專利名稱：一種快速檢測(cè)石斑魚虹彩病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及石斑魚虹彩病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體的說，涉及一種快速檢測(cè) 石斑魚虹彩病毒的方法。
背景技術(shù)：
2000年后，日本出現(xiàn)一種全新的核酸擴(kuò)增技術(shù) ——環(huán)介導(dǎo)的核酸等溫?cái)U(kuò)增 LAMP (loop-mediated isothermal amplification)技術(shù)。LAMP是一種敏感的鏈取 代核酸擴(kuò)增技術(shù)，這種方法能在恒溫條件下(約65°C)、 一個(gè)小時(shí)內(nèi)，將目的 DNA從幾個(gè)拷貝擴(kuò)增到109個(gè)拷貝(TsugunoriNotomi等，2000) 。 LAMP技術(shù) 擴(kuò)增、檢測(cè)目的核酸片斷，一般以200 300bp為宜， 一般實(shí)驗(yàn)流程包括Gene Bank檢索目的基因片斷(并通過BLAST確定該片斷與其他物種基因的同源性)， 人工或在線設(shè)計(jì)引物組，弓1物合成、DNApolymerase large fragment (若進(jìn)行 RT-LAMP擴(kuò)增，還需加入AMV或ALV反轉(zhuǎn)錄酶)及相關(guān)緩沖液準(zhǔn)備，確定反 應(yīng)體系、擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)果判定等。 1丄AMP擴(kuò)增的原理
LAMP擴(kuò)增主要利用了 Bst DNA聚合酶大片段的兩大特性 一是DNA聚合 酶具有5'—3'DNA聚合酶活性，能在恒溫狀態(tài)下擴(kuò)增DNA核酸；二是Bst DNA 聚合酶不具有5'—3'外切核酸酶活性，能將新合成的核酸單鏈從新生成的DNA 雙鏈上置換(取代)下來，形成兩條獨(dú)立的核酸單鏈以開啟下一輪的DNA核酸 合成；進(jìn)而免去了每次擴(kuò)增前的DNA變性環(huán)節(jié)。在此基礎(chǔ)上，巧妙地設(shè)計(jì)能識(shí) 別6個(gè)(或8個(gè))獨(dú)立DNA序列的LAMP引物組(4引物組或6引物組)，使 得Bst DNA聚合酶的兩大特性充分發(fā)揮。其中，內(nèi)引物(BIP、 FIP)的設(shè)計(jì)是 LAMP引物設(shè)計(jì)的亮點(diǎn)、難點(diǎn)。
Bst DNA聚合酶大片段是Bacillus stearotherm叩hilus DNA聚合酶的一部分， 來源于E,coli菌株，此菌株含有來自Bacillus stearothermophilus DNA聚合酶的基 因，該基因不具有5'—3'外切核酸酶活性。應(yīng)用基因重組技術(shù)，將麥芽糖結(jié)合蛋
白(MBP)基因與該基因融合表達(dá)，純化后再去除麥芽糖結(jié)合蛋白。
第一階段擴(kuò)增始發(fā)物形成
l步當(dāng)雙鏈DNA處于65"C左右的動(dòng)態(tài)平衡中時(shí)，引物組中的BIP引物就能 通過互補(bǔ)結(jié)合到目標(biāo)DNA雙鏈上，在& DNA聚合酶作用下，啟動(dòng)DNA合成。
2步從BIP的B2區(qū)域3'端開始合成DNA模板的互補(bǔ)鏈至F3C;
3步B3引物退火結(jié)合到模板DNA的互補(bǔ)區(qū)域B3C，啟動(dòng)鏈取代合成，同時(shí) 釋放由BIP引物引導(dǎo)合成的互補(bǔ)鏈。
4步釋放的DNA的B1C區(qū)域結(jié)合B1區(qū)域，形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)；1.3步釋放的DNA 鏈作為FIP引物以及F3引物的模板，按BIP端相同的模式啟動(dòng)DNA的合成及鏈取 代，釋放的DNA鏈在FIP端同樣形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。進(jìn)而，形成啞鈴形結(jié)構(gòu)擴(kuò)增始發(fā) 物。
第二階段延伸
5步啞鈴結(jié)構(gòu)通過自弓I導(dǎo)DNA合成迅速轉(zhuǎn)換成莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA;
6步BIP引物與莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)狀單鏈區(qū)域結(jié)合并開始新的DNA合成，由于 F1及F1C的互補(bǔ)關(guān)系，再次形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，先前合成的DNA鏈得以釋放；
7步FIP引物同樣與對(duì)應(yīng)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)狀單鏈區(qū)域結(jié)合，由于B1及B1C 的互補(bǔ)關(guān)系，再次形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，先前合成的DNA鏈得以釋放；
8步如此周而復(fù)始擴(kuò)增，最終形成不同長(zhǎng)度(目的片斷長(zhǎng)度的自然數(shù)倍) 花椰菜cauliflower狀的反向重復(fù)序列(Notomi. T等，2000)。
2.引物設(shè)計(jì)
LAMP引物的設(shè)計(jì)比常規(guī)PCR要復(fù)雜的多。 一個(gè)反應(yīng)至少包括4條引物，包 括一對(duì)內(nèi)引物(HP和BIP,各約40bp)和一對(duì)外引物(F3和B3，各約25bp);如果 添加一對(duì)環(huán)引物(bopprimer)，反應(yīng)便可以加速，反應(yīng)時(shí)間減半，大大增加擴(kuò) 增檢測(cè)的效率[2] 。 Primer Explorer version 3軟件可以專門設(shè)計(jì)各種特異LAMP弓I 物，用戶只需按要求提交目的片斷序列，設(shè)置相關(guān)參數(shù)，系統(tǒng)便能產(chǎn)生多種引物 組合供用戶選擇。此外，LAMP引物可以人工設(shè)計(jì)，各引物的組成(請(qǐng)見表l-2)， 引物設(shè)計(jì)的其他技術(shù)細(xì)節(jié)及注意事項(xiàng)可參考相關(guān)文獻(xiàn)(TsugunoriNotomi等， 2000; K.Nagamine等，2002)。表1.LAMP引物組成
引物名稱 組成備注
正向外引物F3 5'-F3-3' F3/B3的Tm值低于F2/B2的Tm值。
反向外引物B3 5'-B3-3，
正向內(nèi)引物 5'-FlC+F2-3'
FIP F2/B2的Tm值應(yīng)該在60 65 °C之間,F 1C/B1C的Tm值高于F2/B2的Tm值
反向內(nèi)引物 5'-Bl+B2C-3'BIP
正向環(huán)引物L(fēng)F 5'-LFC-3' LB: DNA正義鏈反向環(huán)引物，
反向環(huán)引物L(fēng)B 5'-LB-3'LFC: DNA反義鏈正向環(huán)引物。
3. 反應(yīng)體系及設(shè)備
