本發(fā)明涉及特異性結(jié)合人α-烯醇化酶蛋白(ENO1)的抗體的生產(chǎn)和使用方法。

發(fā)明背景

腫瘤產(chǎn)生于單個細(xì)胞的異常、無限制增殖產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化細(xì)胞繁殖系。腫瘤細(xì)胞可表達(dá)獨(dú)特的可被免疫系統(tǒng)識別的抗原。腫瘤相關(guān)的抗原包括突變的致癌基因、突變的正常細(xì)胞蛋白，異常表達(dá)的細(xì)胞蛋白，異常的細(xì)胞表面蛋白，以及致癌性病毒蛋白。免疫系統(tǒng)將這些腫瘤相關(guān)的抗原識別為非自身抗原，并可產(chǎn)生抗體以清除攜帶這些外源抗原的腫瘤細(xì)胞，同時留下健康細(xì)胞。因此，鑒別出免疫原性腫瘤相關(guān)抗原，可用作癌癥治療中臨床預(yù)后或治療應(yīng)用的靶標(biāo)。

可由肺與胸壁之間的過量體液，即胸腔積液來鑒別某些惡性腫瘤。肺癌、乳腺癌以及淋巴瘤引起的惡性胸腔積液約占全部惡性胸腔積液的75％。惡性胸腔積液可能富含有淋巴細(xì)胞浸潤物和腫瘤細(xì)胞。已在積液中發(fā)現(xiàn)了腫瘤相關(guān)免疫復(fù)合物或自身抗體，如抗p53抗體、抗核抗體和抗L-Myc抗體，且已發(fā)現(xiàn)這些復(fù)合物或自身抗體與差的預(yù)后有關(guān)。還已在惡性積液中鑒別到幾種肺部腫瘤相關(guān)的抗原，包括細(xì)胞角蛋白19的片段，神經(jīng)元特異性烯醇化酶(ENO2)，鱗狀細(xì)胞癌抗原以及可溶性HLA-I等。

α-烯醇化酶(烯醇化酶-1，ENO1)是個多功能蛋白，最初發(fā)現(xiàn)是糖酵解通路中的一個關(guān)鍵的酶。在正常條件下，ENO1表達(dá)在細(xì)胞溶質(zhì)中。但是，也發(fā)現(xiàn)ENO1表達(dá)在許多癌細(xì)胞的細(xì)胞表面上，作為血纖維蛋白溶酶原的受體，以及表達(dá)在活化的造血細(xì)胞如中性白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞上。已知血纖維蛋白溶酶原受體蛋白的上調(diào)可誘導(dǎo)尿激酶血纖維蛋白溶酶原活化系統(tǒng)(uPAS)的級聯(lián)反應(yīng)。

尿激酶血纖維蛋白溶酶原活化系統(tǒng)(uPAS)由尿激酶血纖維蛋白溶酶原活化因子(uPA)、其同源受體(uPAR)以及兩個特異性抑制劑(血纖維蛋白溶酶原活化因子抑制劑1(PAI-1)與血纖維蛋白溶酶原活化因子抑制劑2(PAI-2))組成。尿激酶血纖維蛋白溶酶原活化因子將血纖維蛋白溶酶原轉(zhuǎn)換成一種活化的絲氨酸蛋白酶，即血纖維蛋白溶酶。血纖維蛋白溶酶參與許多組織重塑過程，例如基底膜(BM)和胞外基質(zhì)(ECM)重塑，這些都是腫瘤生長和移轉(zhuǎn)所需要的。此外，已顯示uPAS可能會參與到腫瘤發(fā)展，影響腫瘤血管生成，惡性腫瘤細(xì)胞增生、黏附與遷移，內(nèi)部的血管形成以及在轉(zhuǎn)移部位的生長。

具體而言，血纖維蛋白溶酶原的活化可導(dǎo)致胞外基質(zhì)降解，這反過來會引起癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移增加以及免疫細(xì)胞的浸潤。換言之，表達(dá)在癌細(xì)胞表面上的作為血纖維蛋白溶酶原受體的ENO1可增加癌細(xì)胞的侵襲活性。因此，ENO1是潛在的癌治療靶標(biāo)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的實(shí)施方案涉及特異性結(jié)合人ENO1，從而抑制配體(如血纖維蛋白溶酶原)結(jié)合ENO1的靶向結(jié)合劑。通過抑制血纖維蛋白溶酶原與ENO1的結(jié)合，本發(fā)明的靶向結(jié)合劑能抑制血纖維蛋白溶酶原活化，引起減少的胞外基質(zhì)降解，這反過來能預(yù)防或降低癌細(xì)胞從胞外基質(zhì)脫離。因此，本發(fā)明各實(shí)施方案中的靶向結(jié)合劑可用于抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移?？蓪?shí)現(xiàn)上述作用的機(jī)制可包括但不限于抑制配體(如血纖維蛋白溶酶原)與其受體ENO1的結(jié)合，或消除受體ENO1與其配體之間的相互作用，從而減少ENO1的有效濃度。

根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方案，靶向結(jié)合劑是可結(jié)合人ENO1以阻止其配體(如血纖維蛋白溶酶原)與ENO1結(jié)合的抗體。阻止血纖維蛋白溶酶原與其受體的結(jié)合可預(yù)防血纖維蛋白溶酶原活化。這導(dǎo)致癌細(xì)胞的胞外基質(zhì)中的尿激酶血纖維蛋白溶酶原活化系統(tǒng)(uPAS)被抑制。

根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，抗體可以高親和力結(jié)合ENO1，如以低于0.3nM的K_d結(jié)合。這類緊密結(jié)合劑可高效抑制ENO1。

根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，靶向結(jié)合劑是可結(jié)合人ENO1并高效抑制(例如80％、90％或100％抑制)癌細(xì)胞上誘導(dǎo)的血纖維蛋白溶酶活性的抗體?？墒褂?0微克/mL脂多糖(LPS)處理癌細(xì)胞(如U937人淋巴瘤細(xì)胞)5小時，誘導(dǎo)該癌細(xì)胞中ENO1表達(dá)，從而進(jìn)行抑制分析?？墒褂煤线m濃度的抗體檢測這種誘導(dǎo)的血纖維蛋白溶酶活性抑制。使用本發(fā)明的抗體，可在低至20微克/ml甚至更低的抗體濃度檢測到這種抑制效果。

根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，靶向結(jié)合劑是可結(jié)合人ENO1的抗體。這種抗體可用于抑制癌細(xì)胞的侵襲活性。例如，本發(fā)明抗體可在其濃度低至50微克/毫升或更低時抑制人非小細(xì)胞肺癌CL1-5細(xì)胞50％、60％或70％以上的侵襲活性。

根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，靶向結(jié)合劑是能結(jié)合人ENO1以抑制胞外基質(zhì)降解，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞從細(xì)胞外基質(zhì)脫離的抗體。例如，本發(fā)明抗體可在其濃度低至50微克/毫升或更低時抑制40％、50％或60％以上的血纖維蛋白溶酶原介導(dǎo)的CL1-5細(xì)胞與膠原蛋白或纖連蛋白的脫離。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，靶向結(jié)合劑(如抗體)可包含具有互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的重鏈氨基酸序列，該重鏈氨基酸序列含有序列1中所含CDR序列中的一條CDR序列。

根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，靶向結(jié)合劑(如抗體)可包含具有互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的輕鏈氨基酸序列，該輕鏈氨基酸序列含有序列2中所含的CDR序列中的一條CDR序列。

根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，靶向結(jié)合劑是抗體，該抗體可為單克隆抗體或多克隆抗體。

根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，可結(jié)合人ENO1蛋白的抗體含有輕鏈氨基酸序列，該輕鏈氨基酸序列含有序列2中所含的LCDR1、LCDR2或LCDR3序列中的任意一個。

根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，可結(jié)合人ENO1蛋白的抗體含有輕鏈氨基酸序列，該輕鏈氨基酸序列含有序列2中所含的LCDR1、LCDR2或LCDR3序列中的任意兩個，即LCDR1與LCDR2、LCDR1與LCDR3或LCDR2與LCDR3。

根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，可結(jié)合人ENO1蛋白的抗體含有輕鏈氨基酸序列，該輕鏈氨基酸序列含有序列2中所含的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，抗體可以是人源化抗體或完全人單克隆抗體。

根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，可結(jié)合人ENO1蛋白的抗體含有重鏈氨基酸序列，該重鏈氨基酸序列含有序列1所含的HCDR1、HCDR2或HCDR3序列中的任意一個。

根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，可結(jié)合人ENO1蛋白的抗體含有重鏈氨基酸序列，該重鏈氨基酸序列含有序列1中所含的HCDR1、HCDR2或HCDR3序列中的任意兩個，即HCDR1與HCDR2、HCDR1與HCDR3或HCDR2與HCDR3。

根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，可結(jié)合人ENO1蛋白的抗體含有重鏈氨基酸序列，該重鏈氨基酸序列含有序列1中所含的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，抗體可以是人源化抗體或完全人單克隆抗體。

根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，可結(jié)合人ENO1蛋白的抗體含有具有CDR的輕鏈氨基酸序列，該CDR含有序列2所含CDR序列中的一個CDR。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，可結(jié)合人ENO1蛋白的抗體含有具有CDR的重鏈氨基酸序列，該CDR含有序列1所含CDR序列中的一個CDR。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，抗體可以是人源化抗體或完全人單克隆抗體。

根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，可結(jié)合人ENO1蛋白的抗體含有具有序列1所含CDR序列中的一條CDR序列的重鏈氨基酸序列和具有序列2所含CDR序列中的一條CDR序列的輕鏈氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，抗體可以是人源化抗體或完全人單克隆抗體。

根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，靶向結(jié)合劑(如抗體)可與血纖維蛋白溶酶原競爭結(jié)合人ENO1蛋白。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，所述靶向結(jié)合劑含有具有序列1所含CDR序列中的至少一條CDR序列的重鏈氨基酸序列和具有序列2所含CDR序列中的至少一條CDR序列的輕鏈氨基酸序列。

根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，靶向結(jié)合劑可結(jié)合含人ENO1蛋白(Genbank：AAH50642.1)的氨基酸序列²⁹⁶FDQDDWGAWQKFTA³⁰⁹(SEQ ID NO:9)或³²⁶KRIAKAVNEKS³³⁶(SEQ ID NO:10)的表位。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，所述靶向結(jié)合劑含有具有序列1所含CDR序列中的至少一條CDR序列的重鏈氨基酸序列和具有序列2所含CDR序列中的至少一條CDR序列的輕鏈氨基酸序列。

根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，本發(fā)明的結(jié)合劑可含有位于非抗體分子中的抗原結(jié)合位點(diǎn)。例如，這類結(jié)合劑可含有一個或多個CDR，如下文將詳述的非抗體蛋白骨架中的一組CDR。

本發(fā)明的某些實(shí)施方案涉及檢測患者或患者樣品中人ENO1蛋白的水平的方法。本發(fā)明的方法包括使抗ENO1抗體與患者的生物學(xué)樣品接觸，檢測所述抗體與所述樣品中人ENO1蛋白之間的結(jié)合水平。在某些具體實(shí)施方案中，生物樣品是血液或血漿。

本發(fā)明其它實(shí)施方案涉及含有靶向結(jié)合劑的組合物，該組合物可含有抗體或其功能性片段以及藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體。

本發(fā)明其它實(shí)施方案涉及有效治療患有ENO1疾病或病癥的對象(如人或動物)的方法。該方法可包括選擇需要治療腫瘤性疾病或非腫瘤性疾病的對象，給予該對象治療有效劑量的特異性結(jié)合ENO1蛋白的抗體(可以是人源化抗體或完全人單克隆抗體)。

本發(fā)明的抗體可用于治療人ENO1蛋白相關(guān)的疾病或病癥。人ENO1蛋白相關(guān)的疾病或病癥可以是任何產(chǎn)生自人ENO1蛋白的異?；罨虮磉_(dá)的疾病。這類疾病的例子包括人ENO1蛋白與其配體異常反應(yīng)，從而改變細(xì)胞粘附或細(xì)胞信號特征的疾病。細(xì)胞粘附或細(xì)胞信號特征的這種改變可導(dǎo)致腫瘤性疾病或某些免疫疾病。

例如，人ENO1蛋白相關(guān)的疾病可以是腫瘤性疾病，如肺癌、乳腺癌、胰腺癌肝癌、結(jié)直腸癌和前列腺癌。

根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，靶向結(jié)合劑(如抗體)可結(jié)合含人ENO1蛋白(Genbank：AAH50642.1)的氨基酸序列²⁹⁶FDQDDWGAWQKFTA³⁰⁸(SEQ ID NO:9)或³²⁶KRIAKAVNEKS³³⁶(SEQ ID NO:10)的肽，并可用于治療前文所述的人ENO1蛋白相關(guān)的疾病或病癥。

本發(fā)明的其它實(shí)施方案涉及抑制對象中ENO1誘導(dǎo)的細(xì)胞從癌細(xì)胞的胞外基質(zhì)中脫離的方法。這些方法可包括選擇需要治療ENO1誘導(dǎo)的細(xì)胞脫離的對象(如人或動物)，和給予所述對象治療有效劑量的抗體，其中所述抗體特異性結(jié)合ENO1。所述抗體可以是人源化抗體或完全人單克隆抗體。

本發(fā)明的其它實(shí)施方案涉及抗體在制備用于治療對象(如人或動物)中ENO1相關(guān)的疾病或病癥的藥劑中的應(yīng)用，其中，所述抗體特異性結(jié)合ENO1。所述抗體可以是人源化抗體或完全人單克隆抗體。

根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，本文所述的靶向結(jié)合劑可用于制備用于治療動物中ENO1蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞從胞外基質(zhì)的脫離的藥劑，其中，所述抗體特異性結(jié)合ENO1。所述抗體可以是人源化抗體或完全人單克隆抗體。

