一種對蝦白斑病綜合癥病毒的快速檢測試劑盒及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及海洋生物病原檢測技術(shù)，具體是一種對蝦白斑病綜合癥病毒的快速檢測試劑盒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]對蝦白斑綜合癥病毒是可廣泛感染蝦蟹等十足類甲殼動物苗種、成體、親體的一種大型桿狀病毒，自1993年在養(yǎng)殖對蝦中暴發(fā)以來，在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，導(dǎo)致養(yǎng)殖對蝦大量死亡，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此開發(fā)新的技術(shù)快速、準(zhǔn)確、靈敏地檢測WSSV (WSSV，White Spot SyndromeVirus),加強(qiáng)苗種和成4下檢疫以及養(yǎng)殖水體環(huán)境的檢測，對預(yù)防病毒感染，切斷病毒傳播，保障我國對蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展具有重要意義。
[0003]以往檢測對蝦白斑綜合癥病毒主要有三種辦法:1.電鏡法，該法成本高，費(fèi)時，靈敏度低，不適宜現(xiàn)場檢測；2.基因探針法，該法成本高，操作復(fù)雜；3.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(PCR法)，該法較前兩種方法快速、靈敏，但需要昂貴的PCR儀。
[0004]中國專利公告號CN 1188531C，公告日2005年2月9日，名稱為對蝦白斑綜合癥病毒基因診斷試劑盒及檢測方法。該申請案公開了一種對蝦白斑綜合癥病毒的基因診斷試劑盒及檢測方法，根據(jù)白斑綜合癥病毒基因保守區(qū)序列設(shè)計的兩對引物為主體而設(shè)計的，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，對白斑綜合癥病毒的特異性DNA核酸片段進(jìn)行定性檢測。其不足之處在于，檢測使用的PCR儀成本較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于為了解決現(xiàn)有檢測白斑綜合癥病毒的方法費(fèi)時、成本高、操作復(fù)雜的缺陷而提供一種對蝦白斑病綜合癥病毒的快速檢測試劑盒。
[0006]本發(fā)明的另一個目的在于提供一種對蝦白斑病綜合癥病毒的快速檢測試劑盒的應(yīng)用。
[0007]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
一種對蝦白斑病綜合癥病毒的快速檢測試劑盒，所述快速檢測試劑盒包括:
a)DNA提取液A —份與DNA提取液B —份；
b)LAMP預(yù)反應(yīng)液一份；
c)Bst聚合酶一份；
d)LAMP反應(yīng)穩(wěn)定液一份；
e)顯色液一份；
f)陽性對照DNA—份；
g)陰性對照DNA—份；
其中，所述組分b)包括2_4mmol/L硫酸鎂、10_12mmol/L氯化鉀、10_12mmol/L硫酸錢、質(zhì)量分?jǐn)?shù) 1-1.5% TritonX-100、2.2-2.7mmol/L dNTP、0.2-0.8 ymol/L 的引物 WSSV-FIP、0.2-0.8 ymol/L 的引物 WSSV_BIP、0.2-0.5 ymol/L 的引物 WSSV_F3、0.2-0.5 ymol/L 的引物 WSSV-B3 與 20-25mmol/L、pH 為 8-9 的 Tris-HCl ；
上述的引物的核酸序列如下:WSSV-FIP:5’ -GCTCTTGTTGTTGTTGTTGTCGCTTTTAAATAGGATGTTGTCTCAACC(SEQ ID N0.1) ；WSSV-BIP:
5’ -GCTTTCGCGGATTACCCTGTGGTTTTGAAAGATGTCCTACGACCT(SEQ ID N0.2) ；WSSV-F3:5’ -GACAACACTCTTCTTTCTTGAA(SEQ ID N0.3)；
WSSV-B3:5’ -CCAAGCTTTTACTTCTTCTTGATTTC(SEQ ID N0.4)。
[0008]在本技術(shù)方案中，本發(fā)明根據(jù)對蝦白斑綜合癥病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP25的基因序列，設(shè)計了一組能特意識別靶DNA的六個不同序列的兩個內(nèi)引物與兩個外引物，內(nèi)引物包含靶DNA的正義鏈和反義鏈；其中一個內(nèi)引物首先與靶DNA雜交，隨后的鏈置換DNA合成，在具有高度鏈置換活性的DNA聚合酶的參與下，由一個外引物啟動，釋放出單鏈DNA，并作為由雜交到靶的另一端的一個內(nèi)引物和一個外引物啟動的DNA合成的模板，產(chǎn)生一個原始的莖環(huán)DNA ;內(nèi)引物以原始的莖環(huán)DNA為模板，啟動鏈置換DNA的合成，產(chǎn)生一個原始的莖環(huán)DNA和一個新的有兩倍莖長度的莖環(huán)DNA ;在恒溫條件下，內(nèi)引物以莖環(huán)DNA為模板，通過鏈置換形成多個含有靶DNA反復(fù)重復(fù)序列的莖環(huán)DNA，在一小時內(nèi)該循環(huán)反應(yīng)可使DNA累積到19拷貝，最后通過加入熒光染料來觀察擴(kuò)增結(jié)果。
[0009]作為優(yōu)選，組分a)中DNA提取液A為組織裂解液，DNA提取液B為DNA吸附液。