25ulLAMP反應(yīng)的基本體系如下內(nèi)引物FIP、 BIP各0.8mM，外引物F3、 B3各0.2mM，(需要時(shí)，環(huán)弓1物L(fēng)F、 LB各0.4mM)， 1.6mMdNTPs， lMbetaine 甜菜堿(Sigma)，反應(yīng)緩沖液(20mM Tris-HCl (pH 8.8), 10mM KC1, 10mM (NH4)2S04, 4mM MgS04, 0.1% TritonX-lOO) ， 8個(gè)單位DNApolymerase large fragment(New England Biolabs)以及模板DNA。模板DNA在恒溫?cái)U(kuò)增前95℃孵育5mins (TsugunoriNotomi等，2000)，但后續(xù)研究表明，未經(jīng)95。C變性的DNA 模板可以直接進(jìn)入恒溫?cái)U(kuò)增(60 65°C for 45 60mins)。為防止非特異擴(kuò)增， 須80。C孵育2 5mins。
由于LAMP反應(yīng)無需循環(huán)變溫，所以僅需水浴鍋或其他恒溫加熱器便可。
4. 擴(kuò)增結(jié)果判定
擴(kuò)增結(jié)果有三種判定方法1)核酸的瓊脂糖凝膠電泳，染料可以是EB也可 以是SYBR Green I，瓊脂糖凝膠的濃度以2%為宜，緩沖液采用TBE緩沖液。2) 肉眼直接觀測(cè)副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀。產(chǎn)物呈陽(yáng)性的反應(yīng)，管內(nèi)液體渾濁，離心或 由白色沉淀集于管底，陰性反應(yīng)則無此現(xiàn)象。3) SYBR Green I熒光染料直接對(duì) 產(chǎn)物進(jìn)行染色，也可以通過肉眼直接觀察。產(chǎn)物呈陽(yáng)性的反應(yīng)，加染料后呈綠色， 陰性反應(yīng)則呈橙紅色(Zhao-Feng Sun等，2006)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有檢測(cè)石斑魚虹彩病毒技術(shù)存在的不足，提供一 種利用LAMP技術(shù)快速檢測(cè)石斑魚虹彩病毒的方法。 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
本發(fā)明第一次提出將環(huán)介導(dǎo)的等溫核酸擴(kuò)增檢測(cè)方法應(yīng)用于檢測(cè)石斑魚虹
彩病毒。
具體包括如下步驟
(1 )克隆ORF-014L及構(gòu)建包含ORF-014L的重組質(zhì)粒模板；
(2) 引物設(shè)計(jì)，引物序列為
F3 : GCACGAGTATACGGCCTCTG B3: CGGCTACCAGCATCCAAT FIP:
GACTACGGGTTCGATGGCTGC-TTTT-AGACGATTGCGCATGAAACA BIP:
LF: TCGCGGTTCGGGTCATCAT LB: TGCTGGAACGTGCAAAACCG;
(3) 擴(kuò)增，反應(yīng)溫度為63 65°C，反應(yīng)時(shí)間20 60min。 步驟(1)所述的重組質(zhì)粒模板的母本質(zhì)粒優(yōu)選pMD-18T。 步驟(3)所述的反應(yīng)溫度最佳為65°C。
步驟(3)所述反應(yīng)時(shí)間最佳為60min。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
本發(fā)明的LAMP檢測(cè)技術(shù)能快速檢測(cè)SGIV，能檢測(cè)SGIV 014L在細(xì)胞中 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，能檢測(cè)SGIV感染的石斑魚組織，能檢測(cè)SGIV感染的GP細(xì)胞， 其靈敏度比Nested PCR高3個(gè)數(shù)量級(jí)，達(dá)6.6個(gè)拷貝。


圖1為質(zhì)粒pMD18—T的物理圖譜；
圖2為pT-014L載體的構(gòu)建策略；
圖3為L(zhǎng)AMP擴(kuò)增的引物序列和位置示意圖4為L(zhǎng)AMP擴(kuò)增產(chǎn)物及其M5rl酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖5為L(zhǎng)AMP檢測(cè)技術(shù)的種間特異性；
圖6為pT-014L檢測(cè)中LAMP和Nested PCR法靈敏度的比較；
圖7為副產(chǎn)物沉淀(示混濁度)法及SYBRGreenI顯色法的敏感性對(duì)比；
圖8為L(zhǎng)AMP擴(kuò)增的細(xì)胞特異性；
圖9為石斑魚不同組織中檢測(cè)SGIV;
圖10為ORF-014L在GP細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
其中，圖4中，M: 100bp分子量標(biāo)記；1: LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物；2:M^I酶切產(chǎn)物。 圖5中，A)LAMP檢領(lǐng)U， B)常規(guī)PCR檢領(lǐng)!)， M :100bp marker, +,-:陽(yáng)性(SGIV 基因組DNA)、陰性對(duì)照(超純水作為模板)，1 7泳道分別為L(zhǎng)CDV , IHNV, STIV,麗V,TFV， KHV, SVCV。
圖6中，A) 1st PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，可見233bp的擴(kuò)增產(chǎn)物；B) 2nd PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物電泳圖，可見192bp的擴(kuò)增產(chǎn)物；C)LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，最小分子量產(chǎn) 物為214bp。 M: 100bp分子量標(biāo)記；1 12泳道分別為10， 102， 103， 104， 105, 106， 107， 108， 109， 1010， 10"， 1032倍稀釋的SGIVORF-014L質(zhì)粒DNA的LAMP
擴(kuò)增產(chǎn)物。
圖7中，A) LAMP擴(kuò)增副產(chǎn)物沉淀(示混濁度)，B) LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的SYBR Green
I顯色圖，N:陰性對(duì)照，+:陽(yáng)性對(duì)照；1 11管分別為102， 103， 104， 105，
106, 107， 108, 309， 10u)， 10"， 1012倍稀釋的SGIV ORF-014L質(zhì)粒DNA的LAMP
擴(kuò)增產(chǎn)物。
圖8中，M: lOObp marker; +:陽(yáng)性對(duì)照；-:陰性對(duì)照；1:感染后細(xì)胞；2:健 康細(xì)胞，A) LAMP, B)PCR。
圖9中，M:100bp marker;+:陽(yáng)性對(duì)照;-:陰性對(duì)照；1:脾；2:腎；3:肝；4:
腸；5:腦 A)LAMP B)PCR。
圖10中，M: marker, +:陽(yáng)性對(duì)照，-:陰性對(duì)照
泳道1 12依次為1h、 2h、 3h、 4h、 6h、 8h、 10h、 12h、 16h、 24h、 36h、 48h、 72h、 96h時(shí)ORF-014的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)情況。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l IAMP檢測(cè)方法的建立