本文所述的本發(fā)明某些實(shí)施方案涉及結(jié)合人ENO1并影響人ENO1功能的單克隆抗體。本發(fā)明的其它實(shí)施方案涉及具有治療應(yīng)用所需特性的抗ENO1抗體制劑。這些特性可包括對ENO1的高結(jié)合親和力，體外和體內(nèi)中和ENO1活性的能力，以及抑制ENO1誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞脫離、生長和轉(zhuǎn)移的能力。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及可以非常高的親和力(即，K_d低)結(jié)合人ENO1的抗體。例如，該抗體可以是能以低于約10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10或約10^-11M或介于這些端點(diǎn)之間的任意范圍或數(shù)值的K_d結(jié)合ENO1的人、兔、小鼠、嵌合型或人源化抗體。可使用本文所述或本領(lǐng)域已知的技術(shù)，用ELISA和/或BIACORE測量親和力和/或結(jié)合性。

應(yīng)理解，本發(fā)明實(shí)施方案并不限于任何特定形式的抗體或其生產(chǎn)或制備方法。例如，抗ENO1抗體可以是全長抗體(如具有完整的人Fc區(qū))或抗體片段(如Fab、Fab’或F(ab’)₂、FV或Dab(Dab是人抗體最小的功能性結(jié)合單元))。此外，抗體可以采用分泌該抗體的雜交瘤制備，或由已轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染有編碼該抗體的基因的重組產(chǎn)生的細(xì)胞制備。

本發(fā)明其它實(shí)施方案涉及編碼本文所述任一抗體的分離的核酸分子，具有所述編碼抗ENO1抗體的分離的核酸分子的載體，或轉(zhuǎn)化了任意一種這類核酸分子的宿主細(xì)胞。

此外，本發(fā)明的某些實(shí)施方案涉及制備抗ENO1抗體的方法，通過在核酸分子表達(dá)產(chǎn)生抗體的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，之后回收該抗體。應(yīng)認(rèn)識到，本發(fā)明的實(shí)施方案還可包括編碼本發(fā)明抗體或抗體片段的任意核酸分子，該核酸分子可包括經(jīng)優(yōu)化以在轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中進(jìn)行抗體生產(chǎn)時提高抗體或其片段的產(chǎn)率的核酸序列。

本發(fā)明的其它實(shí)施方案可涉及通過用人ENO1蛋白、其片段和一種或多種直系同源序列或其片段免疫動物而生產(chǎn)針對人ENO1的高親和力抗體的方法。

其它實(shí)施方案涉及可特異性結(jié)合人ENO1的分離抗體的產(chǎn)生和鑒別?？赏ㄟ^這些抗體實(shí)現(xiàn)ENO1生物學(xué)活性的抑制，從而預(yù)防ENO1誘導(dǎo)的細(xì)胞脫離、侵襲和其它期望的對癌癥的作用。

本發(fā)明其它實(shí)施方案涉及含有有效量的抗ENO1抗體的藥物組合物。該組合物還可含有藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體或稀釋劑。在其它實(shí)施方案中，所述抗ENO1抗體或其片段與治療劑偶聯(lián)。治療劑可以是如毒素或放射性同位素。

本發(fā)明的其它實(shí)施方案涉及治療患者中與ENO1表達(dá)相關(guān)的疾病或病癥的方法。這些方法可包括給予患者有效量的抗ENO1抗體。所述抗ENO1抗體可單獨(dú)給予，或可與其它抗體或化療藥或放療組合給予。例如，阻斷細(xì)胞脫離的ENO1抗體的單克隆抗體、寡克隆抗體或多克隆抗體混合物可直接與能抑制腫瘤細(xì)胞增殖的藥物一同給予。該方法可以體內(nèi)實(shí)施，患者優(yōu)選是人患者。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法涉及治療ENO1相關(guān)的疾病或病癥，包括但不限于腫瘤性疾病，如肺癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌和/或?qū)嶓w瘤。

本發(fā)明的某些實(shí)施方案涉及監(jiān)控癌癥發(fā)展的方法。該方法可包括測定樣品(如癌細(xì)胞)中α-烯醇化酶蛋白(ENO1)的豐度，其中提高的ENO1水平與癌癥的嚴(yán)重程度相關(guān)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，可通過測量ENO1特異性抗體與ENO1蛋白的結(jié)合而測量該豐度。

本發(fā)明的某些實(shí)施方案涉及檢測癌癥的方法。這種方法可包括測定血清樣品中ENO1特異性抗體的豐度，其中，低水平的ENO1特異性抗體表明存在惡性腫瘤。

附圖簡述

圖1A和1B分別顯示使用流式細(xì)胞術(shù)(圖1A)和免疫染色法(圖1B)檢測惡性腫瘤細(xì)胞中ENO1在細(xì)胞表面的位置所獲得的結(jié)果。詳細(xì)的方法如實(shí)施例1所述實(shí)施。數(shù)據(jù)顯示ENO1位于惡性腫瘤細(xì)胞(NHRI-L89和CA926)的細(xì)胞表面上，但在不存在于正常肺上皮細(xì)胞(NHBE和SAEC)中。

圖2顯示抗細(xì)胞表面ENO1的多克隆抗體對高侵入性CL1-5肺癌細(xì)胞侵襲活性的抑制。詳細(xì)的方法如實(shí)施例2所述實(shí)施。數(shù)據(jù)顯示給予抗ENO1多克隆抗體減弱CL1-5的侵襲。

圖3顯示抗人ENO1多克隆抗體減弱CL1-5F4細(xì)胞在肺中的組織侵襲能力。給予動物抗體，并在使用IVIS系統(tǒng)進(jìn)行腫瘤注射后第12和19天監(jiān)測肺轉(zhuǎn)移性群落的形成。詳細(xì)的方法如實(shí)施例3所述實(shí)施。數(shù)據(jù)顯示ENO1多克隆抗體體內(nèi)抑制CL1-5F4向肺遷移。

圖4顯示抗ENO1抗體雜交瘤的產(chǎn)生及采用流式細(xì)胞術(shù)檢驗各單克隆抗體克隆。免疫小鼠和產(chǎn)生雜交瘤，以及各抗體的產(chǎn)生和經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢驗抗體的方法如實(shí)施例4所述。數(shù)據(jù)顯示所有5個雜交瘤抗體識別CL1-5F4肺癌細(xì)胞上的表面ENO1。

圖5A顯示利用ELISA方法檢測的從單個雜交瘤的腹水中分離的5種抗體對ENO1的結(jié)合。硫酸銨純化、蛋白A柱純化以及SDS-PAGE純化如實(shí)施例5所述實(shí)施。圖5B的數(shù)據(jù)顯示5種不同的抗人ENO1抗體的K_d值。

圖6顯示從單個雜交瘤的腹水中分離的5種抗體各自的U937血纖維蛋白檢測結(jié)果。人U937淋巴瘤細(xì)胞系中LPS誘導(dǎo)的ENO1表達(dá)以及血纖維蛋白溶酶活性檢測如實(shí)施例6所述實(shí)施。這些數(shù)據(jù)還顯示5種不同的抗ENO1抗體對ENO1的血纖維蛋白溶酶受體具有不同的抑制活性，且該抑制活性與K_d值相關(guān)。

圖7顯示分別用從單個雜交瘤的腹水中分離的5種不同抗體處理的CL1-5細(xì)胞其侵襲活性的抑制結(jié)果。詳細(xì)的方法如實(shí)施例7所述。這些數(shù)據(jù)顯示所有5種不同的抗ENO1抗體可抑制CL1-5細(xì)胞的侵襲活性。有意思的是，雖然克隆8的K_d值高于克隆10約7.2倍，克隆8對CL1-5侵襲活性的抑制與克隆10類似。

圖8A顯示用分離自雜交瘤的不同濃度的EN10mAb處理的CL1-5細(xì)胞的侵襲活性。詳細(xì)的方法如實(shí)施例8所述實(shí)施。這些數(shù)據(jù)顯示EN10mAb抗體以劑量依賴性的方式抑制CL1-5的侵襲活性。

圖8B顯示經(jīng)LPS誘導(dǎo)細(xì)胞表面表達(dá)ENO1之后，經(jīng)分離自雜交瘤的不同濃度的EN10mAb處理的U937細(xì)胞的侵襲活性。詳細(xì)的方法如實(shí)施例8所述實(shí)施。這些數(shù)據(jù)顯示EN10mAb抗體以劑量依賴性的方式抑制U937細(xì)胞的侵襲活性。

圖9顯示EN10mAb識別LPS處理的U937上的細(xì)胞表面ENO1。詳細(xì)的方法如實(shí)施例9所述所述。

圖10A顯示CL1-5肺癌細(xì)胞對基質(zhì)蛋白的粘附活性。粘附試驗如實(shí)施例10所述實(shí)施。這些數(shù)據(jù)顯示CL1-5細(xì)胞對膠原蛋白和纖連蛋白具有較高的粘附活性。

圖10B顯示用EN10mAb處理對CL1-5細(xì)胞從纖連蛋白的脫離的抑制效果。與細(xì)胞相關(guān)的粘附試驗如實(shí)施例10所述實(shí)施。這些數(shù)據(jù)顯示EN10mAb以劑量依賴性的方式抑制CL1-5從纖連蛋白脫離的活性。

圖10C顯示顯示用EN10mAb處理對CL1-5細(xì)胞從膠原蛋白的脫離的抑制效果。與細(xì)胞相關(guān)的粘附試驗如實(shí)施例10所述實(shí)施。這些數(shù)據(jù)顯示EN10mAb以劑量依賴性的方式抑制CL1-5從纖連蛋白脫離的活性。

圖11A描述EN10mAb的可變重鏈區(qū)域的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。指示了框架區(qū)(FR1、FR2、FR3和FR4)和CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)。如實(shí)施例11所述進(jìn)行EN10mAb的克隆。

圖11B描述EN10mAb的可變輕鏈區(qū)域的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。指示了框架區(qū)(FR1、FR2、FR3和FR4)和CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)。如實(shí)施例11所述進(jìn)行EN10mAb的克隆。

圖12A顯示EN10mAb對ENO1的缺失突變體的結(jié)合活性。EN10mAb的結(jié)合表位位于人ENO1蛋白的氨基酸殘基293和434之間。如實(shí)施例12所述使ENO1大部分缺失，以測定EN10mAb的結(jié)合區(qū)域。

圖12B顯示純化自大腸桿菌的ENO1的6種C末端缺失突變蛋白的12％SDS PAGE。詳細(xì)的純化ENO1缺失突變體的方法如實(shí)施例12所述。

圖12C顯示EN10mAB對ENO1的6種C末端缺失突變體的結(jié)合活性。EN10mAb的結(jié)合表位位于人ENO1蛋白的氨基酸殘基296和336之間。如實(shí)施例12所述使ENO1的大部分缺失，以測定EN10mAb的結(jié)合區(qū)域。

圖13A描述人ENO1氨基酸殘基296和336之間的晶體結(jié)構(gòu)和表面暴露。結(jié)構(gòu)預(yù)測如實(shí)施例13所述。

圖13B顯示純化自大腸桿菌的ENO1的11種丙氨酸掃描突變蛋白的12％SDS PAGE。詳細(xì)的純化ENO1突變蛋白的方法如實(shí)施例13所述。

圖13C顯示11種丙氨酸掃描突變體對EN10mAb的ENO1結(jié)合ELISA和K_d值。結(jié)果表明位于人ENO1氨基酸殘基296和336之間的ENO1肽1的序列(FDQDDWGAWQKFTA，SEQ ID NO:9)和肽2的序列(KRIAKAVNEKS，SEQ ID NO:10)參與了EN10mAb結(jié)合。丙氨酸掃描如實(shí)施例13所述進(jìn)行。

圖13D顯示位于人ENO1(SEQ ID NO:49)氨基酸殘基296和336之間的ENO1肽1的序列(FDQDDWGAWQKFTA，SEQ ID NO:9)和肽2的序列(KRIAKAVNEKS，SEQ ID NO:10)，它們參與了人ENO1與EN10mAb的結(jié)合。

圖14A顯示人ENO1蛋白的3D結(jié)構(gòu)。圖14B描述與人的ENO1蛋白的血纖維蛋白溶酶原結(jié)合區(qū)域結(jié)復(fù)合的EN10mAb Fab的推定的結(jié)構(gòu)(以條帶-螺旋的方式顯示，輕鏈為灰色，重鏈為黑色)。ENO1蛋白和EN10mAb的晶體結(jié)構(gòu)預(yù)測如實(shí)施例14所述實(shí)施。

圖15A顯示用于產(chǎn)生小鼠-人嵌合EN10mAb的表達(dá)載體。純化該EN10mAb嵌合抗體的詳述過程如實(shí)施例15所述。

圖15B描述使用嵌合抗體測定EN10mAb的結(jié)合親和力和動力學(xué)常數(shù)的結(jié)果。嵌合抗體表達(dá)、純化以及K_d分析的詳細(xì)過程如實(shí)施例15所述。

圖16顯示EN10mAb對補(bǔ)體存在下肺部腫瘤生長的抑制效果。EN10mAb的給予以及抗體處理導(dǎo)致的腫瘤生長延遲如實(shí)施例16所述實(shí)施。數(shù)據(jù)顯示，在CL1-5異種移植小鼠模型中，每周給予EN10mAb和補(bǔ)體兩次，產(chǎn)生的療效與相同劑量的市售藥物ErbituxTM的療效類似。

圖17A、17B和17C顯示脾臟-肝臟轉(zhuǎn)移群落形成試驗中EN10mAb阻斷胰腺癌腫瘤擴(kuò)散的結(jié)果。EN10mAb的給予和抗體處理以抑制轉(zhuǎn)移性腫瘤的生長如實(shí)施例17所述實(shí)施。此研究結(jié)果表明，在脾臟-肝臟轉(zhuǎn)移小鼠模型中，與給予相同劑量的對照IgG的小鼠相比，每周給予10mpk(mg/kg)的EN10mAb兩次能降低小鼠中轉(zhuǎn)移的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量，腫瘤體積以及腫瘤重量。

