一組用于檢測虹彩病毒的引物及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一組用于檢測虹彩病毒的引物及檢測方法，所述的引物與虹彩病毒的核苷酸序列的一部分或其互補鏈互補，并能夠在DNA聚合酶的作用下特異性地擴增虹彩病毒的核苷酸序列的一部分。本發(fā)明所述檢測虹彩病毒的方法，采用上述引物，通過環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法，特異性地擴增虹彩病毒的核苷酸序列的一部分，確認是否存在有擴增產(chǎn)物。本發(fā)明用于檢測虹彩病毒的引物靈敏度高、特異性強；本發(fā)明虹彩病毒的檢測方法，采用的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)，反應(yīng)時間短、操作簡單，能夠滿足市場的需求。
【專利說明】—組用于檢測虹彩病毒的引物及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及海水魚類感染病毒檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種虹彩病毒的快速檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]虹彩病毒(Iridovirus)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種最嚴重的魚類傳染性病毒之一，可在野生和養(yǎng)殖的魚類中引起較高的發(fā)病率和死亡率，能引起鱸脾腫大癥、石首魚暴發(fā)性傳染病、真鯛虹彩病毒病、牙鲆淋巴囊腫病、石斑魚慵懶病、甲魚“紅脖子病”等近百種水生動物疾病，癥狀主要表現(xiàn)在脾臟腫大及其細胞壞死等現(xiàn)象，死亡率高達30% (成年魚)-100% (魚苗)，危害性極大。近年來，這種病毒在東亞和東南亞地區(qū)引起的魚類疾病已呈明顯上升趨勢，在海水養(yǎng)殖魚類中有很多報道，致使魚類大面積的死亡，造成了嚴重的經(jīng)濟損失，因而被稱為“海洋口蹄疫”。
[0003]組織培養(yǎng)法一直是虹彩病毒檢測的“金標準”方法，雖然其特異性較強，但檢測步驟復(fù)雜，耗時較長，且靈敏度偏低。
[0004]近年來，針對虹彩病毒的檢測，先后建立了間接熒光抗體檢測方法、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測方法等。然而這些免疫學(xué)檢測方法也存在缺點，比如檢測時間較長，往往需要5-6小時才能出結(jié)果，而且需要制備單克隆抗體，技術(shù)成本較高。
[0005]隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，對虹彩病毒的檢測手段也有了快速的發(fā)展。例如采用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)和實時聚合酶鏈式反應(yīng)(real-time PCR)檢測虹彩病毒。這些方法快速簡單，靈敏度高，反應(yīng)時間較以前的方法短，但仍需要較長時間，而且需要使用PCR儀等貴重儀器，對使用范圍有限制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]有鑒于此，有必要針對上述問題，提供一組用于檢測虹彩病毒的引物及其檢測方法。
[0007]一組用于檢測虹彩病毒的引物，所述的引物與虹彩病毒的核苷酸序列的一部分或其互補鏈互補，并能夠在DNA聚合酶的作用下特異性地擴增虹彩病毒的核苷酸序列的一部分。
[0008]作為本發(fā)明一組用于檢測虹彩病毒的引物，為SEQ ID N0.1~6所示的寡核苷酸，或者SEQ ID N0.1~6所示的寡核苷酸的互補鏈。
[0009]本發(fā)明還提供一種檢測虹彩病毒的方法，采用的引物可以與虹彩病毒的核苷酸序列的一部分或其互補鏈互補，并能夠在DNA聚合酶的作用下特異性地擴增虹彩病毒的核苷酸序列的一部分；通過環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法，特異性地擴增虹彩病毒的核苷酸序列的一部分，確認是否存在有擴增產(chǎn)物。
[0010]作為本發(fā)明檢測虹彩`病毒的方法的優(yōu)選實施方式，本發(fā)明檢測虹彩病毒的方法，所述的方法包括如下步驟:[0011](I)準備檢測樣本；
[0012](2)提取樣本的總DNA ；
[0013](3)對步驟(2)的DNA進行環(huán)介導(dǎo)的等溫核酸擴增反應(yīng)，反應(yīng)溫度為60~65°C，反應(yīng)時間為10~60分鐘；
[0014](4)終止反應(yīng)；
[0015](5)檢測所述擴增引物。
[0016]作為本發(fā)明檢測虹彩病毒的方法的優(yōu)選實施方式，所述的方法的步驟(5)所述的檢測是通過擴增產(chǎn)物凝膠電泳、擴增產(chǎn)物濁度觀測或擴增產(chǎn)物化學(xué)發(fā)光檢測的方法進行的。
[0017]作為本發(fā)明檢測虹彩病毒的方法的優(yōu)選實施方式，所述的檢測樣本選自下列樣本:
[0018](I)海水魚類的感染組織；或者
[0019](2)海水魚類的細胞培養(yǎng)物。