1.SGIVORF-014L克隆及質(zhì)粒模板構(gòu)建
1.1材料與方法
l.1.l 材料
1.1.1.1病毒和細(xì)胞
石斑魚虹彩病毒SGIV (Singapore grouper iridovirus SGIV)由本實(shí)驗(yàn)室保存。
GP細(xì)胞(Grouper embryo cells)由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)保存。
1.1.1.2質(zhì)粒載體和受體菌株
質(zhì)粒載體pMD 18-T (圖1),購(gòu)自TaKaRa公司。
受體菌大腸桿菌菌株JM109，基因型/zw^/7gyM96
1.1.1.3培養(yǎng)基
LB液體培養(yǎng)基蛋白胨(trytone) 10g;酵母提取物(yeastextract) 5g;
NaCl 10g,加800mL蒸餾水，用5MNaOH調(diào)節(jié)pH至7.2 7.4，定容至1000mL，
分裝，高壓滅菌，4'C保存。
LB固體培養(yǎng)基在LB液體培養(yǎng)基中加入進(jìn)口瓊脂粉至終濃度為1.5。/。，高壓滅菌， 4'C保存。
1.1.1.4聚合酶及其他工具酶
PyrobestDNA聚合酶，TaqDNA聚合酶。
1.1.1.5試劑盒
病毒DNA提取試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。
DNA膠回收試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。
H. Q. & Q.質(zhì)粒微量提取試劑盒購(gòu)自U-gene公司。
1.1.1.6緩沖液
1.1.1.6.1堿法提取質(zhì)粒DNA所用溶液
溶液I: 50mM葡萄糖，25 mM Tris'CI (pH 8.0), 10mMEDTA， 121。C滅菌
20mins， 4。C保存；
溶液II: 0.2MNaOH， 1%SDS，使用前以10MNaOH和10% SDS母液加入雙蒸 水配制成新鮮溶液；
溶液III: 60mL5M醋酸鉀，11.5mL冰乙酸，雙蒸水28.5 mL;
TE緩沖液lOmMTris.Cl (pH8.0)， lmM EDTA(pH8.0)。
1.1.1.6.2提取病毒DNA的堿裂解緩沖液
提取病毒DNA的堿裂解緩沖液0.2M碳酸鈉，0.3M氯化鈉，0.02MEDTA. DNA瓊脂糖凝膠電泳緩沖液50xTAE (1000mL) : 242gTris， 57.1mL冰乙酸， lOmL 0.5MEDTA(pH8.0)，電泳時(shí)稀釋為lxTAE。 1丄1.6.3轉(zhuǎn)化溶液0.1M氯化鈣1.47gCaCl2*2H20溶于水后定容至100mL， 0.22pm濾器過濾，4°C 保存。
1.1.1.7其他溶液和試劑
氨芐青霉素儲(chǔ)存液以無菌雙蒸水配成濃度為100mg/mL的溶液，分裝，-20°C 保存。使用時(shí)每100mL培養(yǎng)基加入100ul，終濃度為100jig/mL; IPTG儲(chǔ)存液 將8glPTG粉末(Sigma公司產(chǎn)品)溶于10mL雙蒸水中，過濾除菌后分裝，-20°C 保存?zhèn)溆茫?br> X-gal儲(chǔ)存液X-gal粉末(Sigma公司產(chǎn)品)以二甲基甲酰胺溶解配成溶液(濃 度為20mg/mL)，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 1.1.2方法
1.1.2.1病毒DNA的獲取 1.1.2.1病毒的增殖
將石斑魚虹彩病毒SGIV感染其敏感細(xì)胞GP， 25℃培養(yǎng)，待70%-80%的細(xì) 胞出現(xiàn)CPE時(shí)，收取病毒。將感染SGIV的GP細(xì)胞反復(fù)凍融2-4次，保證病毒 完全釋放，吹打均勻，轉(zhuǎn)移到15mL離心管，3,000r/min^Al5mins，取上清， -80℃保存。
1.1.2.1.2病毒DNA的提取
標(biāo)準(zhǔn)方法
SGIV病毒懸液，加入等體積的堿裂解緩沖液，37℃作用15mins至病毒懸液 變得較為澄清，再加入等體積的2。/。SDS和25ul蛋白酶K(10mg/mL)， 50℃作用 30mins，至病毒懸液完全澄清，12,000 r/min.離心5 mins，除去堿解不溶物。取 上清用酚、酚-氯仿(1:1)與酚-氯仿-異戊醇(25:24:1)依次輕柔抽提，上清用 2,5倍體積的95。/。冰乙醇沉淀病毒DNA，用冰冷的70%乙醇洗滌，風(fēng)干至沉淀保 持潮濕，加入滅菌超純水，-20℃保存。
簡(jiǎn)化方法
SGIV病毒懸液(250U1)，加入等體積的酚-氯仿-異戊醇(25:24:1)，輕柔 抽提3min以上，12，000r/min.離心10mins，取上清；加入2.5倍上清體積的冰冷乙 醇(濃度95%) ， .2(TC沉淀1小時(shí)以上，12,000r/min.離心20mins (若上清不夠清 澈可重復(fù)該步驟)；倒去上清可以看見管底有白色沉淀，用一定量的冰冷的70% 乙醇洗滌(重復(fù)一次，每次約2min，洗滌時(shí)不可吹打)；風(fēng)干至沉淀保持潮濕， 加入滅菌超純水(30 40ul)，瞬間離心，-20°(:保存。 1丄2.2 ORF-014L的常規(guī)PCR引物設(shè)計(jì)及目的DNA片段的PCR擴(kuò)增 1.1.2.2.1 PCR引物設(shè)計(jì)
根據(jù)已報(bào)道的SGIV基因組162個(gè)ORF的預(yù)測(cè)，ORF-014L沒有明確的預(yù)測(cè)結(jié) 果或功能；通過NCBI在線比對(duì)BLAST，發(fā)現(xiàn)ORF-014L與其他物種基因的同源性 較低(<50%)，故而將ORF-014L中一段長(zhǎng)為233bp的DNA序列定為PCR擴(kuò)增目 標(biāo)片段。具體設(shè)計(jì)引物根據(jù)SGIV (accession number: AY521625) ORF-014L (gene ID: 3197138, nucleotide position: 12474~12707)的互補(bǔ)序列進(jìn)行。 ORF-014L的常規(guī)PCR引物
PCR-014-F: 5'-TACGGGCACGCACGAATA-3' PCR-014-B: 5 '-CGGCTACC AGC ATCC AA-3' l丄2丄2目的基因片段的PCR擴(kuò)增
模板DNA 0.5ul(10ng) dNTPs (2.5mM each) 4ul Primer 014F (lOpM) 2ul Primer 014B (lOpM) 2ul Pyrobest DNA Polymerase 0.5ul 10x緩沖液 5ul 以上體系以無滅菌雙蒸水補(bǔ)足至50ul。
PCR擴(kuò)增，循環(huán)參數(shù)為:
95 °C 5min 94°C 30 sec
58°C 30 sec
30 Cycles72℃ 45 sec
72℃ 8min
4℃保存
1.1.2.3 pT-014L 載體的構(gòu)建
pT-014L載體的構(gòu)建策略如圖2所示。將PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒。
1.1.2.3.1 PCR產(chǎn)物的純化與回收
PCR產(chǎn)物用l％瓊脂糖/溴化乙錠凝膠進(jìn)行電泳，
切膠切下膠塊應(yīng)盡量小且包含所需目的DNA條帶，在紫外燈下暴露的時(shí) 間也應(yīng)盡量短，EP管在裝入切下膠塊前后需秤重來計(jì)算膠塊的質(zhì)量，進(jìn)而計(jì)算 換算凝膠體積。純化回收用TaKaRa凝膠回收試劑盒(AgaroseGelDNA purification Kit Ver.2.0)回收目的DNA片段。