定義

除非另有定義，否則本文所用的科技術(shù)語應(yīng)具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所慣常理解的含義。此外，除非文中另有要求，否則單數(shù)術(shù)語應(yīng)包括其復(fù)數(shù)形式，而復(fù)數(shù)術(shù)語應(yīng)包括其單數(shù)形式。通常，與本文所述細(xì)胞和組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)和蛋白、寡核苷酸或多核苷酸化學(xué)和雜交結(jié)合使用的術(shù)語及其技術(shù)均為本領(lǐng)域所周知并慣常使用的術(shù)語和技術(shù)。

本發(fā)明采用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA、寡核苷酸合成和組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化(如電穿孔、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染)技術(shù)。根據(jù)制造商的說明書或本領(lǐng)域慣常使用的技術(shù)或根據(jù)本文所述實(shí)施酶反應(yīng)和純化技術(shù)。根據(jù)本領(lǐng)域周知或本說明書引用和討論的各一般及具體文獻(xiàn)中所述的常規(guī)方法實(shí)施前述各技術(shù)和方法?？蓞⒁娎鏢ambrook等，《分子克?。簩?shí)驗室手冊》(第3版，冷泉港出版社，冷泉港，紐約，2001)，本文將其以引用的方式納入本文。與本文所述的分析化學(xué)、有機(jī)合成化學(xué)以及醫(yī)學(xué)和藥學(xué)化學(xué)結(jié)合使用的術(shù)語和實(shí)驗室方法和技術(shù)是本領(lǐng)域周知和慣常使用的術(shù)語、實(shí)驗室方法和技術(shù)。采用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)用于化學(xué)合成、化學(xué)分析、藥物制備、制劑、遞送以及患者治療。

如本公開所用，除非另有說明，下述術(shù)語應(yīng)被理解為具有以下含義。本文所用術(shù)語“和/或”應(yīng)理解為具體公開了兩個指定特征或組分中的每一個或其組合。例如，“A和/或B”應(yīng)理解為具體公開了(i)A，(ii)B和(iii)A和B，就如它們各自在文中被單獨(dú)列出的那樣。

拮抗劑可以是多肽、核酸、碳水化合物、脂質(zhì)、小分化合物、寡核苷酸、寡肽、干擾RNA(RNAi)、反義分子、重組蛋白、抗體或其偶聯(lián)物或融合蛋白。對于RNAi的綜述，可參見Milhavet O、Gary D S、Mattson M P(Pharmacol Rev.，2003年12月，55(4)：629-48；綜述)；和對于反義方案的綜述，可參見Opalinska J B、Gewirtz A M(Sci STKE，2003年10月28日，2003(206)：pe47)。

疾病相關(guān)的“ENO1”的異常活化或表達(dá)可以是任何異常的、不需要的或病理性細(xì)胞粘附，如腫瘤相關(guān)的細(xì)胞粘附。細(xì)胞粘附相關(guān)的疾病包括但不限于非實(shí)體瘤，如白血病或淋巴瘤，以及實(shí)體瘤，如黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、肝細(xì)胞(肝)癌、胃癌、頭頸癌、肝系統(tǒng)的癌癥、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肺癌、子宮癌、外陰癌、結(jié)直腸癌和胰腺癌。

術(shù)語ENO1指由ENO1與ENO2或ENO3組成的雜二聚烯醇化酶分子。

本文所用術(shù)語“抗體”廣義上泛指免疫球蛋白、自身抗體、單克隆抗體和多克隆抗體，及其活性片段。片段的活性可體現(xiàn)在其能結(jié)合同類抗原，或其具有生物學(xué)功能。本發(fā)明的抗體可以是采用本領(lǐng)域周知的技術(shù)制得的嵌合型，人源化或者是人抗體。

本文所用術(shù)語“單克隆抗體”指化學(xué)和免疫學(xué)均質(zhì)的通常由雜交瘤產(chǎn)生的抗體。參見《實(shí)驗室手冊》，Harlow和Lane編，冷泉港，紐約(1988)。

本文所用術(shù)語“多克隆抗體”指一種以上合成抗體的血漿細(xì)胞(B淋巴細(xì)胞)克隆響應(yīng)相同抗原產(chǎn)生的抗體。它們通常在用該抗原免疫動物后用該動物產(chǎn)生。

本文所用術(shù)語“嵌合抗體”指含來自一個以上來源的序列的抗體。例如，這類抗體可含有來自非人來源的序列，該序列隨后通過引入人序列而被修飾。本文所用術(shù)語“人源化抗體”指非人抗體的最小部分引入了不同的人抗體而獲得的抗體。本文所用術(shù)語“人抗體”指蛋白基本上每個部分在人中基本上都無免疫原性，且僅具有少數(shù)序列變化或變異的抗體。

本文所用術(shù)語“α-烯醇化酶特異性抗體”指對哺乳動物ENO1而非對ENO2或ENO3具有高特異性的抗體。類似的，術(shù)語“ENO1特異性抗體”指結(jié)合α-烯醇化酶蛋白的抗體。

當(dāng)針對靶向結(jié)合劑如抗體時，術(shù)語“中和性”涉及所述靶向結(jié)合劑消除或明顯降低靶抗原活性的能力。因此，“中和性”ENO1抗體能消除或明顯降低ENO1的活性。中和性ENO1抗體可通過例如阻斷ENO1與血纖維蛋白溶酶原的結(jié)合而起作用。通過阻斷這種結(jié)合，血纖維蛋白溶酶原介導(dǎo)的細(xì)胞脫離明顯或完全被消除。理想的是，抗ENO1的中和性抗體提高細(xì)胞粘附。

本文所用術(shù)語“多肽”為一泛指術(shù)語，指多肽序列的天然蛋白質(zhì)、片段或類似物。因此，天然蛋白質(zhì)、片段和類似物是多肽的具體種類。本發(fā)明優(yōu)選的多肽含有人免疫球蛋白分子的重鏈和人免疫球蛋白分子的κ輕鏈，以及由含免疫球蛋白分子的重鏈和免疫球蛋白分子的輕鏈(如免疫球蛋白分子的κ或λ輕鏈)及其片段或類似物的組合形成的抗體分子，反之亦然。本發(fā)明優(yōu)選的多肽還可僅含有人免疫球蛋白分子的重鏈或其片段。

術(shù)語“多核苷酸”在本文中指長度至少為10個堿基的核苷酸的聚合形式，可以是核糖核苷酸或脫氧核苷酸，或任一類型的核苷酸的修飾形式，或者是RNA-DNA雜雙鏈體。該術(shù)語包括單鏈或雙鏈形式的DNA。

術(shù)語“CDR區(qū)”或“CDR”意指如Kabat等1991年(Kabat,E.A.等，1991，“免疫學(xué)感興趣的蛋白的序列”，第5版，美國衛(wèi)生和人類服務(wù)部，公共服務(wù)，NIH，華盛頓)及之后版本中所定義的免疫球蛋白的重鏈或輕鏈的超變區(qū)。抗體通常含有3個重鏈CDR和3個輕鏈CDR。術(shù)語CDR用于此(依據(jù)不同情況)是為了指這些區(qū)域中的一個或幾個甚至全部，其含有大部分的負(fù)責(zé)該抗體依親和力與其識別的抗原或表位的結(jié)合的氨基酸殘基。

在6條短CDR序列當(dāng)中，重鏈的第三個CDR(HCDR3)具有較大的長度可變性(主要是由于產(chǎn)生該CDR的基因的排列機(jī)制而具有較大多樣性)。該CDR可短至2個氨基酸，雖然已知最長的長度是26個。CDR長度還可根據(jù)被特定基本骨架容納的長度而變化。功能上，HCDR3的作用在某種程度上是確定該抗體的特異性(Segal等，PNAS，71：4298-4302，1974)。

術(shù)語“一組CDR”在本文中包括CDR1、CDR2和CDR3。因此，一組HCDR指HCDR1、HCDR2和HCDR3(HCDR指重鏈可變區(qū)CDR)，和一組LCDR指LCDR1、LCDR2和LCDR3(LCDR指輕鏈可變區(qū)CDR)。除非另有說明，“一組CDR”包括HCDR和LCDR。

術(shù)語“對應(yīng)于”在本文中用于指多核苷酸序列與參比多核苷酸序列的全部或部分同源，即相同但進(jìn)化上并不嚴(yán)格相關(guān)；或者指多肽序列與參比多肽序列相同。

對比上，術(shù)語“互補(bǔ)于”在本文中用于指互補(bǔ)序列與參比多核苷酸序列的全部或一部分同源。出于說明目的，核苷酸序列“TATAC”對應(yīng)于參比序列“TATAC”，并與參比序列“GTATA”互補(bǔ)。

術(shù)語“序列相同性”指兩條多核苷酸序列或氨基酸序列在比較窗口中(以核苷酸對核苷酸或殘基對殘基的方式對比)是相同的。術(shù)語“序列相同性百分比”如下計算：在比較窗口中比較兩條最優(yōu)比對的序列，測定兩條序列中出現(xiàn)了相同核酸堿基(如A、T、C、G、U或I)或氨基酸殘基的位置的數(shù)量以獲得匹配位置的數(shù)量，將匹配位置的數(shù)量除以對比窗口的總位置數(shù)量(即窗口大小)，并將所得結(jié)果乘與100，以獲得序列相同性百分比。

術(shù)語“基本上相同”或“基本上一致”在本文中指多核苷酸序列或氨基酸序列的一種特征，其中該多核苷酸序列或氨基酸序列含有的序列與參比序列相比，在至少18個核苷酸(6個氨基酸)位置的比對窗口中(通常是在至少24－48個核苷酸(8－16個氨基酸)位置的比對窗口中)具有至少85％的序列相同性，優(yōu)選至少90％到95％的序列相同性，更優(yōu)選至少99％的序列相同性，其中所述序列相同性百分比如下計算：將參比序列與可能包括總共占該參比序列20％或以下的刪除或添加的該序列通過比對窗口進(jìn)行比對。參比序列可以是較大序列的子集。

如本文所用，二十個常規(guī)的氨基酸以及它們的縮寫依照常規(guī)的方法使用。二十個常規(guī)氨基酸的立體異構(gòu)體(如D-氨基酸)，非天然氨基酸如α,α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其它非常規(guī)氨基酸也可以是本發(fā)明多肽的合適組分。非常規(guī)氨基酸的例子包括：4-羥基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N,N,N-三甲基賴氨酸、ε-N-乙?；嚢彼?、O-磷酸絲氨酸、N-乙?；z氨酸、N-甲?；琢虬彼帷?-甲基組氨酸、5-羥基賴氨酸、σ-N-甲基精氨酸與其他類似的氨基酸，及亞氨基酸(例如，4-羥基脯氨酸)。本文所使用的多肽表示法中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)用法及成規(guī)，左邊方向為氨基端方向，而右邊方向為羧基端方向。

類似的，除非另有說明，單鏈多核苷酸序列的左手端為5’端，雙鏈多核苷酸序列的左手端為5’方向。新生RNA轉(zhuǎn)錄物的5’到3’添加方向為轉(zhuǎn)錄方向，位于具有與RNA相同序列的DNA鏈上，且在RNA轉(zhuǎn)錄物的5'末端的5’側(cè)的序列區(qū)稱為“上游序列”；位于具有與RNA相同序列的DNA鏈上，且在RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3'末端的3’側(cè)的序列區(qū)稱為“下游序列”。

應(yīng)用于多肽時，術(shù)語“基本上相同”指當(dāng)最優(yōu)比對時(例如采用GAP或BESTFIT程序，并采用默認(rèn)的空隙加權(quán))兩條多肽序列具有至少80％的序列相同性，優(yōu)選至少90％的序列相同性，更優(yōu)選至少95％的序列相同性，最優(yōu)選至少99％的序列相同性。優(yōu)選地，不相同的殘基位置是保守的氨基酸取代導(dǎo)致的不同。

如本文所述，本發(fā)明也包括抗體或免疫球蛋白分子的氨基酸序列中的次要變化，前提是氨基酸序列中的該變化維持了與本文所述抗體或免疫球蛋白分子至少約75％，優(yōu)選至少80％、90％、95％，和最優(yōu)選約99％的序列相同性。尤其考慮的是保守性氨基酸的置換。

可容易地通過檢測多肽衍生物的比活性而確定氨基酸變化是否產(chǎn)生功能性肽。本文詳細(xì)描述了該檢測方法?？贵w或免疫球蛋白分子的片段或類似物可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易制備得到。片段或類似物的優(yōu)選氨基或羧基末端位于接近功能性結(jié)構(gòu)域的邊界處。可通過將核苷酸和/或氨基酸序列數(shù)據(jù)與公共或私人序列數(shù)據(jù)庫比對而鑒別出結(jié)構(gòu)性或功能性的結(jié)構(gòu)域。鑒別折疊成已知三維結(jié)構(gòu)的蛋白序列的方法是已知的。Bowie等，1991，Science，253：164。因此，前述實(shí)施例證明本領(lǐng)域技術(shù)人員能識別出可用來定義本文所述抗體的結(jié)構(gòu)性和功能性結(jié)構(gòu)域的序列基序和結(jié)構(gòu)構(gòu)象。

本發(fā)明的另一方面是含與序列1、附帶的序列表、本文所述抗體的VH結(jié)構(gòu)域或與序列1所示的HCDR(如HCDR1、HCDR2或HCDR3)具有至少約60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或約99％的氨基酸序列相同性的VH結(jié)構(gòu)域的靶向結(jié)合劑或抗體分子。所述靶向結(jié)合劑或抗體分子可任選地還含有與序列2、附帶的序列表、本文所述抗體的VL結(jié)構(gòu)域或與序列2的LCDR(如LCDR1、LCDR2或LCDR3)具有至少約60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或約99％的氨基酸序列相同性的VL結(jié)構(gòu)域。可用于計算兩條氨基酸序列的相同性百分比的算法包括，如BALST(Altschul等，1990，J.Mol.Biol.，215：405-410)，F(xiàn)ASTA(Pearson和Lipman，1988，PNAS USA，85：2444-2448)，或Smith-Waterman算法(Smith和Waterman，1981，J.Mol.Biol.，147：195-197)，使用例如默認(rèn)參數(shù)。在某些實(shí)施方案中，具有上述氨基酸序列相同性的所述靶向結(jié)合劑或抗體與參比的抗體具有基本上相同的活性。例如，所述基本上相同的活性包括至少一種與參比抗體活性的差異不超過約50％、40％、30％、20％、10％、5％、2％、1％或更低的活性。