[0020]本發(fā)明用于檢測虹彩病毒的引物靈敏度高、特異性強；本發(fā)明虹彩病毒的檢測方法，采用的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)，反應(yīng)時間短、操作簡單，能夠滿足市場的需求。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1是環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)產(chǎn)物的特征性梯狀條帶和酶切鑒定電泳圖:泳道M:marker ;泳道1:擴增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶Mst I酶切產(chǎn)物，得到217bp，252bp大小的兩條主帶，說明是特異性擴增；泳道2:擴增原始產(chǎn)物，表現(xiàn)出特征性的梯狀條帶，不能通過片段的大小來鑒別是否為非特異性擴增；
[0022]圖2是等溫孵育不同時間的產(chǎn)物含量的電泳圖:在20分鐘時就出現(xiàn)了特征性擴增條帶，表明20分鐘即可完成反應(yīng)；泳道M:marker ;泳道N:陰性對照；其他泳道為不同時間的產(chǎn)物，數(shù)字代表時間，單位:分鐘；
[0023]圖3是靈敏度實驗結(jié)果的電泳圖:泳道M:marker ；泳道N:陰性對照；泳道O到一6表示病毒DNA模板按5倍稀釋后(標號取5的對數(shù)log5，一 I即稀釋5倍)的擴增產(chǎn)物；圖上半部分是利用F3和B3做PCR的電泳結(jié)果，產(chǎn)物約210bp ;圖下半部分是本發(fā)明方法的結(jié)果，可得該方法比PCR靈敏25倍左右；
[0024]圖4是肉眼可視觀察實驗結(jié)果，省略電泳所需的時間和設(shè)備:P1和P2是陽性反應(yīng)，NI和N2是陰性反應(yīng)；其中，N2和P2都加了 SYBR Green I熒光染料；在Pl的體系中，可以看見混濁的白色副產(chǎn)物，稍微離心，可見沉淀于底部；P2中的染料由N2所顯示的橙黃色(染料的本色)變?yōu)榫G色。
【具體實施方式】
[0025]為使本發(fā)明更加容易理解，下面將進一步闡述本發(fā)明的具體實施例。
[0026]本發(fā)明中“核酸”或“多核苷酸”是指任何長度的含嘌呤和嘧啶的聚合物，可以是多核糖核苷酸，可以是多脫氧核糖核苷酸，或是混合的多核糖-多脫氧核糖核苷酸。它包括單鏈和雙鏈分子，例如DNA-DNA，DNA-RNA和RNA-RNA雜合體，以及通過與氨基酸主鏈共軛堿基形成的“蛋白質(zhì)核酸”(PNA)。它還包括含有修飾堿基的核酸。[0027]本發(fā)明中“引物”是長度約為5個至50個核苷酸的寡核苷酸，優(yōu)選長度為大約6個至25個核苷酸，特別優(yōu)選長度為大約6個至18個核苷酸，它與相關(guān)的單鏈核酸序列形成一個雙鏈體，并且可以用例如DNA聚合酶使互補鏈發(fā)生聚合反應(yīng)。
[0028]本發(fā)明中核酸序列的“互補鏈”是指參與與原始序列沃森-克里克堿基配對的反義序列。
[0029]實施例1
[0030]一組用于檢測虹彩病毒的引物，所述的引物與虹彩病毒的核苷酸序列的一部分或其互補鏈互補，并能夠在DNA聚合酶的作用下特異性地擴增虹彩病毒核苷酸序列的一部分。所述的引物，為SEQ ID N0.1~6所示的寡核苷酸。
[0031]表1引物序列
[0032]
【權(quán)利要求】
1.一組用于檢測虹彩病毒的引物，其特征在于:所述的引物與虹彩病毒的核苷酸序列的一部分或其互補鏈互補，并能夠在DNA聚合酶的作用下特異性地擴增虹彩病毒的核苷酸序列的一部分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測虹彩病毒的引物，其特征在于:所述的引物為SEQID N0.1~6所不的寡核苷酸,或者SEQ ID N0.1~6所不的寡核苷酸的互補鏈。
3.一種應(yīng)用權(quán)利要求1或2所述的引物檢測虹彩病毒的方法，其特征在于:采用的引物可以與虹彩病毒的核苷酸序列的一部分或其互補鏈互補，并能夠在DNA聚合酶的作用下特異性地擴增虹彩病毒的核苷酸序列的一部分；通過環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法，特異性地擴增虹彩病毒的核苷酸序列的一部分，確認是否存在有擴增產(chǎn)物。
4.一種應(yīng)用權(quán)利要求3所述的引物檢測虹彩病毒的方法，其特征在于:所述的方法包括如下步驟: (1)準備檢測樣本； (2)提取樣本的總DNA； (3)對步驟(2)的DNA進行環(huán)介導(dǎo)的等溫核酸擴增反應(yīng)，反應(yīng)溫度為60~65°C，反應(yīng)時間為10~60分鐘； (4)終止反應(yīng)； (5)檢測所述擴增引物。
5.一種應(yīng)用權(quán)利 要求4所述的引物檢測虹彩病毒的方法，其特征在于:所述的方法的步驟(5)所述的檢測是通過擴增產(chǎn)物凝膠電泳、擴增產(chǎn)物濁度觀測或擴增產(chǎn)物化學(xué)發(fā)光檢測的方法進行的。
6.一種應(yīng)用權(quán)利要求4所述的引物檢測虹彩病毒的方法，其特征在于:所述的檢測樣本選自下列樣本: (1)海水魚類的感染組織；或者 (2)海水魚類的細胞培養(yǎng)物。
【文檔編號】C12Q1/68GK103667521SQ201310340361
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年8月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月6日
【發(fā)明者】曹永長, 薛春宜 申請人:中山大學(xué)