PCR產(chǎn)物的純化與回收的具體操作步驟
① 切膠,稱凝膠重量，以lmg=lul換算凝膠體積；
② 按3倍凝膠重量加入BufferDR-I;
③ 于75℃加熱，每隔l 2min振蕩混勻，直至凝膠塊完全融化；
④ 按BufferDR-I體積的50％加入Buffer DR-II，混合均勻；
⑤ 將Spin Column置于2mL Collection Tube中，將歩驟④中的混合液移入 Spin Column中，12,000 r/min.離心l min;
⑥棄濾液，將Spin Column置回原2mL Collection Tube中，加入500ul Rinse A， 12,000 r/min,離心30 s;
⑦ 棄濾液，將Spin Column置回原2mL Collection Tube中，加入700ul已加 無水乙醇的RinseB， 12,000 r/min.離心30 s。棄濾液，以同樣的方法再用700ul Rinse B洗滌一次；
⑧ 棄濾液，將Spin Column置回原2mL Collection Tube中，12000 r/min.離 心l min;
⑨ 將SpinColumn置于一潔凈的1.5mL離心管中，在silica膜中央加入25 30ul滅菌雙蒸水或Elution buffer, 室溫靜置l min。 12000 r/min.離心l min
洗脫DNA。 .20。C保存。
1.1.2.3.3 PCR產(chǎn)物連入T-載體
純化回收的PCR產(chǎn)物用pMD18-T Vector Kit于16。C連接30 mins。連接產(chǎn)物 于-20'C保存。按以下配方配制反應(yīng)體系(10ul)
PCR產(chǎn)物 3ul (0.3pmo1)
Pmd-18T Vector lul
Ligation mix 5ul ddH20 lul
1l.2.4感受態(tài)細(xì)胞的制備
采用CaCl2法制備大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞甘油菌JM109活化接種受 體菌單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，37°C、 200r/min.震搖培養(yǎng)過夜，到形成霧狀 沉淀物即可(OD,約為0.4);次日按1:100體積比接種于新鮮LB液體培養(yǎng)基中， 37°C、 200r/min.震搖培養(yǎng)約3h，至OD6go值至0.6左右；菌液冰浴30min后， 然后于10,000r/min.離心lmin，棄盡上清，加原體積1/2的預(yù)冷的0.1M CaCl2重 懸沉淀，于10000r/min.離心lmin，棄盡上清，冰浴20min，最后以原體積1/25的 預(yù)冷的0.1MCaCl2重懸沉淀，分裝成若干管，每管100ul，冰浴保存4小時(shí)之后 使用。
1.1.2.5轉(zhuǎn)化
在100ul感受態(tài)細(xì)菌中加入5ul連接產(chǎn)物，手指彈動(dòng)混勻，冰浴30min以上； 42'C水浴熱激90s，不要晃動(dòng)，然后迅速冰浴5min;加入新鮮LB (無Amp+)液體 培養(yǎng)基至lmL，置搖床37。C， 200r/min，復(fù)蘇lh;室溫下8,000r/min.離心lmin， 吸走lmL上清，剩余100ul混勻；涂布于LB(Amp+)平板(預(yù)先用7u120。/。的IPTG 加40ul2。/。的X-Gal處理)上。靜置平板30 40min，將平板倒置，置于37。C培 養(yǎng)箱培養(yǎng)15 16h, 4'C避光存放。
1.1.2.6菌液PCR篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序
經(jīng)菌落籃白篩選后，從平板上挑取多個(gè)白色菌落于LB液體培養(yǎng)基中(平行 試驗(yàn))，37°C、 200r/min.震搖培養(yǎng)12 15h;各取200ul菌液沸水浴5min，各取 2ul菌液做模板，按前述PCR體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取5ulPCR各對(duì)應(yīng)產(chǎn)物電泳檢 測(cè)。據(jù)電泳結(jié)果將篩選出的兩個(gè)陽(yáng)性克隆各500ul送測(cè)序，測(cè)序工作由上海英駿生物技術(shù)有限公司負(fù)責(zé)完成。
1.1.2.7質(zhì)粒模板提取
挑選測(cè)序正確質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)大化培養(yǎng)，37°C， 200r/min搖6小時(shí)以上至菌液渾 濁，出現(xiàn)絮狀沉淀。
質(zhì)粒提取(H.Q.&Q.質(zhì)粒微量提取試劑盒)，其歩驟如下
(1) 用離心管收集1.5 5mL過夜培養(yǎng)的菌液，10,000xg離心lmin，棄盡上清；
(2) 用250ul已加入Rnase A的Buffer ZL-I充分懸浮細(xì)菌沉淀；
(3) 加入250ulBuffer ZL-II，溫和但充分地上下翻轉(zhuǎn)混合4 6次，至溶液澄 清，此步驟不宜超過5mins;
(4) 加入350ulBufferZL-m，溫和地上下翻轉(zhuǎn)混合8 10次；室溫靜置2mins， 10，000xg離心10mins;
(5) 將Mu-Pu質(zhì)粒微量分離柱置于2mLMicrofugeTube中，將步驟4中的離心 上清移入Mu-Pu質(zhì)粒微量分離柱中，10,000xg離心lmin;
(6) 棄濾液，將Mu-Pu質(zhì)粒微量分離柱置回原2-mLMicrofogeTube中，加入 500ulBufferZL， 10,000xg離心lmin;
(7) 棄濾液，將Mu-Pu質(zhì)粒微量分離柱置回原2-mLMicrofogeTube中，加入 720ul已加無水乙醇的DNA洗滌液，10,000xg離心lmin，以同樣的方法再用720ul 已加無水乙醇的DNA洗滌液洗滌一次；
(8) 棄濾液，將Mu-Pu質(zhì)粒微量分離柱置回原2-mL MicrofUge Tube中，10,000 xg離心min;
(9) 將Mu-Pu質(zhì)粒微量分離柱置于一潔凈的1.5mL離心管中，在silica膜中央 加入30 50ulH20，室溫靜置2mins， 10,000xg離心lmin洗脫質(zhì)粒DNA， -20°。保存。
1.1.2.8陽(yáng)性模板的確認(rèn)
以1丄2.7提取的質(zhì)粒作為模板進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如 1.12.2.2所述，條帶清晰，大小符合預(yù)測(cè)，確定后續(xù)試驗(yàn)的陽(yáng)性模板。
2.LAMP技術(shù)檢測(cè)石斑魚虹彩病毒(SGIV)的方法建立
2.1材料與方法 2.1.1材料
2.1.1聚合酶及其他工具酶
BstDNA聚合酶大片段(含10x緩沖液)，購(gòu)自New England Biolabs公司；
MstI限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自TaKaRa公司。
逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自TaKaRa公司。
2.1.2病毒和細(xì)胞
石斑魚虹彩病毒SGIV (Singapore grouper iridovirus SGIV)由本實(shí)驗(yàn)室保存。
GP細(xì)胞(Grouper embryo cells)由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)保存。
2.1.1.3試劑儀器