抗原結(jié)合位點(diǎn)通常由免疫球蛋白的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)形成，其抗原結(jié)合界面由6個稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的表面多肽環(huán)形成。各VH和各VL中各含有框架區(qū)(FR)和3個CDR，分別為HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR1、LCDR2、LCDR3。

典型地，VH結(jié)構(gòu)域與VL結(jié)構(gòu)域配對，提供抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)，但單獨(dú)的VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域也可用于結(jié)合抗原。VH結(jié)構(gòu)域(如來自序列1)可與VL結(jié)構(gòu)域(如來自序列2)配對，這樣形成的抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)同時含有VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域。針對本文公開的其它VH和VL結(jié)構(gòu)域提供了類似的實(shí)施方案。在其它實(shí)施方案中，序列1中的VH鏈與異源VL結(jié)構(gòu)域配對。本領(lǐng)域已建立了輕鏈雜交。同樣地，本發(fā)明針對本文所述的其它VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域提供了類似的實(shí)施方案。因此，序列2上的任意抗體鏈或母本的VH可與序列1和2的任意抗體或其它抗體或母本上的VL配對。

抗原結(jié)合位點(diǎn)可含有一組來自序列1和2的任意抗體或母本抗體的HCDR和/或LCDR，在所公開的HCDR和/或LCDR組中具有至多20、16、10、9或更少(如1、2、3、4或5)個氨基酸添加、取代、缺失或插入。這些修飾可在該組CDR內(nèi)的任意殘基中進(jìn)行。

優(yōu)選的氨基酸取代包括那些：(1)降低蛋白質(zhì)水解易感性，(2)降低氧化易感性，(3)改變形成蛋白復(fù)合物的結(jié)合親和力，(4)改變結(jié)合親和力，和(4)賦予或改變這些類似物的生理化學(xué)或功能特性的取代。類似物可包括一序列除其天然產(chǎn)生的肽序列之外的各種突變蛋白。例如，可在天然產(chǎn)生的序列中(優(yōu)選在該多肽的形成分子間接觸的結(jié)構(gòu)域之外的部分)進(jìn)行單個或多個氨基酸取代(優(yōu)選是保守性氨基酸取代)。保守性氨基酸取代不應(yīng)實(shí)質(zhì)改變母本序列的結(jié)構(gòu)特征(如用來取代的氨基酸不應(yīng)破壞母本序列中產(chǎn)生的螺旋，或破壞其它類型的表征該母本序列的二級結(jié)構(gòu))。

本發(fā)明另一方面是含與序列1、所附序列表或本文所述的任意抗體的VH結(jié)構(gòu)域或與序列1所示的HCDR(如HCDR1、HCDR2或HCDR3)具有至少約60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或約99％的氨基酸序列相同性的VH結(jié)構(gòu)域的抗體分子。該抗體分子可任選地還包含與序列2、附帶的序列表或本文所述任一抗體的VL結(jié)構(gòu)域或與序列2的LCDR(如LCDR1、LCDR2或LCDR3)具有至少約60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或約99％的氨基酸序列相同性的VL結(jié)構(gòu)域?？捎糜谟嬎銉蓷l氨基酸序列的相同性百分比的算法包括，如BLAST、FASTA或Smith-Waterman算法。

本發(fā)明VH、VL結(jié)構(gòu)域以及CDR的變體，包括本文公開了其氨基酸序列的那些變體以及可用于人ENO1蛋白的靶向試劑和抗體的那些變體，可采用序列改變或突變并篩選具有所需的抗原靶向特性的方法獲得。所需特性的例子包括但不限于：對抗原的結(jié)合親和力相對于對該抗原具有特異性的已知抗體增加；對抗原活性的中和相對于對該抗原具有特異性的已知抗體(如其活性已知)增加；特定摩爾比時與已知抗體或配體對抗原有特異性競爭的能力；形成免疫沉淀復(fù)合物的能力；結(jié)合特定表位的能力；線性表位，如使用本文所述的肽結(jié)合掃描鑒定的肽序列，如使用在線性和/或受限構(gòu)象中篩選得到的肽；由不連續(xù)的殘基形成的構(gòu)象表位；調(diào)節(jié)人ENO1蛋白或其下游分子的新生物學(xué)活性的能力。本文也提供了這些方法。

本發(fā)明另一方面涉及一種靶向結(jié)合劑(即抗體)，其包括的氨基酸序列與含與人ENO1蛋白上的序列9或10所列的氨基酸序列具有至少約60％、70％、80％、85％、90％或約92％的氨基酸序列相同性的表位肽結(jié)合，并能用于治療人ENO1蛋白疾病或病癥。人ENO1蛋白相關(guān)疾病或病癥可以是由人ENO1蛋白的異?；罨虮磉_(dá)引起的任何病癥。在一個實(shí)施例中，人ENO1蛋白相關(guān)的疾病是腫瘤性疾病，如非小細(xì)胞肺癌，肝細(xì)胞(肝)癌，胃癌，乳腺癌，胰腺導(dǎo)管腺癌。

抗體的由VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域組成的抗原結(jié)合位點(diǎn)通常由多肽的6個環(huán)形成：其中三個來自輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域(VL)，另三個來自重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域(VH)。對具有已知原子結(jié)構(gòu)的抗體進(jìn)行的分析已闡明了抗體結(jié)合位點(diǎn)的序列與三維結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系。這些關(guān)系提示，除了VH結(jié)構(gòu)域的第三個區(qū)域(環(huán))外，結(jié)合位點(diǎn)的環(huán)具有少數(shù)主鏈構(gòu)象(即正則結(jié)構(gòu))中的一種。已知在特定環(huán)中形成的正則結(jié)構(gòu)由其大小以及在該環(huán)和框架區(qū)中的關(guān)鍵位置上都存在的某些殘基決定。

用于在CDR、抗體VH或VL結(jié)構(gòu)域和/或結(jié)合劑的氨基酸序列中進(jìn)行取代的技術(shù)一般可從現(xiàn)有技術(shù)中獲得?？芍苽渚哂锌深A(yù)期或不可預(yù)期會對活性具有最小或有益影響的取代的變體序列，并針對其結(jié)合能力和/或中和能力和/或任何其它所需特性進(jìn)行測試。如所討論的，可根據(jù)本發(fā)明使用本文已具體公開其序列的任意VH和VL結(jié)構(gòu)域的可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列的變體。

本文所用術(shù)語“多肽片段”指氨基末端和/或羧基末端刪除、且所保留的氨基酸序列與由例如全長cDNA序列推導(dǎo)得到的天然產(chǎn)生的序列的相應(yīng)位置相同的多肽。片段通常至少長約5、6、8或10個氨基酸，優(yōu)選至少長約14個氨基酸，更優(yōu)選至少長約20個氨基酸，通常至少長約50個氨基酸，更優(yōu)選至少長約70個氨基酸。本文所用術(shù)語“類似物”指含有至少約25個氨基酸的節(jié)段的多肽，該節(jié)段與推導(dǎo)的氨基酸序列的一部分基本上相同，并具有下述特性中的至少一種：(1)合適結(jié)合條件下特異性結(jié)合人ENO1蛋白，(2)具有阻斷合適配體/ENO1蛋白結(jié)合的能力，或(3)具有抑制ENO1蛋白活性的能力。通常，多肽類似物包含相對于天然產(chǎn)生序列的保守性氨基酸取代(或添加或刪除)。類似物通常長至少20個氨基酸，優(yōu)選至少50個氨基酸或更長，且通?？膳c全長的天然產(chǎn)生的多肽一樣長。

本文中，“靶向結(jié)合劑”是一種制劑，如抗體或其結(jié)合片段，該制劑優(yōu)先結(jié)合靶位點(diǎn)。在一個實(shí)施方案中，靶向結(jié)合劑僅對一個靶位點(diǎn)特異。在其它實(shí)施方案中，靶向結(jié)合劑對一個以上靶位點(diǎn)特異。在一個實(shí)施方案中，靶向結(jié)合劑可以是單克隆抗體，靶位點(diǎn)可以是表位。如下文所述，靶向結(jié)合劑可含有抗體的至少一個抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中，所述結(jié)構(gòu)域與異源蛋白融合，或含于異源蛋白中。

抗體可以是寡克隆抗體，多克隆抗體，單克隆抗體，嵌合抗體，CDR移植抗體，多特異性抗體，雙特異性抗體，催化性抗體，嵌合抗體，人源化抗體，完全人抗體，抗獨(dú)特型抗體和可被標(biāo)記呈可溶或結(jié)合形式的抗體，以及其片段、變體或衍生物，可單獨(dú)存在或與采用已知技術(shù)提供的其它氨基酸序列組合?？贵w可來自任何物種。術(shù)語抗體還包括本發(fā)明抗體的結(jié)合片段。示例性的片段包括Fv、Fab、Fab’、單鏈抗體(svFC)、二聚可變區(qū)(雙特異抗體，Diabody)和二硫鍵穩(wěn)定化可變區(qū)(dsFv)?？贵w的“結(jié)合片段”可以采用重組DNA技術(shù)制備，或者可通過對完整抗體實(shí)施酶法或化學(xué)切割而制備。結(jié)合片段包括Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv和單鏈抗體。

用木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個相同的抗原結(jié)合片段，也稱為“Fab”片段，和不具有抗原結(jié)合活性但能結(jié)晶的“Fc”片段。用胃蛋白酶消化抗體產(chǎn)生抗體分子的兩個臂保持連接并含有兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)的F(ab’)₂片段。F(ab’)₂片段能與抗原交聯(lián)。本文使用的“Fv”指抗體保留了抗原識別和抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小片段。本文所用“Fab”指含有輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域和重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的抗體片段。術(shù)語“mAb”指單克隆抗體。

術(shù)語“表位”包括能特異性結(jié)合免疫球蛋白或T細(xì)胞受體的任何蛋白決定簇。表位決定簇通常由具有化學(xué)活性表面基團(tuán)的分子如氨基酸或糖側(cè)鏈組成，且可能但不一定具有特異的三維結(jié)構(gòu)特征以及特異的電荷特征。當(dāng)抗體的解離常數(shù)≤1μM，優(yōu)選≤100nM，更優(yōu)選≤10nM時，可認(rèn)為該抗體特異性結(jié)合抗原。

當(dāng)指ENO1多肽時，“具活性”或“活性”指ENO1多肽的一部分具有天然ENO1多肽的生物學(xué)或免疫學(xué)活性。本文中，“生物學(xué)的”指產(chǎn)生自天然ENO1多肽的活性的生物學(xué)功能。優(yōu)選的ENO1生物學(xué)活性包括如ENO1誘導(dǎo)的血纖維蛋白溶酶原活性。

本文中，“哺乳動物”指任何被認(rèn)為是哺乳動物的動物。優(yōu)選的，哺乳動物是人。術(shù)語“對象”包括人和獸類對象。

本文所用術(shù)語“藥物制劑或藥劑”指當(dāng)正確給予患者時能產(chǎn)生所需治療效果的化學(xué)化合物或組合物。本文中的其它化學(xué)術(shù)語根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)用法使用，如McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(Parker,S.編，麥格勞-希爾教育出版集團(tuán)，舊金山，1985)。

本文中，“基本上純的”指標(biāo)的物為所存在的優(yōu)勢物，即以摩爾計，該標(biāo)的物比組合物中任何其它物質(zhì)的存在量高；優(yōu)選地，基本上純的組分是一組合物，該組合物中標(biāo)的物占所存在的所有大分子物質(zhì)的至少約50％(以摩爾計)。通常，基本上純的組合物將含有該組合物中存在的所有大分子物質(zhì)的約80％以上，優(yōu)選約85％、90％、95％和99％以上。最佳的，標(biāo)的物被純化到基本上均質(zhì)(采用常規(guī)檢測方法檢測組合物時檢測不到污染物)，其中該組合物基本上由單種大分子物質(zhì)組成。

本文中，術(shù)語“監(jiān)測”指通過測量癌細(xì)胞中ENO1蛋白的豐度而檢測和/或觀察癌癥發(fā)展的過程。

測量ENO1豐度的方法包括但不限于測量ENO1蛋白與ENO1特異性抗體之間的結(jié)合，Western印跡法，流式細(xì)胞術(shù)，免疫組化(IHC)，RT-PCR，和/或微陣列分析。

實(shí)施例

本發(fā)明的實(shí)施將使用細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、抗體技術(shù)和遺傳工程中的各種常規(guī)技術(shù)，這些都是本領(lǐng)域技術(shù)所熟知的。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有詳盡的解釋。

下述實(shí)施例闡述ENO1特異性抗體的開發(fā)和應(yīng)用，以通過誘導(dǎo)抗ENO1免疫反應(yīng)而抑制腫瘤生長。

實(shí)施例1

惡性腫瘤細(xì)胞中ENO1的細(xì)胞表面定位

為了分析ENO1在惡性腫瘤細(xì)胞上的細(xì)胞定位，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)，以確定ENO1在細(xì)胞表位上的定位。從17位肺癌患者的胸腔積液中獲得腫瘤細(xì)胞。其中，從2位癌癥患者獲得的腫瘤細(xì)胞NHRI-L89和CA926積液腫瘤細(xì)胞是本文所示的代表性案例。NHBE和SAEC細(xì)胞是正常的人肺原代細(xì)胞。完整全細(xì)胞用或未用ENO1抗血清染色，并經(jīng)由流式細(xì)胞術(shù)用ENO1蛋白的特異性抗體分析ENO1的表面分布(如圖1A所示)。經(jīng)由免疫組織學(xué)進(jìn)一步證實(shí)肺癌細(xì)胞系NHRI-L89的ENO1細(xì)胞定位(圖1B)。簡言之，在涂敷有纖連蛋白的腔室載玻片上在含10％FCS的DMEM中培養(yǎng)1×10⁴個NHRI-L89細(xì)胞。過夜培養(yǎng)后，用PBS沖洗載玻片，并用山羊血清封阻1小時。經(jīng)對照(CTL)和針對表面ENO1的ENO1抗體對NHRI-L89完整全細(xì)胞進(jìn)行染色，接著進(jìn)行PI染色以進(jìn)行核檢測。在共聚焦顯微鏡下觀察染色(400×，圖1B)。

