而保證了獲得制備抗玻勒虹彩病毒的單克隆抗體的準(zhǔn)確性。
[0022]4.建立的檢測(cè)玻勒虹彩病毒的夾心ELISA方法，能夠準(zhǔn)確的檢測(cè)出細(xì)胞懸液中的病毒存在與否。該檢測(cè)方法，對(duì)于進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)在檢驗(yàn)檢疫玻勒虹彩病毒方面提供了有利的條件。
【具體實(shí)施方式】
[0023]為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說明性的而非限制性的，不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0024]實(shí)施例1抗玻勒虹彩病毒的單克隆抗體的制備
[0025]1.抗原的制備
[0026] 以差速離心的方法粗提純的玻勒虹彩病毒(Bohle virus, BIV) (J Pallister1AGould,D Harrison, A Hyatt, J Jancovich and H Heinel.Development of real-timePCR assays for the detection and differentiation of Australian and Europeanranaviruses, Journal of Fish Diseases2007，30，427-438)懸液，即先 8000r/min，離心35min 后，24000r/min，離心 2hr，收集沉淀，用 0.5ML 的 0.01mol/L 的 PBS 重懸，_80°C保存。[0027]2.免疫小鼠
[0028]免疫用的小鼠為SPF級(jí)5周齡雌性BALB/c小鼠。每只小鼠以上述純化的病毒懸液為抗原進(jìn)行腹腔注射基礎(chǔ)免疫，病毒懸液與弗氏完全佐劑1:1混合，腹腔注射0.2ML ;2周后加強(qiáng)免疫，病毒懸液與弗氏不完全佐劑1:1混合，腹腔注射0.1ML ;之后每隔I周加強(qiáng)免疫I次，腹腔注射，病毒懸液0.2ML ;第4次免疫后第3天，將小鼠脫頸椎處死，無菌取脾臟用于細(xì)胞融合。
[0029]3.細(xì)胞融合
[0030] 常規(guī)的細(xì)胞融合技術(shù):取免疫小鼠的脾臟和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合后，加入小鼠的胸腺細(xì)胞與融合細(xì)胞在HAT培養(yǎng)系中共培養(yǎng)。
[0031]所述技術(shù)中應(yīng)用的HAT培養(yǎng)基的配制:將50倍濃縮的HAT (2ml，GIBCO公司)及特級(jí)胎牛血清(20ml，杭州四季青生物工程材料有限公司)加入到改良型RPMI1640培養(yǎng)基(80ml, hyclone公司)中混勻。
[0032]4.雜交瘤細(xì)胞的篩選與克隆
[0033]融合細(xì)胞培養(yǎng)10天后，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，以梯度離心純化的玻勒虹彩病毒作為抗原進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)。篩選出的陽性雜交瘤細(xì)胞株有限稀釋法進(jìn)行克隆。其中陽性的小鼠雜交瘤細(xì)胞株(BIV-3A4)已于2013年12月4日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址是中國(guó)北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào))，保藏編號(hào)為 CGMCC N0.8555。
[0034]5.腹水的誘生
[0035]取6~8周齡雌性Balb/C小鼠，腹腔內(nèi)注射無菌的液體石蠟0.5ml/只；1周后，腹腔內(nèi)注射陽性雜交瘤細(xì)胞；接種雜交瘤細(xì)胞后7~10天，見小鼠腹部明顯膨大，抽腹水，離心后收集上清，_80°C凍存?zhèn)溆谩?br> [0036]實(shí)施例2:抗玻勒虹彩病毒的單克隆抗體的特性鑒定
[0037]1.單克隆抗體的腹水效價(jià)鑒定
[0038]方法:采用間接ELISA法對(duì)單克隆抗體的腹水效價(jià)進(jìn)行鑒定。
[0039]結(jié)果:本發(fā)明所述的單克隆抗體腹水效價(jià)為1:1X 106，表明雜交瘤細(xì)胞株具有分泌高滴度抗體的能力。
[0040]2.單克隆抗體的亞型鑒定
[0041]方法:應(yīng)用美國(guó)的SouthernBiotech 的分型試劑盒(SBA Clonotyping?System/HRP)，依照其說明書對(duì)本發(fā)明所述單克隆抗體的Ig亞型進(jìn)行鑒定。
[0042]結(jié)果:本發(fā)明所述單克隆抗體的亞型為IgG2b型k鏈。
[0043]3.單克隆抗體的特異性分析
[0044]方法:采用間接ELISA方法，檢測(cè)單克隆抗體分別與玻勒虹彩病毒(BIV)、鯉春病毒血癥病毒(spring viremia of carp virus, SVCV)、病毒性出血敗血癥病毒(Viralhaemorrhagic septicaemia virus, VHSV)和傳染性造血器官壞死病毒(Infectioushematopoietic necrosis virus, IHNV)反應(yīng)。結(jié)果顯示單克隆抗體特異性好,僅與玻勒虹彩病毒發(fā)生反應(yīng)，與其他病毒株以及細(xì)胞均不發(fā)生反應(yīng)。
[0045]表1單克隆抗體的特異性分析(P/N值)
[0046]
【權(quán)利要求】
1.一種抗玻勒虹彩病毒的單克隆抗體，是由保藏編號(hào)為CGMCC N0.8555的雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生的。
2.分泌產(chǎn)生抗玻勒虹彩病毒的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其保藏編號(hào)為CGMCCN0.8555。
3.權(quán)利要求1所述的單克隆抗體在檢測(cè)玻勒虹彩病毒中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述的單克隆抗體或權(quán)利要求2所述的雜交瘤細(xì)胞株在制備檢測(cè)玻勒虹彩病毒試劑盒中的應(yīng)用。
5.一種檢測(cè)玻勒虹彩病毒的ELISA試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括已包被權(quán)利要求I所述的單克隆抗體的固相載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的ELISA試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括羊抗玻勒虹彩病毒的多克隆抗體，和酶標(biāo)抗羊的抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的ELISA試劑盒，其特征在于，所述酶為辣根過氧化酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的ELISA試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的ELISA試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括底物反應(yīng)液、洗滌液和反應(yīng)終止液。
10.一種檢測(cè)玻勒虹彩病毒的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: (1)將待測(cè)樣品加樣于包被有權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的固相載體； (2)將羊抗玻勒虹彩病毒的多克隆抗體加樣于步驟(1)獲得的固相載體； (3)將酶標(biāo)抗羊的抗體加樣于步驟(2)獲得的固相載體； (4)檢測(cè)酶標(biāo)記物，確定待測(cè)樣品中玻勒虹彩病毒的存在與否或存在的量，從而確定玻勒虹彩病毒的存在與否。
【文檔編號(hào)】C12N5/20GK103910795SQ201410169309
【公開日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2014年4月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月25日
【發(fā)明者】景宏麗, 王娜, 張旻, 林祥梅, 吳紹強(qiáng) 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院