甘氨酸三甲內(nèi)鹽(betaine，別名甜菜堿)購(gòu)自Sigma公司、MgS04 TRIzol 試劑購(gòu)自Invitrogen公司；RNA酶抑制劑購(gòu)自TaKaRa公司； 無RNA酶水在經(jīng)高溫烘烤處理的三角瓶U8(TC,9h)內(nèi)裝入適量的雙蒸 水，然后加人焦碳酸二乙酯(DEPC)至終濃度為0.iy。(v/v)， 37。C劇烈振蕩過夜 后，將溶液高壓滅菌，使DEPC失活；
75%乙醇用無RNA酶水配置；氯仿；異丙醇；
PCR儀、水浴鍋
2.1.2方法
2.1.2.1 方法
2.12.1 針對(duì)SGIV ORF-014L的LAMP檢測(cè)技術(shù)的建立
2.1.2.1.1 LAMP的引物設(shè)計(jì)
根據(jù)SGIV基因組序歹lJ(GenBank accession no. AY521625， ORF-014L的Gene ID: 3197138),使用Primer ExplorerV3 (Fujitsu, Tokyo, Japan)進(jìn)行在線設(shè)計(jì) (http:〃loopamp.eiken,co.jp/e/index.html)。弓1物設(shè)計(jì)前，須確保計(jì)算機(jī)已經(jīng)安裝 JAVA SOFTWARE,且目標(biāo)序列格式為txt格式或FASTA格式。
首先設(shè)計(jì)四條LAMP引物即一條上游內(nèi)引物(forward inner primer ， FIP)、 一條下游內(nèi)引物 (backward inner primer, BIP)禾口兩條夕卜引物(outer primers , F3 and B3 )。進(jìn)入procedure for regulation primer designing,運(yùn)4亍正常，會(huì)在纟戔生 成若干組包括FIP、 BIP、 F3和B3的4引物組，根據(jù)所需參數(shù)選擇其一，隨即 生成Primer Information文件，SGIV ORF-014L的引物序列和位置見圖3。圖3 中，A)用于設(shè)計(jì)LAMP檢測(cè)內(nèi)引物和外引物的SGIV基因的部分核苷酸序列。 用于設(shè)計(jì)引物的核苷酸序列和位點(diǎn)以及MM的酶切位點(diǎn)已用線段及虛線標(biāo)出。
B)擴(kuò)增時(shí)引物與靶基因的結(jié)合位點(diǎn)
然后，設(shè)計(jì)Loop primers:進(jìn)入procedure for loop primer designing,禾擁上-一 步驟生成的Primer Information File,再次輸入loop primer所需參數(shù)，即可生成若 干組loopprimer,根據(jù)所需選擇即可。引物合成工作由Invi加gen公司完成。
2.1.2.1.2 LAMP擴(kuò)增的反應(yīng)條件
(1)反應(yīng)體系
總體積為25ul的LAMP反應(yīng)體系包括0.8pM FIP禾B 0.8nM BIP、 0.2jxM F3 和0.2pM B3 、 1.6 mM dNTPs、 1M betaine (甘氨酸三甲內(nèi)鹽)(Sigma)、 20mM Tris-HCl (pH 8.8)、 10mM KC1、 lOmM (NH4)2S04、 4mM MgS04、 0.1% Triton X-100 和8個(gè)單位的&f DNA大片段聚合酶(New England Biolabs)以及l(fā)ul DNA樣
本和 l 3.5ul ddH20。
LAMP反應(yīng)液組成
上游內(nèi)引物FIP(10pmol/ul) 2ul
下游內(nèi)引物BIP(l0pmol/ul) 2ul
上游外引物F3 (10pmol/ul) 0.5ul
下游外引物B3 (10pmol/ul) 0.5ul
上游環(huán)引物L(fēng)F (lOpmol/ul) lul
下游環(huán)引物L(fēng)B (lOpmol/ul) lul
DNA模板 0.5ul
Bst DNA聚合酶(8U/ul) 1 ul
10xrection Buffer 2.5ul
dNTP(2.5mM each) 4ul
Mg2+ 2ul
ddH2O 8ul
Total volume 25ul/sample
(2)反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化
反應(yīng)混合液分別在60°C、 61°C、 62°C、 63°C、 64'C和65。C溫浴10min、 20min、 30min、 40min、 50min或60min，然后迅速加熱到80。C， 5min中止反應(yīng)。LAMP
反應(yīng)結(jié)束后，取3ul產(chǎn)物與0.5ul 6倍溴酚藍(lán)上樣緩沖液混合，2%瓊脂糖凝膠電 泳，EB染色后通過凝膠成像系統(tǒng)成像，根據(jù)電泳結(jié)果決定優(yōu)化條件。
2.1.2.1.3 LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定
最直觀的產(chǎn)物判定方法是看是否產(chǎn)生LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的標(biāo)志性ladder狀條 帶，且最小產(chǎn)物的分子量應(yīng)該符合預(yù)測(cè)分子量；本研究還進(jìn)一步通過LAMP擴(kuò) 增產(chǎn)物的酶切鑒定來確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物是否確實(shí)所需產(chǎn)物。根據(jù)前期預(yù)測(cè)，LAMP擴(kuò) 增產(chǎn)物中應(yīng)該存在的MstI限制性內(nèi)切酶切位點(diǎn)<formula>see original document page 16</formula>，且酶切產(chǎn)物為 218bp和187bp兩種片段。
限制性內(nèi)切酶M rt酶切反應(yīng)體系
MM 1 ul
10xT Buffer 2 ul
0.1% BSA 2ul
DNAS lug
滅菌水 14ul
Up to 20ul
反應(yīng)溫度37°C 反應(yīng)時(shí)間l小時(shí)。
2.1.2.2巢式PCR檢測(cè)SGIV方法的建立
巢式PCR比常規(guī)的PCR的檢測(cè)靈敏度通常要高1 2個(gè)數(shù)量級(jí)，且反應(yīng)需 要外、內(nèi)兩套引物，與本研究涉及的LMAP擴(kuò)增在引物構(gòu)成方面有一定相似性， 故建立針對(duì)SGIV的巢式PCR技術(shù)供參考討論。
本研究中，巢式PCR的外引物即為SGIV ORF-014L的擴(kuò)增引物，詳見第二 章1丄2.2.1巢式PCR的內(nèi)引物為
PCR-014-IF: 5'-CGCATGAAACATAAACG-3'
PCR-014-IB: 5'-CGGCTACCAGCATCCAA-3'
PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系
模板DNA 0.5ul(10ng) dNTPs(10mM) 2ul
Primer 014F (10mM) lul
Primer 014B (10mM) lul
DNA Polymerase 0.5ul
10x緩沖液 2.5ul
無滅菌雙蒸水2.5ul
Up to25ul
反應(yīng)條件同1.2.2.2所示。
2.1.2.3紫外分光測(cè)定質(zhì)粒DNA純度和濃度
用pH為8.0的TE把待測(cè)DNA由lul稀釋成50ul。用稀釋DNA的TE做