此研究的結(jié)果顯示在圖1A(流式細(xì)胞術(shù))和1B(免疫染色)中。與與對照抗體孵育相比，NHRI-L89和CA926與ENO1抗體孵育的曲線向右移。正常人肺原代細(xì)胞NHBE和SAEC未顯示明顯偏移(圖1A)。此結(jié)果提示，ENO1蛋白在肺癌細(xì)胞上表達(dá)，而在正常原代細(xì)胞上不表達(dá)(圖1A)。當(dāng)采用免疫組織學(xué)進(jìn)一步分析ENO1的細(xì)胞定位時，經(jīng)ENO1抗體染色的NHRI-L89細(xì)胞在細(xì)胞表面上顯示出信號(圖1B)。此結(jié)果表明，ENO1在肺癌和一些癌癥細(xì)胞表面上表達(dá)，因此，可用作免疫治療的潛力靶標(biāo)。

實(shí)施例2

抗ENO1抗體抑制人肺癌細(xì)胞的侵襲能力

為了研究ENO1抗體對肺癌細(xì)胞侵襲的影響，通過將ENO1抗體添加到生長在包涂有胞外基質(zhì)(基質(zhì)膠Matrigel，貝克頓-迪金森公司)的微孔過濾器(貝克頓-迪金森公司，富蘭克林湖，紐約州)上的CL1-5細(xì)胞經(jīng)由細(xì)胞遷移侵襲試驗(Transwell assay)評估CL1-5細(xì)胞的侵襲活性。在分別與1：20、1：100和1：500稀釋倍數(shù)的抗ENO1多克隆抗體混合后，將2×10⁴個CL1-5細(xì)胞接種到兩室分析系統(tǒng)中具有含2％FBS的培養(yǎng)基的上層腔室中，培育24小時，其中下層腔室內(nèi)具有含10％FBS的培養(yǎng)基。使用抗GST小鼠多克隆抗體作為陰性對照組。兩個室經(jīng)包涂基質(zhì)膠Matrigel的微孔過濾器(孔徑為12微米)隔開。培養(yǎng)期后，將基質(zhì)膠包涂過濾器染色，并在顯微鏡下計算侵入該基質(zhì)膠包涂的過濾器的細(xì)胞數(shù)量。重復(fù)此研究三次。數(shù)據(jù)以平均值±SD提供。本測試用于比較各組之間的活性。P值<0.05時被認(rèn)為是統(tǒng)計學(xué)顯著。

結(jié)果顯示在圖2中。在未處理組(160±8；N＝3)和抗GST多克隆處理組(168±12；N＝3)之間未發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞數(shù)量差異。但是，當(dāng)給予CL1-5細(xì)胞不同稀釋度的ENO1多克隆抗體時，CL1-5的細(xì)胞數(shù)量減少，從1：20稀釋度的52±12(N＝3)到1：500稀釋度的156±30(N＝3)；減少與ENO1多克隆抗體的濃度成比例。1：20稀釋度的ENO1多克隆抗體組和1：20稀釋度的抗GST多克隆抗體組之間的細(xì)胞數(shù)量存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。這些結(jié)果表明，給予CL1-5癌細(xì)胞ENO1抗體能體外抑制該細(xì)胞的侵襲活性。

實(shí)施例3

ENO1多克隆抗體減弱肺中CL1-5F4細(xì)胞的組織侵襲能力。

為了研究給予ENO1抗體對肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響，并評估癌癥治療中抗ENO1抗體的潛力，將帶有熒光素酶報道基因的高度侵襲性CL1-5F4細(xì)胞靜脈內(nèi)注射到NOD-SCID小鼠中(1×10⁶個細(xì)胞/小鼠)，同時給予ENO1抗體或?qū)φ?CTL)抗血清，每周兩次。腫瘤注射后第12天和第19天，使用IVIS系統(tǒng)監(jiān)測肺轉(zhuǎn)移性集落的形成。使用注射了ENO1基因敲除的CL1-5F4細(xì)胞的小鼠作為陰性對照。第12和19天殺死小鼠后，觀察轉(zhuǎn)移性集落和腫瘤大小，并計數(shù)。

結(jié)果如圖3所示。當(dāng)給予攜帶具有熒光素酶報道基因的CL1-5F4細(xì)胞的小鼠對照抗體時，小鼠的肺在第12天開始顯示出熒光信號。另一方面，經(jīng)ENO1多克隆抗體處理的小鼠或攜帶敲除了ENO1基因的CL1-5F4細(xì)胞的小鼠中未檢測到信號。第19天，經(jīng)對照抗體處理的小鼠中的信號變得更強(qiáng)，表明存在更多的細(xì)胞侵襲或腫瘤生長。同一天，經(jīng)ENO1多克隆抗體處理的小鼠或攜帶敲除了ENO1基因的CL1-5F4細(xì)胞的小鼠中仍未檢測到信號。這些結(jié)果表明CL1-5F4細(xì)胞的轉(zhuǎn)移受到ENO1抗體或ENO1基因敲除的阻抑(圖3，上圖)。12天和19天后，獲取各處理組的肺，測定腫瘤結(jié)節(jié)。結(jié)果顯示在圖3的底圖中。對照抗體處理組的小鼠中有不少的腫瘤結(jié)節(jié)，并具有清晰的腫瘤尺寸。但ENO1多克隆抗體處理的小鼠或攜帶具有ENO1敲除的CL1-5F4的小鼠無清晰的腫瘤結(jié)節(jié)，表明這兩組小鼠中腫瘤轉(zhuǎn)移被延遲。本研究的結(jié)果表明，體內(nèi)給予ENO1抗體對癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移或增殖具有抑制效果，ENO1抗體在癌癥治療中具有潛在的應(yīng)用。

實(shí)施例4

抗人ENO1單克隆抗體的生產(chǎn)

從實(shí)施例2和3可知，ENO1抗體能減弱癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，ENO1抗體可潛在地開發(fā)成治療性抗體。為了產(chǎn)生針對人ENO1的單克隆抗體，用純化的重組人ENO1抗原免疫BALB/c小鼠(50μg/小鼠)，接著用乳化的CpG佐劑強(qiáng)化ENO1體液應(yīng)答。收集脾細(xì)胞，使其與Fo細(xì)胞融合，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的方案稀釋。采用基于抗原的ELISA篩選出分泌識別ENO1抗原的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。然后如實(shí)施例1所述進(jìn)行完整全細(xì)胞染色，經(jīng)流式細(xì)胞分析檢測抗體對CL1-5F4肺腺癌細(xì)胞上的細(xì)胞表面ENO1的結(jié)合活性，從而核實(shí)所選的克隆。

結(jié)果顯示在圖4中。如曲線向右偏移所證明的，與對照抗體相比，分離所得的所有5種抗體克隆都識別CL1-5F4上的細(xì)胞表面ENO1。

實(shí)施例5

分離的5種抗體克隆的ENO1結(jié)合ELISA

為了研究上述分離得到的5種抗體克隆的ENO1結(jié)合親和力，使單個雜交瘤在含10％FCS的RPMI中生長。培養(yǎng)1周后，收集1×10⁶個細(xì)胞，用PBS洗滌，在200微升RPMI培養(yǎng)基中重懸浮，然后經(jīng)由IP注射注入SCID小鼠。3周后，收集小鼠腹水并稀釋到15毫升。用40％硫酸銨沉淀和蛋白A柱(Montage抗體純化試劑盒，密理博公司)進(jìn)一步純化抗體。用Amico Ultra-15離心過濾設(shè)備依照制造商(密理博公司)提供的方案進(jìn)一步濃縮純化的抗體。用SDS PAGE分析抗體的純度。將人ENO1蛋白(400ng)包涂在96孔ELISA板上，用PBS洗滌該板兩次。將每種抗體從1×10^-11到1×10^-7M的系列稀釋物加到該板上，然后將該板置于37℃孵育1小時。加入與HPRT偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG，孵育1小時后，加入TMB。讀取OD405，計算活性。每個研究重復(fù)三次，數(shù)據(jù)以平均值±SD表示。使用Sigmaplot^TM將OD讀數(shù)和抗體濃度制作多重分散曲線。由四個參數(shù)的邏輯擬合預(yù)測各克隆的K_d值。

此實(shí)驗的結(jié)果顯示在圖5中。所有抗體雜交瘤的產(chǎn)量是20.4mg-4.6mg/小鼠?？贵w的K_d值為1.77×10^-10±0.12到1.6×10^-5±0.2M(N＝3)。這些結(jié)果表明這5個抗體克隆識別人ENO1蛋白，且克隆10具有最佳的親和力，其Kd值為約1.77×10^-10±0.12M(N＝3)。

實(shí)施例6

所分離的5種抗體克隆的血纖維蛋白溶酶原受體拮抗活性

為了研究分離的抗人ENO1抗體的ENO1拮抗活性，使U937人淋巴瘤細(xì)胞系在含10％FCS的RPMI中生長。用10微克/毫升的LPS處理細(xì)胞6小時，以誘導(dǎo)ENO1蛋白在細(xì)胞表面表達(dá)。分別用1微克/毫升的人Lys-血纖維蛋白溶酶原和10微克/毫升的不同抗ENO1抗體克隆預(yù)孵育PBS中的細(xì)胞(1.5×10⁶個細(xì)胞/毫升)1小時。用PBS洗滌樣品2次，然后加入3nM的組織特異性血纖維蛋白溶酶原激活劑和0.5mM的生色底物S-2251。在37℃孵育1小時后，讀取OD405，計算活性。各研究重復(fù)三次，分析拮抗活性。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示。采用T-檢驗比較各組之間的活性。P值<0.05被視為統(tǒng)計學(xué)顯著。

本研究的結(jié)果顯示在圖6中。所有5種抗體克隆具有血纖維蛋白溶酶原受體拮抗活性，其抑制的LPS誘導(dǎo)的ENO1比活性達(dá)52％到100％。這些研究表明，血纖維蛋白溶酶原受體拮抗活性與各克隆的K_d值成比例，克隆10具有最佳的抑制活性，對LPS誘導(dǎo)的ENO1比活性的抑制接近100％。

實(shí)施例7

ENO1單克隆抗體抑制人肺癌細(xì)胞的侵襲能力

使用細(xì)胞遷移侵襲試驗(Transwell assay)評估各抗體克隆對CL1-5細(xì)胞侵襲能力的抑制，該試驗使用包涂有胞外基質(zhì)(基質(zhì)膠Matrigel，貝克頓-迪金森公司)的微孔過濾器(貝克頓-迪金森公司，富蘭克林湖，紐約州)。分別與5種抗體克隆中的任一種(10微克/毫升)混合后，將2×10⁴個細(xì)胞接種到兩室分析系統(tǒng)中的上層腔室中培養(yǎng)24小時，其中下層腔室內(nèi)具有含10％FBS的培養(yǎng)基?？剐∈驣gG和5-疊氮-2-脫氧胞苷(5ADC)分別用作陰性對照和陽性對照。兩個室經(jīng)包涂基質(zhì)膠Matrigel的微孔過濾器(孔徑為12微米)隔開。培養(yǎng)期后，將基質(zhì)膠包涂過濾器染色，并在顯微鏡下計算侵入該基質(zhì)膠包涂的過濾器的細(xì)胞數(shù)量。重復(fù)此研究三次。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示。采用T-檢驗比較各組之間的活性。P值<0.05時被認(rèn)為是統(tǒng)計學(xué)顯著。

由這些實(shí)驗得到的結(jié)果顯示在圖7中。這些結(jié)果顯示，所有抗人ENO1抗體克隆具有抑制CL1-5的侵襲能力的活性，克隆10具有最佳的抑制活性，約為對照IgG組的65.5±0.3％(N＝3)。

結(jié)合實(shí)施例5、6和7的結(jié)果，選用抗人ENO1抗體克隆10進(jìn)行進(jìn)一步的開發(fā)，并在本說明書中稱為EN10mAb。

實(shí)施例8

EN10mAb抑制人肺癌細(xì)胞和淋巴瘤細(xì)胞的侵襲能力

使用細(xì)胞遷移侵襲試驗(Transwell assay)評估EN10mAb對CL1-5細(xì)胞侵襲能力的抑制，該試驗使用包涂有胞外基質(zhì)(基質(zhì)膠Matrigel，貝克頓-迪金森公司)的微孔過濾器(貝克頓-迪金森公司，富蘭克林湖，紐約州)。分別與10、50和100微克/毫升的EN10mAb混合后，將2×10⁴個細(xì)胞接種到兩室分析系統(tǒng)具有含2％FBS的培養(yǎng)基的上層腔室中，培養(yǎng)24小時，其中下層腔室內(nèi)具有含10％FBS的培養(yǎng)基。抗小鼠IgG用作陰性對照。兩個室經(jīng)包涂基質(zhì)膠Matrigel的微孔過濾器(孔徑為12微米)隔開。培養(yǎng)期后，將基質(zhì)膠包涂過濾器染色，并在顯微鏡下計算侵入該基質(zhì)膠包涂的過濾器的細(xì)胞數(shù)量。重復(fù)此研究三次。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示。采用T-檢驗比較各組之間的活性。P值<0.05時被認(rèn)為是統(tǒng)計學(xué)顯著。結(jié)果顯示在圖8A中。