[0010]作為優(yōu)選，組分c)Bst聚合酶為每微升含10-12個活性單位的Bst聚合酶。
[0011 ] 作為優(yōu)選，組分d) LAMP反應(yīng)穩(wěn)定液為礦物油。
[0012]作為優(yōu)選，組分e)顯色液為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5% SYBR Green I的熒光染料。
[0013]—種對蝦白斑病綜合癥病毒的快速檢測試劑盒的應(yīng)用，包括以下步驟:
a)樣品制備:取10-50mg對蝦組織，置于離心管中，加入100-120μ L的DNA提取液Α，搗碎 l-2min，在 98-100°C下煮 8_12min ;然后冷卻至室溫，10000-12000r/min 離心 3_4min，取上清液置于另一離心管中，加入45-55 μ L的DNA提取液B，混勻，得到待測模板DNA ;
b)核酸擴(kuò)增:根據(jù)待檢測樣品的數(shù)目，設(shè)置所需LAMP反應(yīng)管數(shù)為η，η為樣品數(shù)+—管陽性對照DNA+ —管陰性對照DNA，向每一管中加入8-9 μ L的LAMP預(yù)反應(yīng)液、1-2 μ L的Bst聚合酶與12-15 μ L的無核酸酶滅菌水，混合均勾，2000r/min離心10_15s，然后加入25-30 μ L的LAMP反應(yīng)穩(wěn)定液，混合均勻，2000r/min離心10_15s ;向上述η個反應(yīng)管內(nèi)分別加入待測模板DNA、陽性對照DNA與陰性對照DNA并標(biāo)記，然后將反應(yīng)管在65°C下恒溫反應(yīng) 1-1.5h ；
c)結(jié)果檢測:反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)管，冷卻至室溫，向反應(yīng)管中各加入1-2μ L顯色液，混勻觀察。
[0014]本發(fā)明的有益效果是:
1)本發(fā)明特異性強(qiáng)，操作簡單方便；
2)較PCR方法有更高的靈敏度，但不需要昂貴的PCR儀，降低了成本，尤其適用于基層檢驗檢疫機(jī)構(gòu)；
3)本發(fā)明結(jié)果檢測方法簡單直觀，可直接用肉眼觀察到檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0015]以下通過具體實施例，對本發(fā)明做進(jìn)一步的解釋:
實施例1
一種對蝦白斑病綜合癥病毒的快速檢測試劑盒的應(yīng)用，包括以下步驟:
a)樣品制備:取1mg對蝦組織，置于離心管中，加入10yL的DNA提取液A，搗碎lmin，在98°C下煮8min ;然后冷卻至室溫，10000r/min離心3min，取上清液置于另一離心管中，加入45 μ L的DNA提取液B，混勻，得到待測模板DNA ;
b)核酸擴(kuò)增:根據(jù)待檢測樣品的數(shù)目，設(shè)置所需LAMP反應(yīng)管數(shù)為n，n為樣品數(shù)+—管陽性對照DNA+ —管陰性對照DNA，向每一管中加入8 μ L的LAMP預(yù)反應(yīng)液、I μ L的Bst聚合酶與12 μ L的無核酸酶滅菌水，混合均勾，2000r/min離心10s，然后加入25 μ L的LAMP反應(yīng)穩(wěn)定液，混合均勾，2000r/min離心1s ;向上述η個反應(yīng)管內(nèi)分別加入待測模板DNA、陽性對照DNA與陰性對照DNA并標(biāo)記，然后將反應(yīng)管在65°C下恒溫反應(yīng)l_h ;其中，LAMP預(yù)反應(yīng)液包括 20mmol/L、pH 為 8 的 Tris-HCl、2mmol/L 硫酸鎂、10mmol/L 氯化鉀、10mmol/L 硫酸銨、1% TritonX-100、2.2mmol/L dNTP、0.2 μ mol/L 的引物 WSSV_FIP、0.2 μ mol/L 的引物WSSV-BIP、0.2 ymol/L 的引物 WSSV-F3 與 0.2 ymol/L 的引物 WSSV-B3 ；Bst 聚合酶為每微升含10個活性單位的Bst聚合酶；LAMP反應(yīng)穩(wěn)定液為礦物油；
上述的引物的核酸序列如下:WSSV-FIP:5’ -GCTCTTGTTGTTGTTGTTGTCGCTTTTAAATAGGATGTTGTCTCAACC(SEQ ID N0.1) ；WSSV-BIP:
5’ -GCTTTCGCGGATTACCCTGTGGTTTTGAAAGATGTCCTACGACCT(SEQ ID N0.2) ；WSSV-F3:5’ -GACAACACTCTTCTTTCTTGAA(SEQ ID N0.3)；
WSSV-B3:5’ -CCAAGCTTTTACTTCTTCTTGATTTC(SEQ ID N0.4)。
[0016]c)結(jié)果檢測:反應(yīng)結(jié)果后，取出反應(yīng)管，冷卻至室溫，向反應(yīng)管中各加入I μ L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5% SYBR Green I的熒光染料，混勻觀察。
[0017]在陰性對照反應(yīng)管液體為橙色，陽性對照反應(yīng)管液體呈綠色的條件下:
a)待檢樣品反應(yīng)管液體呈綠色，該樣品結(jié)果為對蝦白斑綜合癥病毒陽性；
b)待檢樣品反應(yīng)管液體呈橙色，則可報告對蝦白斑綜合癥病毒檢驗結(jié)果為陰性；
實施例2
一種對蝦白斑病綜合癥病毒的快速檢測試劑盒的應(yīng)用，包括以下步驟:
a)樣品制備:取30mg對蝦組織，置于離心管中，加入IlOyL的DNA提取液A，搗碎2min，在9