空白調(diào)定0點(diǎn)，對(duì)待測(cè)RNA溶液測(cè)定OD260和OD280，計(jì)算DNA的純度及濃
度。 一般提得較純的DNA的OD260/280值應(yīng)在1.8左右。換算公式
<formula>see original document page 17</formula>
2.1.2.4 SVCV總RNA的提取
① 取出-80。C保存的樣品溶解并室溫靜置15—20 mins。
② 按lmLTRIzo媳試劑體積加入0.2mL氯仿比例每管加入0.1mL氯仿，居U 烈振蕩15s，室溫靜置2-3mins。
③ 4。C， 12,000g，離心20min，取上清加入無RNasel.5mL離心管(每管可 取約200-300uI上清)，每管加入等體積異丙醇(一般加250ul)，振蕩10s，置 于-20。C沉淀30min或過夜。
④4°C， 12,000g，離心20min，小心將上清吸出并拋棄，可在離心管底看 到明顯RNA沉淀，每管加入75%乙醇1 mL，漂洗管壁及RNA沉淀(不一定要 彈起RNA沉淀)，置于冰水浴上5min。
4°C， 12，000g，離心10min，小心將上清吸出并拋棄，吸凈管壁上的液
滴，打開離心管蓋子，置超靜臺(tái)內(nèi)干燥RNA，至沉淀透明(約需要5 10min，
目的是使乙醇揮發(fā)干凈，但又不使用RNA完全烤干，因?yàn)橐掖紦]發(fā)不干凈和
RNA完全烤干都可導(dǎo)致RNA難溶于水)。
⑥加入適量無RNase水并彈管底溶解RNA沉淀。-80℃保存。
2.1.2.5 SVCV cDNA的合成
取lμg 總RNA，首先通過M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和Saldom隨機(jī)引物合成cDNA鏈。
反應(yīng)體系
① 按以下配方在一無RNase的0.2mL離心管配制反應(yīng)體系
Total RNA 1μg
Saldom primer (12pM) 2ul
以上體系以無RNase水補(bǔ)足至10ul。混勻后，簡(jiǎn)單離心使液體聚于管底。
② 65'C孵育5min使RNA變性。
③ 置冰水浴中驟冷5min。
簡(jiǎn)單離心體液體聚于管底。
⑤各管加入以下反應(yīng)試劑(總體積10ul)
5xM-MLV Buffer 5 ul
dNTP Mix (10 mM each) 1 ul
RNAsin (40 unit/ul) 0.5 ul
M-MLV (RNase S) (200 unit/ul) 1 ul
無RNase水 2.5 ul
將反應(yīng)步驟①的產(chǎn)物加入步驟⑤的反應(yīng)液中，輕輕混勻，簡(jiǎn)單離心使液
體聚于管底。
⑦ 42。C溫育lh。
⑧ 72r孵育10min使酶滅活，冰上冷卻。
⑨-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 3. LAMP檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用
3.1材料與方法
3.1.1材料
3.1.1.1細(xì)胞與病毒
GP細(xì)胞(培養(yǎng)于EMEM培養(yǎng)基中，輔以10%胎牛血清，Gibco公司)。
健康石斑魚；
石斑魚虹彩病毒SGIV同第二章。3.1.1.2培養(yǎng)基
細(xì)胞培養(yǎng)基EMEM(Gibco公司)；9.6g EMEM, 2.66g NaCl, 7% NaHC03, 5mL lMHepes,溶于800mL三蒸水中，調(diào)節(jié)pH值到7.2左右，然后按終體積的比例 加入雙抗至終濃度為青霉素100U/mL、鏈霉素100U/mL，定容至1000mL。過濾 滅菌。(C保存。使用時(shí)輔以10%胎牛血清。
3.1.1.3抗生素
雙抗青霉素-鏈霉素，濃度各為10,000 U/mL的雙抗混合液，Gibco公司。
3.1.1.4酶類以及試劑盒
LAMP擴(kuò)增及PCR擴(kuò)增用酶同第三章；
胰酶(含EDTA):購(gòu)自Gibco公司，20。C保存；
逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自TaKaRa公司。
3.1.1.5 RNA提取溶液
TRIzol 試劑購(gòu)自Invitrogen公司；
無RNA酶水在經(jīng)高溫烘烤處理的三角瓶(18(TC，9h)內(nèi)裝入適量的雙蒸 水，然后加入焦碳酸二乙酯(DEPC)至終濃度為O.P/。(v/v)， 37。C劇烈振蕩過夜 后，將溶液高壓滅菌，使DEPC失活； 75%乙醇用無RNA酶水配置； 氯仿；異丙醇；RNA酶抑制劑購(gòu)自TaKaRa公司
3.1.2方法
3.1.2.1 SGIV感染細(xì)胞及收集
以3x107個(gè)細(xì)胞/瓶密度接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的GP細(xì)胞。待細(xì)胞貼壁24-48h之 間，以10"TCID50單位/細(xì)胞濃度的SGIV病毒上清液感染細(xì)胞于6孔板，25°C 培養(yǎng)。分別于感染后30min、 1h、 2h、 3h、 4h、 6h、 8h 、 10h、 12h、 16h、 24h、 36h、 48h、 72h、 96h收集細(xì)胞，(每次感染后2h去除相應(yīng)的孔內(nèi)含病毒粒子的培 養(yǎng)液，更換新的不含病毒的培養(yǎng)液)離心，去除上清。混勻，-S(TC保存。
3.1.2.2 SGIV感染石斑魚及魚體組織收集
測(cè)定SGIV病毒的滴度，當(dāng)病毒滴度達(dá)到106'5 7時(shí)，對(duì)石斑魚魚體進(jìn)行攻 毒，腹腔注射，約40ul/尾；停止喂料，4天后取魚組織，-80"保存。
病毒滴度是將病毒原液作10倍系列稀釋后，可對(duì)病毒的量進(jìn)行滴定。常用 表達(dá)的方式為TCID50 (50%tissue culture infective dose),即能在半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)板 孔或試管內(nèi)引起細(xì)胞病變(cytopathiceffect,CPE)的病毒量。
病毒滴度的計(jì)算
1. Reed-Muench法
距離比例=(大于50%的陽(yáng)性百分比一50%) / (大于50%的陽(yáng)性百分比一小 于50%的陽(yáng)性百分比)
CID50的對(duì)數(shù)二大于50X的陽(yáng)性百分比的最高稀釋度對(duì)數(shù)+距離比例X稀釋 度間距的對(duì)數(shù)
該法可估計(jì)50X細(xì)胞受感染的終點(diǎn)。半數(shù)感染量TCID50可通過計(jì)算累積感 染百分率得到。
2. 空斑抑制法
將病毒各稀釋度種入單層細(xì)胞瓶，吸附1小時(shí)后，在單層細(xì)胞上復(fù)以營(yíng)養(yǎng)瓊 脂培養(yǎng)基，病毒在細(xì)胞中繁殖使細(xì)胞死亡。但由于瓊脂的限制只能感染鄰近的細(xì) 胞，形成"蝕斑"的退化細(xì)胞區(qū)，經(jīng)中性紅活細(xì)胞染料著色后，活細(xì)胞顯紅色，而 蝕斑區(qū)細(xì)胞已退化不著色，形成不染色區(qū)域。凡是能在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生細(xì)胞死 亡破裂現(xiàn)象(CPE)的病毒都可采用蝕斑技術(shù)來分離和測(cè)定，但是需計(jì)數(shù)空斑， 較為繁瑣，病毒效價(jià)表示為PFU/mL, PFU表示空斑形成單位。
3.1.2.3 SGIV DNA的提取
從細(xì)胞中提取SGIVDNA，方法同2.1.2.1.2。