類似的，使用細(xì)胞遷移侵襲試驗(Transwell assay)評估EN10mAb對U937細(xì)胞侵襲能力的抑制，該試驗使用包涂有胞外基質(zhì)(基質(zhì)膠Matrigel，貝克頓-迪金森公司)的微孔過濾器(貝克頓-迪金森公司，富蘭克林湖，紐約州)。使人淋巴瘤U937細(xì)胞在含10％FCS的RPMI中生長。細(xì)胞用10微克/毫升的LPS處理6小時，以誘導(dǎo)ENO1蛋白在細(xì)胞表面上表達(dá)。分別與10、50和100微克/毫升的EN10mAb混合后，將2×10⁴個細(xì)胞接種到兩室分析系統(tǒng)的上層腔室中，培養(yǎng)24小時，其中下層腔室內(nèi)具有含10％FBS和10nM MCP-1的培養(yǎng)基?？剐∈驣gG用作陰性對照。兩個室經(jīng)包涂基質(zhì)膠Matrigel的微孔過濾器(孔徑為8微米)隔開。培養(yǎng)期后，在顯微鏡下使用血球計計算下層腔室內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量。重復(fù)各研究三次。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示。采用T-檢驗比較各組之間的活性。P值<0.05時被認(rèn)為是統(tǒng)計學(xué)顯著。

結(jié)果顯示在圖8A和8B中。當(dāng)以10微克/毫升到100微克/毫升的濃度給予細(xì)胞EN10mAb時，其將CL1-5的侵襲活性抑制至對照IgG的31±2到77±1％(N＝3)(圖8A)。這些結(jié)果與實(shí)施例4的結(jié)果類似，且抑制與EN10mAb的濃度成比例，EC₅₀估算約為30微克/毫升。

為了研究該對侵襲的抑制是否適用于其它癌細(xì)胞，以類似的方式用5微克/毫升到50微克/毫升的EN10mAb處理U937細(xì)胞。U937的侵襲活性被抑制至對照IgG的91.2±2到49.1±1％(N＝3)(圖8B)。這些結(jié)果表明，CL1-5和U937的侵襲活性被EN10mAb以劑量依賴性的方式抑制，可能是經(jīng)由抑制ENO1的血纖維蛋白溶酶原受體活性而實(shí)現(xiàn)。

實(shí)施例9

EN10mAb識別淋巴瘤細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的表面ENO1

使人淋巴瘤U937細(xì)胞系在含10％FCS的RPMI中生長。用1微克/毫升的LPS處理細(xì)胞6小時，以誘導(dǎo)ENO1蛋白在細(xì)胞表面表達(dá)。對于流式細(xì)胞術(shù)分析，用或不用EN10mAb(1：300的稀釋度)染色完整的全細(xì)胞，用FITC-偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG(杰克遜實(shí)驗室)使其呈色，并用FACScan流式細(xì)胞儀(貝克頓-迪金森公司)分析。由所得熒光強(qiáng)度計算ENO1表達(dá)。

從這些實(shí)驗獲得的結(jié)果顯示在圖9中。與未經(jīng)LPS處理但用EN10mAb處理的細(xì)胞相比，將U937與LPS孵育并用EN10mAb處理使曲線向右偏移，表明U937細(xì)胞在其細(xì)胞表面上表達(dá)ENO1。這些數(shù)據(jù)支持EN10mAb識別淋巴瘤細(xì)胞上表面LPS誘導(dǎo)的ENO1。

實(shí)施例10

EN10mAb抑制CL-5細(xì)胞從膠原蛋白和纖連蛋白中脫離

為了評估ENO1血纖維蛋白溶酶原受體-血纖維蛋白溶酶胞外底物之間的信號傳導(dǎo)通路，分別用1mg/ml的凝膠、100微克/毫升的血纖蛋白原、10微克/毫升的膠原蛋白和10微克/毫升的纖連蛋白過夜包涂未處理ELISA平板。將CL1-5細(xì)胞(4×10⁴個細(xì)胞)接種到該平板上，將50微克/毫升的EN10mAb加到200μL含10％FCS的DMEM中。37℃孵育細(xì)胞24小時，然后用PBS洗滌2次。加入10％WST，37℃孵育反應(yīng)混合物4小時。經(jīng)由OD450讀數(shù)估算平板中相對細(xì)胞數(shù)量。各研究重復(fù)3次。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示。采用T-檢驗比較各組之間的活性。P值<0.05時被認(rèn)為是統(tǒng)計學(xué)顯著。

這些實(shí)驗的結(jié)果顯示在圖10A中。這些數(shù)據(jù)顯示，纖連蛋白和膠原蛋白包涂的平板的OD450讀數(shù)分別是2.45±0.37(N＝3)和1.83±0.44(N＝3)。這些讀數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于凝膠和血纖蛋白原平板的讀數(shù)，后兩者與背景讀數(shù)無明顯區(qū)別。EN10mAb處理組和未處理組之間無統(tǒng)計學(xué)差異。這些結(jié)果表明CL1-5細(xì)胞喜好結(jié)合纖連蛋白和膠原蛋白，當(dāng)細(xì)胞在不含有下游蛋白酶(如血纖維蛋白溶酶原和tPA)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時EN10mAb不參與到細(xì)胞脫離通路。圖10A的數(shù)據(jù)提示，ENO1血纖維蛋白溶酶原受體活性未參與到胞外基質(zhì)中的細(xì)胞脫離通路。

我們進(jìn)一步測試ENO1是否參與到胞外基質(zhì)中的細(xì)胞脫離通路。分別用1微克/毫升的纖連蛋白和10微克/毫升的膠原蛋白過夜包涂未處理ELISA平板。將CL1-5細(xì)胞(4×10⁴個細(xì)胞)接種到該平板上，分別將0、6.25、12.5、25和50微克/毫升的EN10mAb加到200微升含10％FCS的DMEM中。此外，加入10微克/毫升的Glu-血纖維蛋白溶酶原和2nM的tPA。37℃培養(yǎng)細(xì)胞24小時，用PBS洗滌2次。然后加入10％WST，37℃孵育反應(yīng)混合物4小時。經(jīng)由OD450讀數(shù)估算平板中相對細(xì)胞數(shù)量。各研究重復(fù)3次。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示。采用T-檢驗比較各組之間的活性。P值<0.05時被認(rèn)為是統(tǒng)計學(xué)顯著。

這些實(shí)驗的結(jié)果顯示在圖10B和10C中。這些數(shù)據(jù)表明，當(dāng)培養(yǎng)基含有ENO1受體下游蛋白酶血纖維蛋白溶酶原和tPA時，細(xì)胞數(shù)量直接與兩種胞外基質(zhì)中處理的EN10mAb的濃度成比例。兩種胞外基質(zhì)中，50微克EN10mAb處理組和對照IgG組之間存在明顯差異(P<0.05)。這些結(jié)果表明，ENO1可能通過提高血纖維蛋白酶和tPA的蛋白酶活性而參與了CL1-5細(xì)胞從胞外基質(zhì)的脫離。作為ENO1拮抗劑的EN10mAb阻斷了ENO1的受體活性，導(dǎo)致血纖維蛋白溶酶和tPA活化被抑制，從而抑制CL1-5細(xì)胞從胞外基質(zhì)的脫離活性和侵襲。

實(shí)施例11

編碼單克隆抗體的基因的制備

根據(jù)下文所述方法克隆編碼抗體EN10mAb的基因。

(1)抗體基因的cDNA克隆及制備

在含10％FCS的RPMI培養(yǎng)基(吉科(Gibco)制造)中培養(yǎng)雜交瘤。細(xì)胞數(shù)量達(dá)約10×10⁶個/毫升后，離心收集細(xì)胞，然后加入(英杰公司(Invitrogen)制備)，并根據(jù)指導(dǎo)手冊抽提總RNA。使用小鼠Ig-引物組(諾維根公司(Novagen)制造)并根據(jù)所附指導(dǎo)手冊進(jìn)行抗體可變區(qū)cDNA的克隆。

(a)根據(jù)III第一鏈合成系統(tǒng)(英杰公司制造)的指導(dǎo)手冊進(jìn)行第1鏈cDNA的合成。

使用5微克總RNA作為模板制備第1鏈cDNA。在200微升的PCR管中混合5微克總雜交瘤RNA，1微升濃度為50ng/微升的隨機(jī)引物，以及1微升濃度為10mM的dNTP，加入DEPC處理的水至10微升。65℃孵育反應(yīng)混合物5分鐘，然后置于冰上至少1分鐘。加入10微升的cDNA合成混合物，其含2微升10×RT緩沖液、4微升25mM的MgCl2、2微升DTT、1微升4單位的RNA酶(OUT^TM)以及1微升200單位III RT，溫和地攪拌，粗離心收集。反應(yīng)管在25℃孵育10分鐘，接著在50℃孵育50分鐘。85℃終止反應(yīng)5分鐘，冰上冷卻。粗離心該管，收集反應(yīng)物，加入1微升RNA酶H，37℃孵育20分鐘。

(b)采用PCR擴(kuò)增重鏈基因和輕鏈基因

制備含5微升cDNA、5微升10×反應(yīng)緩沖液、1微升濃度為10mM的dNTP混合物、1微升2.5單位的Taq聚合酶、及由引物組所提供的1微升正向引物1與1微升反向引物2的反應(yīng)溶液，以二次蒸餾水使其最終體積為50微升，將其進(jìn)行PCR反應(yīng)。

為了擴(kuò)增抗體的輕鏈和重鏈，進(jìn)行一輪94℃、10分鐘的反應(yīng)，然后進(jìn)行94℃、1分鐘，52℃、1分鐘和72℃、1分鐘的反應(yīng)，重復(fù)35輪，最后72℃孵育10分鐘。將反應(yīng)溶液進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳，分析反應(yīng)產(chǎn)物。根據(jù)所附指導(dǎo)手冊，將具有正確分子量的產(chǎn)物(重鏈約為463bp，輕鏈約為451bp)連接到pCR 2.1-TOPO載體(英杰公司制造)，進(jìn)行亞克隆。然后使用M13正向引物(5'-GTAAACAAC GACGGCGAG-3'，SEQ ID NO:11)和M13反向引物(5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'，SEQ ID NO:12)測定核苷酸序列。采用ExPASY-翻譯工具基于序列信息將抗體序列翻譯成蛋白質(zhì)序列。所得的EN10mAb序列含有具有互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的輕鏈序列和重鏈氨基酸序列，其根據(jù)Kabat等公開的方法(《免疫學(xué)感興趣的蛋白的序列》，第5版，NIH出版91-3242，貝塞斯達(dá)，馬里蘭，1991，第1－3卷)測定。

圖11A描述了EN10mAb重鏈可變區(qū)氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。其中標(biāo)出了框架區(qū)(FR1、FR2、FR3和FR4)和CDR(HCDR1(SEQ ID NO:3)，HCDR2(SEQ ID NO:4)和HCDR3(SEQ ID NO:5))。

圖11B描述了EN10mAb輕鏈可變區(qū)氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。其中標(biāo)出了框架區(qū)(FR1、FR2、FR3和FR4)和CDR(LCDR1(SEQ ID NO:6)，LCDR2(SEQ ID NO:7)和LCDR3(SEQ ID NO:8))。

實(shí)施例12：表位作圖

抗體表位作圖

為測定EN10Mab針對人ENO1蛋白的表位，設(shè)計兩條正向引物，其核苷酸序列為5’-GGATCCGCAGCAAACTTCAGGGAAGCCATG-3’(SEQ ID NO:13)和5’-GGATCCTCGAAGATCCCTTTGACCAGGATG-3’(SEQ ID NO:14)，和反向引物(5’-TCAGGCTGAAAATCTCTCATCCGC-3，SEQ ID NO:15)。使用含人ENO1cDNA基因的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pTRC-HIS ENO1作為模板擴(kuò)增ENO1缺失突變體。使用SEQ ID NO:13和14作為正向引物，使用SEQ ID NO:15作為反向引物，分別擴(kuò)增缺失突變體Δ1-189(圖12A)和Δ1-297(圖12A)。使用其它組引物(序列為5’-GGATCCTATCTATTCTCAAGATCCATGCC-3’，SEQ ID NO:16，和’-CTCGAGGTCATGGTGTCTCATCGTTCGCTCGAG-3’，SEQ ID NO:17)擴(kuò)增缺失突變體Δ297-434。對于各突變體的擴(kuò)增，制備含1微升1：1000稀釋度的模板DNA(約0.1ng)、5微升10×反應(yīng)緩沖液、1微升10mM dNTP混合物、1微升2.5單位的Taq聚合酶、1微升正向引物和1微升反向引物的反應(yīng)溶液，并用二次蒸餾的水使其最終體積為50微升，進(jìn)行PCR。進(jìn)行一輪94℃、10分鐘的反應(yīng)，然后進(jìn)行94℃、1分鐘，52℃、1分鐘和72℃、1分鐘的反應(yīng)，重復(fù)35輪，最后72℃孵育10分鐘。將反應(yīng)溶液進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳，分析反應(yīng)產(chǎn)物。根據(jù)所附指導(dǎo)手冊，將具有正確分子量的反應(yīng)產(chǎn)物連接到pCR2.1-TOPO載體(英杰公司制造)，進(jìn)行亞克隆。使用M13正向引物(5'-GTAAACAACGACGGCGAG-3'，SEQ ID NO:11)和M13反向引物(5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'，SEQ ID NO:12)測定核苷酸序列。使用限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI消化具有正確序列的每個突變克隆，將消化產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳。從瓊脂糖凝膠切下各突變體的插入片段，使用Gene Clean試劑盒，根據(jù)所附的制造商(BIO101)提供的指導(dǎo)手冊純化。將各突變體的BamHI和XhoI DNA片段連接到大腸桿菌表達(dá)載體pTRC His A(英杰公司)的BamHI和XhoI位點(diǎn)。將所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21Rosseta中。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)使ENO1突變蛋白在大腸桿菌中表達(dá)，超聲處理細(xì)菌沉淀物后，根據(jù)制造商(恰根)提供的附帶指導(dǎo)手冊采用Ni-瓊脂糖進(jìn)行純化。采用12％SDS PAGE分析各突變體的純度。為了測定各突變蛋白的結(jié)合活性，將400ng的人ENO1蛋白包被到96孔ELISA板上，用PBS洗滌該板。將10微克EN10mAb加到該板上，在37℃孵育1小時。用PBS洗滌結(jié)合復(fù)合物2次后，加入偶聯(lián)HPRT的山羊抗小鼠IgG。孵育1小時后，加入TMB。根據(jù)OD405的讀數(shù)測定結(jié)合親和力。各研究重復(fù)3次。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示。采用T-檢驗比較各組之間的活性。P值<0.05時被認(rèn)為是統(tǒng)計學(xué)顯著。