從魚體組織中提取SGIVDNA:魚體解剖后，取石斑魚不同組織(脾、肝、 腎、腦、腸等)；剪取約0.1g魚組織并轉(zhuǎn)移到滅菌、烘干的勻漿器中，加入0.8mL PBS,冰上充分勻漿；勻漿液轉(zhuǎn)移至2mL EP管，0.2mL PBS沖洗勻漿器后一并 轉(zhuǎn)移至EP管；4℃， 6,000 r/miiL離心10mins，吸取上清約850mL;加入等體積 的酚-氯仿-異戊醇(25:24:1)，輕柔抽提3min以上，12,000 r/min.離心10mins， 取上清；加入2.5倍上清體積的冰冷乙醇(濃度95%) ， -20℃沉淀1小時(shí)以上， 12,000 r/min.離心20mins (若上清不夠清澈可重復(fù)該步驟)；倒去上清可以看見 管底有白色沉淀，用一定量的冰冷的70%乙醇洗滌(重復(fù)一次，每次約2min，洗滌時(shí)不可吹打)；風(fēng)干至沉淀保持潮濕，加入滅菌超純水G0 40ul)，瞬間 離心，-20'C保存。
3.1.2.4總RNA提取
室溫下2,000rpm離心10min收集細(xì)胞；吸出培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸于lml預(yù)冷 的PBS中；向混合液中加入lmlTrizol;力卩0.3ml氯仿強(qiáng)烈振蕩15s，室溫靜置 2-15min;小于等于12,000g， 4'C離心5min;取上層水相重復(fù)以上氯仿抽提；取 上層水相，加入異丙醇750iU (lmlTrizol加0.5ml異丙醇)，室溫靜置10min; 4 °C，(小于等于)12,000g離心10min;棄上清，用1.5ml75。/。乙醇洗滌沉淀，4°C， 7,500g離心5min (75%乙醇現(xiàn)配現(xiàn)用，用前預(yù)冷)；棄75%乙醇，室溫干燥約10 min;加適量無RNase水溶解沉淀，-80"保存
3.1.2.5紫外分光測(cè)定RNA純度和濃度
(1 )用pH為8.0的TE把待測(cè)RNA由lml稀釋成100ml。
(2)向潔凈比色杯中加入100mlTE，在紫外分光光度儀上調(diào)定O點(diǎn)，在此比色 杯中加入待測(cè)RNA溶液100ml，測(cè)定OD260和OD280，計(jì)算RNA的純度及濃 度。
3.1.2.6 RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA
取1ug總RNA，首先通過M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和01igo(dT)30引物合成第一 條cDNA鏈。反應(yīng)體系如下
(1) 按以下配方在 一無RNase的0.2ml離心管配制反應(yīng)體系
Total RNA l嗎 Oligo (dT)30 primer (12, 2^1 以上體系以無RNase水補(bǔ)足至10^1，混勻后，低速離心使液體聚于管底；
(2) 65 °C孵育5 min使RNA變性；
(3) 置冰水浴中驟冷5min;
(4) 簡(jiǎn)單離心體液體聚于管底；
(5) 各管加入以下反應(yīng)試劑:(總體積10W)
5xM-MLV Buffer 5u1
dNTP Mix (10 mM each) 1
脂Asin (40 uni乖) 0 5 pi
M-MLV (RNase H) (200 unit/pl) 1 pi
無RNase水 2.5pl
總體積 lOpl
(6) 將反應(yīng)步驟(1)的產(chǎn)物加入步驟(5)的反應(yīng)液中，輕輕混勻，簡(jiǎn)單離心使液 體聚于管底；
(7) 42。C溫育lhr;
(8) 72'C孵育10min使酶滅活。冰上冷卻；
(9) -2(TC保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例2
根據(jù)SGIV ORF-014L的序列設(shè)計(jì)LAMP引物，使用Primer Explorer V3軟 件(Fujitsu)對(duì)引物進(jìn)行設(shè)計(jì)并篩選，得到的引物序列為-F3 : GCACGAGTATACGGCCTCTG B3: CGGCTACCAGCATCCAAT FIP:
GACTACGGGTTCGATGGCTGC-TTTT-AGACGATTGCGCATGAAACA BIP:
ACGGGAGGAAACTTGTGCTGAT-TTTT-ATGGCCCGTAGAAGTCAGT LF: TCGCGGTTCGGGTCATCAT LB: TGCTGGAACGTGCAAAACCG
根據(jù)選定的引物成功地?cái)U(kuò)增出SGIVORF-014L序列的145 359bp片段，該 區(qū)域共215bp。
LAMP產(chǎn)物在凝膠中呈Ladder樣的結(jié)構(gòu)。為了確定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，使TGC — A用限制性內(nèi)切酶MM進(jìn)行酶切，識(shí)別F2和Flc之間的AC 4' GT位點(diǎn)，產(chǎn)生的片段與推測(cè)的大小(218bp和187bp)相符(圖4)。顯示了 LAMP法檢測(cè)SGIV 的特異性。利用陽(yáng)性模板質(zhì)粒DNA進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)吋間60min，反應(yīng)溫度為65°C。
LAMP檢測(cè)的種間特異性
收集了不同相關(guān)度的DNA、 RNA病毒共7種，在與陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照相 同條件下，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，通過瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。結(jié)果顯示，針對(duì)SGIV ORF-014L設(shè)計(jì)的特異LAMP引物組能保證對(duì)SGIV的特異性檢測(cè)(見圖5)。
LAMP擴(kuò)增技術(shù)的檢測(cè)極限及其與Nested PCR的比較
為闡明LAMP擴(kuò)增技術(shù)在檢測(cè)靈敏度方面的優(yōu)勢(shì)，特選擇靈敏度較高、同 樣有兩套引物作用的Nested PCR作為比較對(duì)象。經(jīng)質(zhì)粒DNA的OD值測(cè)定及公 式換算，確定質(zhì)粒DNA原濃度為0.021ug/ul (即6.6x 101Gcopies/ul) 。 10倍梯 度稀釋1， 10， 102， 103， 104， 105 ， 106， 107， 108， 109， 1010， 101倍稀釋，
由圖6可知1st PCR的檢測(cè)極限是6.6xl()S個(gè)拷貝，2nd PCR的檢測(cè)極限是6.6^03 個(gè)拷貝，LAMP擴(kuò)增檢測(cè)的極限是6.6個(gè)拷貝。
副產(chǎn)物沉淀法及SYBR Green I顯色法的敏感性對(duì)比(直接觀察法)
由于LAMP反應(yīng)有副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀產(chǎn)生，不需要凝膠電泳，通過肉眼 即可快速鑒定擴(kuò)增結(jié)果(Mori etal., 2001)。使用SYBR Green I直接染色擴(kuò)增產(chǎn) 物則能更清晰靈敏地顯示反應(yīng)結(jié)果(Iwamoto et al., 2003)。含有擴(kuò)增產(chǎn)物和 SYBR Green I的反應(yīng)液會(huì)變色(橙色變成綠色)，也能肉眼直接判定結(jié)果。如圖 7A示，質(zhì)粒原液(第"l"管)的濃度是6.6xl()SCopies/ul?？梢姡碑a(chǎn)物沉淀(示 混濁度)法的敏感度為6.6xl02Copies/ul，擴(kuò)增產(chǎn)物的SYBR Green I染色法的 敏感度比示混濁度法高2個(gè)數(shù)量級(jí)，達(dá)6.6 Copies/ul，與瓊脂糖凝膠電泳(圖7 B) 相近。
通過陽(yáng)性模板10"倍稀釋，確定了 LMAP技術(shù)檢測(cè)SGIV ORP-014L時(shí)靈敏度比Nested PCR高3個(gè)數(shù)量級(jí)，達(dá)6.6個(gè)拷貝；對(duì)同一擴(kuò)增產(chǎn)物，SYBR Green I 染色的靈敏度與凝膠電泳相當(dāng)，比副產(chǎn)物沉淀直接觀測(cè)靈敏度高2個(gè)數(shù)量級(jí)。
實(shí)施例3LAMP擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)SGIV感染的GP細(xì)胞
SGIV感染GP細(xì)胞，70W以上GP細(xì)胞出現(xiàn)CPE后，收集感染細(xì)胞和健康 對(duì)照細(xì)胞。提取全基因組DNA，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增和常規(guī)PCR擴(kuò)增。質(zhì)粒pT-014L 作為陽(yáng)性對(duì)照，高壓滅菌水是陰性對(duì)照。
LAMP擴(kuò)增檢測(cè)SGIV特異性好，與常規(guī)PCR檢測(cè)結(jié)果一致,如圖8。
實(shí)施例4 LAMP擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)SGIV感染的石斑魚組織
SGIV經(jīng)腹腔注射感染石斑魚，感染后4天取不同石斑魚組織，包括脾、 腎、肝、腸、腦。提取組織全基因組DNA，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增和常規(guī)PCR擴(kuò)增。 質(zhì)粒pT-014L作為陽(yáng)性對(duì)照，高壓滅菌水是陰性對(duì)照。
結(jié)果顯示，石斑魚脾、腎感染SGIV嚴(yán)重，LAMP檢測(cè)及常規(guī)PCR檢測(cè)的電泳 條帶均清晰、明亮；肝、腸感染情況稍弱，條帶相對(duì)暗淡；未發(fā)現(xiàn)腦部感染(如 圖9所示)。
實(shí)施例5 LAMP擴(kuò)增技術(shù)撿測(cè)SGIV 014L在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)
由于LAMP擴(kuò)增的對(duì)象是特定的ORF，因此可以將該方法用于監(jiān)測(cè)特定基 因在細(xì)胞內(nèi)的時(shí)效表達(dá)。在SGIV感染GP細(xì)胞后30min、 lh、 2h、 3h、 4h、 6h、 8h 、 10h、 12h、 16h、 24h、 36h、 48h、 72h、 96h收集細(xì)胞，并在同一時(shí)間提取 感染后細(xì)胞的總RNA，用隨機(jī)引物在相同條件下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA用 于ORF-014L的LAMP檢測(cè)擴(kuò)增。質(zhì)粒pT-014L作為陽(yáng)性對(duì)照，高壓滅菌水是 陰性對(duì)照。見圖10。
初步確定在SGIV感染GP細(xì)胞6h后，在細(xì)胞內(nèi)可以檢測(cè)到ORP014L的轉(zhuǎn)錄和 表達(dá)；隨時(shí)間的推移，該ORF的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)量逐漸增高，在48h時(shí)達(dá)最大值；之 后，逐漸回落。
根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果表明，LAMP技術(shù)能夠?yàn)镾GIV提供簡(jiǎn)便、快速、靈敏的 現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和診斷，另一方面，LAMP技術(shù)可用于檢測(cè)特定基因的時(shí)效轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)石斑魚虹彩病毒的方法，其特征在于采用環(huán)介導(dǎo)的等溫核酸擴(kuò)增檢測(cè)方法。
2. 按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述環(huán)介導(dǎo)的等溫核酸擴(kuò)增檢測(cè)方法包括如下步驟(1) 克隆ORF-014L及構(gòu)建包含ORF-014L的重組質(zhì)粒模板；(2) 引物設(shè)計(jì)，引物序列為F3 : GCACGAGTATACGGCCTCTG B3: CGGCTACCAGCATCCAAT FIP:GACTACGGGTTCGATGGCTGC-TTTT-AGACGATTGCGCATGAAACABIP:ACGGGAGGAAACTTGTGCTGAT國(guó)TTTT-ATGGCCCGTAGAAGTCAGT LF: TCGCGGTTCGGGTCATCAT LB: TGCTGGAACGTGCAAAACCG;(3) 擴(kuò)增，反應(yīng)溫度為63 65°C，反應(yīng)時(shí)間20 60min。
3. 按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于步驟(1)所述的重組質(zhì)粒模板的母 本質(zhì)粒為pMD-18T。
4. 按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于步驟(3)所述的反應(yīng)溫度為65°C。
5. 按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于步驟(3)所述反應(yīng)時(shí)間60min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速檢測(cè)石斑魚虹彩病毒的方法，本發(fā)明第一次提出將環(huán)介導(dǎo)的等溫核酸擴(kuò)增檢測(cè)方法應(yīng)用于檢測(cè)石斑魚虹彩病毒。具體包括如下步驟(1)克隆ORF-014L及構(gòu)建包含ORF-014L的重組質(zhì)粒模板；(2)引物設(shè)計(jì)，引物序列為(3)擴(kuò)增，反應(yīng)溫度為63～65℃，反應(yīng)時(shí)間20～60min。本發(fā)明的LAMP檢測(cè)技術(shù)能快速檢測(cè)SGIV，能檢測(cè)SGIV 014L在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，能檢測(cè)SGIV感染的石斑魚組織，能檢測(cè)SGIV感染的GP細(xì)胞，其靈敏度比NestedPCR高3個(gè)數(shù)量級(jí)，達(dá)6.6個(gè)拷貝。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK101173317SQ20071003054
公開日2008年5月7日 申請(qǐng)日期2007年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月26日
發(fā)明者杰 公, 崔化春, 毛新亮, 秦啟偉 申請(qǐng)人:中山大學(xué)