結(jié)果顯示在圖12A中。ENO1突變體Δ1-189和Δ1-297的OD405讀數(shù)約為1.43±0.18和1.56±0.08(N＝3)(在圖12A中顯示為1.43和1.56)，分別約為野生型ENO1(2.87±0.08，N＝3)的42％和39％。但是，當(dāng)刪除氨基酸殘基297到434時，與BSA背景相比，此突變的ENO1對EN10mAb的結(jié)合活性喪失。這些結(jié)果表明氨基酸殘基297到434是ENO1蛋白結(jié)合EN10mAb所需，突變體Δ1-182和Δ1-297結(jié)合活性的下降可能是這些突變蛋白的不穩(wěn)定或構(gòu)象變化所致。

為了進(jìn)一步研究ENO1蛋白中EN10mAb的表位，設(shè)計5條反向引物，分別具有以下序列：5’-CTCGAGAGGGATCTTCGATAGACACCACTGGG-3’(SEQ ID NO:18)，5’-CTCGAGCTACCTGGATTCCTGCACTGGCTG-3’(SEQ ID NO:19)，5’-CTCGAGACTTCTCGTTCACGGCCTTGGCGATC-3’(SEQ ID NO:20)，5’-CTCGAGACTTCTCGTTCACGGCCTTGGCGATCC-3’(SEQ ID NO:21)，5’-CTCGAGCAGTCTCCCCCGAACGATGAGACACC-3’(SEQ ID NO:22)和5’-CTCGAG CACCAGTCTTGATCTGCCCAGTGCAC-3’(SEQ ID NO:23)。使用含人ENO1cDNA基因的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pTRC-HIS ENO1作為模板擴(kuò)增ENO1缺失突變體。SEQ ID NO:16用作正向引物，分別與引物SEQ ID NO:18、SEQ ID：19、SEQ ID：20、SEQ ID：21、SEQ ID：22、SEQ ID：23擴(kuò)增缺失突變體296-434、316-434、336-434、376-434和396-434。對于各突變體的擴(kuò)增，制備含1微升1：1000稀釋度的模板DNA(約0.1ng)、5微升10×反應(yīng)緩沖液、1微升10mM dNTP混合物、1微升2.5單位的Taq聚合酶、1微升正向引物和1微升反向引物的反應(yīng)溶液，并用二次蒸餾的水使其最終體積為50微升，進(jìn)行PCR。進(jìn)行一輪94℃、10分鐘的反應(yīng)，然后進(jìn)行94℃、1分鐘，52℃、1分鐘和72℃、1分鐘的反應(yīng)，重復(fù)35輪，最后72℃孵育10分鐘。將反應(yīng)溶液進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳，分析反應(yīng)產(chǎn)物。根據(jù)所附指導(dǎo)手冊，將具有正確分子量的反應(yīng)產(chǎn)物連接到pCR 2.1-TOPO載體(英杰公司制造)，進(jìn)行亞克隆。使用M13正向引物(5'-GTAAACAACGACGGCGAG-3'，SEQ ID NO:11)和M13反向引物(5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'，SEQ ID NO:12)測定核苷酸序列。使用限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI消化具有正確序列的每個突變克隆，將消化產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳。從瓊脂糖凝膠切下各突變體的DNA片段，使用Gene Clean試劑盒，根據(jù)所附的制造商(BIO101)提供的指導(dǎo)手冊純化。將各突變體的BamHI和XhoI DNA片段連接到大腸桿菌表達(dá)載體pTRC His A(英杰公司)的BamHI和XhoI位點(diǎn)。將所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21Rosseta中。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)使ENO1突變蛋白在大腸桿菌中表達(dá)，超聲處理細(xì)菌沉淀物后，根據(jù)制造商(恰根)提供的附帶指導(dǎo)手冊采用Ni-瓊脂糖進(jìn)行純化。采用12％SDS PAGE分析各突變體的純度。為了測定各突變蛋白的結(jié)合活性，將400ng的人ENO1蛋白或突變蛋白包被到96孔ELISA板上，用PBS洗滌該板。將10微克EN10mAb加到該板上，在37℃孵育1小時。用PBS洗滌結(jié)合復(fù)合物2次后，加入偶聯(lián)HPRT的山羊抗小鼠IgG。孵育1小時后，加入TMB。根據(jù)OD405讀數(shù)測定結(jié)合親和力。各研究重復(fù)3次。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示。采用T-檢驗比較各組之間的活性。P值<0.05時被認(rèn)為是統(tǒng)計學(xué)顯著。

各突變體和野生型蛋白的12％SDS PAGE顯示在圖12B中。各突變體的分子量從突變體296-343增加到野生型。此結(jié)果表明我們可從各突變體獲得完整蛋白，即便發(fā)現(xiàn)突變體336-434和376-434有一些降解。如圖12C所示，EN10mAb對野生型ENO1的結(jié)合親和力與對突變體336-434、376-434和369-343的結(jié)合親和力之間無顯著差異。但是，當(dāng)缺失氨基酸殘基296-316和317-336時，與大腸桿菌細(xì)胞裂解物背景相比，這兩種ENO1突變體的EN10mAb結(jié)合活性喪失。這些結(jié)果表明，氨基酸殘基296-336(FDQDDWGAWQKFTASAGIQVVGDDLTVTNPKRIAKAVNEKS，SEQ ID NO:49)對ENO1蛋白與EN10mAb的結(jié)合起重要作用。

實(shí)施例13：丙氨酸掃描

為了進(jìn)一步研究人ENO1的殘基296到336中哪些殘基對EN10mAb結(jié)合而言起重要作用，從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(pdb登陸號：2PSN)下載ENO1的晶體結(jié)構(gòu)。經(jīng)結(jié)構(gòu)分析后，預(yù)測氨基酸殘基D300、W301、G302、Q305、K306、A309、K326、K330、N333、E334和K335暴露在蛋白表面，作為突變的候選位點(diǎn)，用于分析它們是否確實(shí)對EN10mAb結(jié)合起重要作用。使用QuickChange II定點(diǎn)突變試劑盒，根據(jù)制造商(安捷倫科技有限公色)提供的附帶指導(dǎo)手冊，將這11個殘基中的10個突變?yōu)楸彼?，A309被突變成甘氨酸。由基因組學(xué)生物科技有限公司產(chǎn)生下述用于丙氨酸掃描的突變寡核苷酸(表1)。

表1：寡序列

5’-GATCCCTTTGACCAGGATGCCTGGGGAGCTTGGCAG-3’(SEQ ID NO:24)

5’-CTGCCAAGCTCCCCAGGCATCCTGGTCAAAGGGATC-3’(SEQ ID NO:25)

5’-CCCTTTGACCAGGATGACGCGGGAGCTTGGCAGAAG-3’(SEQ ID NO:26)

5’-CTTCTGCCAAGCTCCCGCGTCATCCTGGTCAAAGGG-3’(SEQ ID NO:27)

5’-CTTTGACCAGGATGACTGGGCAGCTTGGCAGAAGTTC-3’(SEQ ID NO:28)

5’-GAACTTCTGCCAAGCTGCCCAGTCATCCTGGTCAAAG-3’(SEQ ID NO:29)

5’-GACTGGGGAGCTTGGGCGAAGTTCACAGCCAGTGCA-3’(SEQ ID NO:30)

5’-TGCACTGGCTGTGAACTTCGCCCAAGCTCCCCAGTC-3’(SEQ ID NO:31)

5’-GGGGAGCTTGGCAGGCGTTCACAGCCAGTGCAGG-3’(SEQ ID NO:32)

5’-CCTGCACTGGCTGTGAACGCCTGCCAAGCTCCCC-3’(SEQ ID NO:33)

5’-GGCAGAAGTTCACAGGCAGTGCAGGAATCCAGGTAG-3’(SEQ ID NO:34)

5’-CTACCTGGATTCCTGCACTGCCTGTGAACTTCTGCC-3’(SEQ ID NO:35)

C5’-TCACAGTGACCAACCCAGCGAGGATCGCCAAGGCC-3’(SEQ ID NO:36)

5’-GCCTTGGCGATCCTCGCTGGGTTGGTCACTGTGAG-3’(SEQ ID NO:37)

5’-CAACCCAAAGAGGATCGCCGCGGCCGTGAACGAGAAG-3’(SEQ ID NO:38)

5’-CTTCTCGTTCACGGCCGCGGCGATCCTCTTTGGGTTG-3’(SEQ ID NO:39)

5’-GAGGATCGCCAAGGCCGTGGCCGAGAAGTCCTGCAAC-3’(SEQ ID O：40)

5’-GTTGCAGGACTTCTCGGCCACGGCCTTGGCGATCCTC-3’(SEQ ID NO:41)

5’-GATCGCCAAGGCCGTGAACGCGAAGTCCTGCAACTG-3’C(SEQ ID NO:42)

5’-GCAGTTGCAGGACTTCGCGTTCACGGCCTTGGCGATC-3’(SEQ ID NO:43)

5’-GCCAAGGCCGTGAACGAGGCGTCCTGCAACTGCCTC-3’(SEQ ID NO:44)

5’-GAGGCAGTTGCAGGACGCCTCGTTCACGGCCTTGGC-3’(SEQ ID NO:45)

5’-CAAGGCCGTGAACGCGGCGTCCTGCAACTGCCTCCTG-3’(SEQ ID NO:46)

5’-CAGGAGGCAGTTGCAGGACGCCGCGTTCACGGCCTTG-3’(SEQ ID NO:47)

對于各突變體的擴(kuò)增，制備含3微升模板DNA(約30ng)、5微升10×反應(yīng)緩沖液、1微升10mM dNTP混合物、1微升2.5單位的pfu聚合酶、12.5微升125ng正向引物和12.5微升125ng反向引物的反應(yīng)溶液，并用二次蒸餾的水使其最終體積為50微升，進(jìn)行PCR。進(jìn)行一輪95℃、10分鐘的反應(yīng)，然后進(jìn)行95℃、30秒，55℃、30秒和68℃、6分鐘的反應(yīng)，重復(fù)16輪。PCR反應(yīng)結(jié)束后，將1微升DpnI加到各PCR試管中，37℃孵育1小時，然后加熱DpnI至80℃20分鐘，使其失活。根據(jù)所附指導(dǎo)手冊(英杰公司制備)用反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化50微升的XL-1藍(lán)感受態(tài)細(xì)胞。使用ENO1R400-420引物(5'-GCAAGGGGCACCAGTCTTGATCTG-3'，SEQ ID NO:48)測定核苷酸序列。將每個具有正確序列的突變克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21Rosseta。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)使ENO1突變蛋白在大腸桿菌中表達(dá)，超聲處理細(xì)菌沉淀物后，根據(jù)制造商(恰根)提供的附帶指導(dǎo)手冊采用Ni-瓊脂糖進(jìn)行純化。采用12％SDS PAGE分析各突變蛋白的純度。

為了測定各突變蛋白的結(jié)合活性，將400ng/100微升的人ENO1蛋白或突變ENO1蛋白包被到96孔ELISA板上，4℃過夜，然后用PBS洗滌該板。室溫用含1％BSA(w/v)的PBS溶液封阻該板1小時，然后用1x PBS再次清洗。一抗(EN10mAb)經(jīng)2倍系列稀釋，獲得15個不同的濃度，然后加到各板中，37℃放置1小時。反應(yīng)完成后，用1x PBS洗滌板三次。加入1/8000稀釋度的山羊抗-小鼠-HRP抗體，37℃孵育1小時，然后用1x PBS洗滌板三次。然后加入TMB底物，允許反應(yīng)在室溫下進(jìn)行30分鐘。加入1N HCl結(jié)束反應(yīng)，讀取OD450測定活性。各研究重復(fù)3次。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示。使用Sigmaplot^TM將OD讀數(shù)和抗體濃度制作多重分散曲線。由四個參數(shù)的邏輯擬合預(yù)測K_d值。

根據(jù)實(shí)施例9所示的ENO1大部分刪除研究結(jié)果，殘基296-336的肽序列(FDQDDWGAWQKFTASAGIQVVGDDLTVTNPKRIAKAVNEKS，SEQ ID NO:49)是ENO1蛋白與EN10mAb緊密結(jié)合所需?！熬o密結(jié)合”在本文中指特異性結(jié)合劑(如抗體，scFv或Fab片段)與配體/靶標(biāo)(如肽、蛋白或細(xì)胞)結(jié)合時解離常數(shù)(Kd)為10nM或以下，優(yōu)選為1.0nM或以下。

上述刪除實(shí)驗鑒定了ENO1的殘基296-336是抗體結(jié)合的區(qū)域。為了進(jìn)一步表征實(shí)際的結(jié)合位點(diǎn)(如表位)，從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(pdb登陸號：2PSN)下載ENO1的晶體結(jié)構(gòu)，分析此區(qū)域的殘基位置。在蛋白表面暴露有以下11個氨基酸殘基：D300、W301、G302、Q305、K306、A309、K326、K330、N333、E334和K335(圖13A，推定的表位)。通過定點(diǎn)誘變，將這11個氨基酸突變，在大腸桿菌中分別表達(dá)所得突變蛋白，并純化(圖13B)。使用ELISA分析每個純化的ENO1突變蛋白的任何Kd變化(與ENO1結(jié)合相比)。

結(jié)果顯示，這些突變體中存在3種功能類別的氨基酸殘基。氨基酸殘基W301和K330對ENO1蛋白與EN10mAb的結(jié)合是重要的。如果這兩個氨基酸殘基分別被突變成丙氨酸，這兩個ENO1突變體對EN10mAb的結(jié)合活性明顯被削弱。第二類氨基酸殘基包括A309、E334、K335和D300。如果E334、K335和D300分別被突變成丙氨酸或A309被突變成甘氨酸，這些ENO1突變體對EN10mAb的結(jié)合活性被削弱。余下的氨基酸殘基，包括G302、Q305、K306、N333和K326，屬于對ENO1蛋白與EN10mAB的結(jié)合無明顯結(jié)合影響的氨基酸殘基組(圖13C和表2)。這些結(jié)果表明，W301、K330、A309、E334、K335和D300對ENO1和EN10mAb之間的蛋白-蛋白結(jié)合是重要的。這些氨基酸殘基屬于ENO1肽1²⁹⁶FDQDDWGAWQKFTA³⁰⁹(圖13D，SEQ ID NO:9)和肽2³²⁶KRIAKAVNEKS³³⁶(圖13D，SEQ ID NO:10)的序列，它們可能是人ENO1氨基酸殘基296-335(圖13D，SEQ ID NO:49)中EN10mAb的結(jié)合表位。

表2：突變體的K_d值

實(shí)施例14

ENO1和EN10mAb結(jié)構(gòu)分析

從蛋白數(shù)據(jù)庫(pdb-登陸號：2PSN)下載α-烯醇化酶的晶體結(jié)構(gòu)。通過同源模型構(gòu)建EN10mAb的Fab片段結(jié)構(gòu)。第一步是尋找與EN10mAb具有高序列相似性的模板結(jié)構(gòu)。檢索NCBI數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov)，發(fā)現(xiàn)許多高度同源的序列。選擇相同性為89％的重鏈框架(pdb-登陸號：3DGG)和相同性為95％的輕鏈框架(pdb-登陸號：1F6L)。使用程序Accelrys Discovery Studio構(gòu)建EN10mAb的抗體同源模型。使用ENO1和抗體結(jié)構(gòu)進(jìn)行對接。為了減輕電腦負(fù)荷，僅將抗體可變結(jié)構(gòu)域的CDR環(huán)與ENO1對接。固定抗體的框架。由于對接程序檢測到在起始位置周圍有較大的區(qū)域，因此不需要非常小心的對對接伙伴進(jìn)行初始定位。當(dāng)使用ZDock時，結(jié)構(gòu)會受到x-y-z軸移動干擾(沿著中心線擾動，垂直于中心線的平面的埃度微擾，埃度-旋轉(zhuǎn)微擾，以度計)，且每次對接回合產(chǎn)生大約5000種態(tài)勢。以與截斷值對ZDock結(jié)果進(jìn)行聚類分析。選擇ENO1的相互作用的殘基進(jìn)行表位作圖。

人ENO1蛋白的3D結(jié)構(gòu)如圖14A所示。標(biāo)記了氨基酸殘基W301、K330、300D、E334和K335。標(biāo)出了Wang等公開的ENO1蛋白的血纖維蛋白溶酶原結(jié)合位置上的關(guān)鍵殘基(250-FFRSGKY-256)。圖14B顯示，預(yù)測ENO1與EN10mAb的結(jié)合復(fù)合物離ENO1的血纖維蛋白溶酶原結(jié)合位點(diǎn)約到血纖維蛋白溶酶原結(jié)合位點(diǎn)與EN10mAb之間的間隔遠(yuǎn)低于人血纖維蛋白溶酶原的分子大小本研究表明，ENO1和EN10mAb的結(jié)合遮蔽了ENO1的血纖維蛋白溶酶原結(jié)合位點(diǎn)，阻止了血纖維蛋白溶酶原與ENO1接觸，導(dǎo)致ENO1的血纖維蛋白溶酶原受體活性被削弱，并阻止細(xì)胞從胞外基質(zhì)脫離。

實(shí)施例15

Biacore分析

使可溶性ENO1蛋白結(jié)合固定在CM5芯片上的抗體，進(jìn)行EN10mAb的Biacore分析，以評估它們對可溶性抗原的親和力。

將圖15A所示的小鼠可變區(qū)和人Fc嵌合抗體表達(dá)載體pTCAE8-ENO1轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中，制備表達(dá)重組抗體的細(xì)胞。使用FreeStyle 293細(xì)胞(英杰公司制造)作為用于表達(dá)的宿主細(xì)胞。使用lipofectamine 2000，根據(jù)所附指導(dǎo)手冊(英杰公司制備)將載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中。用限制性內(nèi)切酶將約2.5微克的抗體表達(dá)載體線性化，然后將基因轉(zhuǎn)入4×10⁶個細(xì)胞中，在6孔培養(yǎng)板中培育細(xì)胞。加入對應(yīng)于表達(dá)載體的選擇標(biāo)記的試劑，連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，直至形成穩(wěn)定的細(xì)胞群。

采用下文所述方法制備含人IgG抗體的培養(yǎng)上清。使生產(chǎn)抗體的細(xì)胞在Free style^TM 293表達(dá)培養(yǎng)基(吉科(Gibco))中馴養(yǎng)。細(xì)胞在組織培養(yǎng)燒瓶中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞的存活率為90％時收集培養(yǎng)上清。使收集的上清通過10微米和0.2微米的過濾器(密理博公司制造)過濾，除去污染物。使用蛋白A(密理博公司制造)對含抗體的培養(yǎng)上清進(jìn)行親和純化，使用PBS作為吸附緩沖液，使用20mM檸檬酸鈉緩沖液(pH 3.0)作為洗脫緩沖液。向洗脫部分中加入50mM磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)而將其pH調(diào)整為約6.0。使用透析膜(分子量截留值為10000，光譜實(shí)驗室(Spectrum Laboratories)制造)將制備得到的抗體以PBS替換，并通過孔徑為0.22微米的膜過濾器(密理博公司制造)進(jìn)行過濾滅菌，獲得純化的抗體。通過測量280nm的吸光度并將基于每1.45光密度對應(yīng)于1mg/ml而換算該測量值，從而測定純化的抗體的濃度。

對于結(jié)合動力學(xué)，如先前所述(Karlsson&Falt，(1997)J.Immunol Methods，200：121-133)使用BIAcore 2000(生物核心有限公司(BIAcore,Inc.)，皮斯卡塔韋，新澤西州)進(jìn)行表面等離子共振技術(shù)(SPR)測量。根據(jù)供應(yīng)者的指導(dǎo)，用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物傳感器芯片(CM5，生物核心有限公司)。使用10mM醋酸鈉(pH 4.8)將嵌合E10mAb稀釋到5微克/毫升，然后以20微升/分鐘的流速注射，以達(dá)到約100響應(yīng)單位(RU)的偶聯(lián)蛋白，接著注射1M乙醇胺以阻斷未反應(yīng)的基團(tuán)。對于動力學(xué)測量，在25℃以25微升/分鐘的流速將兩倍系列稀釋的ENO1(0.3125nM至40nM)注射于制造商(生物核心有限公司，皮斯卡塔韋，新澤西州)所提供的HBS-PBiacore跑膠緩沖液中，并通過減去空白流動池上獲得的響應(yīng)校正對于EN10mAb的結(jié)合響應(yīng)。使用單純一對一Langmuir結(jié)合模型(其中，kon與koff分別進(jìn)行擬合)，計算結(jié)合速率(kon或ka)與解離速率(koff或kd)。(BIAcore.TM.估算軟件3.2版)。

表3

結(jié)果顯示在圖15B和表3中。EN10mAb結(jié)合ENO1的kon和koff值分別為3.57×10⁵和8.271×10^-5，K_d為2.311±0.003x10^-10mol/L。采用SPR分析獲得的K_d與實(shí)施例2采用結(jié)合ELISA獲得的K_d非常接近。

實(shí)施例16

補(bǔ)體存在下EN10抗體對腫瘤生長的抑制作用

EN10mAb具有良好的親和力，其K_d約為2.311±0.003x10^-10mol/L，具有進(jìn)一步開發(fā)的潛力。使用CL1-5小鼠異種移植模型評估EN10mAb的治療效果。第0天皮下接種CL1-5F4肺腺癌細(xì)胞(1×10⁶個細(xì)胞/小鼠，每組5只小鼠)。腫瘤接種14天后，每周給予10mpk(mg/Kg)的同種型對照(CTL)、EN10mAb或Erbitux^TM抗體兩次，開始治療過程。注射2小時后給予兔仔血清。每周測量每只小鼠的腫瘤體積和體重。每組的數(shù)據(jù)都以平均值±SD表示。

結(jié)果顯示在圖16中。14天后，攜帶CL1-5的小鼠的腫瘤大小約為30－100mm³，第25天后對照組、EN10mAb和Erbitux處理組之間的腫瘤大小無顯著差異。第29天后，對照組小鼠的腫瘤開始以指數(shù)方式生長，而Eribitux^TM和EN10mAb處理組小鼠中的腫瘤無明顯生長。第36天后，對照組小鼠的平均腫瘤大小為4330±990mm³(N＝5)，經(jīng)10mpk的EN10mAb和Erbitux處理的小鼠的平均腫瘤大小分別為358.6±240mm³(N＝5)和219±98mm³(N＝5)。與對照組相比，EN10mAb和Erbitux^TM處理組的平均腫瘤大小明顯較小，P值分別為0.004和0.003。EN10mAb和Erbitux^TM處理組的腫瘤大小間無顯著差異(P＝0.41)。此結(jié)果表明，當(dāng)與小鼠異種移植模型中的補(bǔ)體C3結(jié)合時，EN10mAb和Erbitux對CL1-5細(xì)胞具有腫瘤生長抑制活性，EN10mAb作為癌癥治療的試劑具有良好的療效。

實(shí)施例17

脾臟-肝臟轉(zhuǎn)移集落形成實(shí)驗中胰腺癌腫瘤擴(kuò)散的阻斷

實(shí)施例2和3的結(jié)果表明給予ENO1抗體能減弱癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移；并且實(shí)施例16的結(jié)果表明，當(dāng)與補(bǔ)體結(jié)合時，ENO1mAb具有抑制腫瘤生長的療效。使用脾臟-肝臟轉(zhuǎn)移實(shí)驗評估EN10mAb對癌細(xì)胞的體內(nèi)抗轉(zhuǎn)移活性。將PDAC1胰腺癌細(xì)胞(1×10⁶個細(xì)胞/小鼠，每組5只小鼠)注射入脾臟。然后，以IP的方式分別給予小鼠10mpk的EN10mAb和IgG對照。腫瘤接種后6周殺死小鼠。分別計算并測量每只小鼠肝臟中腫瘤結(jié)節(jié)的數(shù)量和包括肺、脾、肝、胰腺和腎在內(nèi)的各器官的重量。各小組的數(shù)據(jù)以平均值±SD表示。

結(jié)果顯示在圖17A、17B和17C中。當(dāng)比較肝的腫瘤結(jié)節(jié)和體積時，對照IgG處理組的平均腫瘤結(jié)節(jié)和體積分別為34±10(N＝3)和8500±3500(N＝5)。但是，用10mpk的EN10mAb處理相同背景的小鼠時，處理小鼠的平均腫瘤結(jié)節(jié)和體積則分別為10±4(N＝3)和500±120(N＝5)。10mpk的ENO1和對照IgG處理組之間的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量和體積存在顯著差異(P<0.05)(圖17A和17B)。當(dāng)比較10mpk的ENO1和對照IgG處理組的器官平均重量時，包括肺、脾、胰腺和腎在內(nèi)的器官重量無顯著差異。但是，10mpk的IgG處理的小鼠的平均肝臟重量約為7.2±3g(N＝5)，與10mpk EN10mAb處理的小鼠的平均肝臟重量(1.6±0.2g(N＝5))具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。這些結(jié)果表明，給予EN10mAb能抑制PDAC1細(xì)胞從原發(fā)腫瘤位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到肝臟中。

總而言之，EN10mAb利用其ENO1血纖維蛋白溶酶原受體拮抗活性抑制血纖維蛋白溶酶原的活化，從而誘導(dǎo)下調(diào)細(xì)胞表面上的蛋白酶活性，這反過來抑制癌細(xì)胞從胞外基質(zhì)脫離。結(jié)果，抗ENO1抗體能抑制癌細(xì)胞的侵襲活性。這些數(shù)據(jù)支持ENO1抗體(如EN10mAb)具有較佳的親和力、療效和可用作癌癥治療的治療性抗體的潛力。

除了抑制癌從胞外基質(zhì)脫離并因此抑制癌侵襲外，本發(fā)明的抗體還可用于診斷癌性疾病。如前文所述，并如圖1A和1B所示，癌細(xì)胞在其細(xì)胞表面上表達(dá)ENO1，而正常細(xì)胞不表達(dá)。因此，可檢測結(jié)合到細(xì)胞表面上的ENO1的抗體，作為癌性疾病的指標(biāo)。

例如，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，可使測試樣品與抗ENO1抗體(如EN10mAb)反應(yīng)并測定(例如利用ELISA、熒光細(xì)胞分選、熒光顯微鏡或本領(lǐng)域已知的其它合適方法)該抗體與該樣品的結(jié)合。如果檢測到結(jié)合，或結(jié)合高于閾值(如正常樣品的參比值)，則可得出該樣品含癌細(xì)胞的結(jié)論。

雖然本發(fā)明已描述其有限的具體實(shí)施例，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可借助本公開而了解，在不偏離本文所公開的本發(fā)明范圍的情況下可設(shè)計出其它實(shí)施方案。因此，本發(fā)明的范圍應(yīng)僅受限于所附的權(quán)利要求書。