肝炎疫苗致敏樹突狀細胞誘導特異性t細胞的構建方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物領域，具體涉及一種肝炎疫苗致敏樹突狀細胞誘導特異性τ細胞的構建方法。
【背景技術】
[0002]慢性HBV(乙肝病毒)感染依然是肝癌和終末期肝病發(fā)生進展的首要因素?，F(xiàn)有治療藥物難以清除病毒，臨床治愈率極低，停藥后復發(fā)率高，需要終身治療。慢性HBV感染的核心理論為特異性T細胞功能不全導致機體對病毒的免疫耐受。
[0003]樹突狀細胞(DC)是T細胞活化的關鍵啟動者，是體內最強的抗原提呈細胞，擔負T細胞成熟、活化、增殖的啟動作用，而慢乙肝患者DC數(shù)量或功能缺欠使T細胞激活受阻，導致病毒長期存活并復制，而恢復DC功能對T細胞功能有增強作用；因此，通過體外定向培養(yǎng)獲得自體來源的DC細胞誘導特異性T細胞，從而激活細胞免疫、天然免疫和后續(xù)的體液免疫，對體內HBV進行靶向精確攻擊，促進病毒清除，將有望突破治愈難關。近年來一些臨床研究使用DC疫苗治療慢乙肝能一定程度抑制病毒，提示改善抗原提呈促進功能性T細胞具有潛力和前景，綜合慢乙肝免疫耐受微環(huán)境的諸多因素，深入探討調動抗原提呈對T細胞影響作用可能踏上慢乙肝治愈之路。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的一個目的是針對以上要解決的技術問題，提供一種能夠高效率提呈病毒抗原的肝炎疫苗致敏樹突狀細胞誘導特異性T細胞的構建方法。
[0005]本發(fā)明的另一個目的是提供利用該方法制得的體外細胞體系。
[0006]本發(fā)明的再一個目的是提供包含體外細胞體系細胞制劑。
[0007]本發(fā)明的再一個目的是提供該方法在制備用于治療肝炎的細胞制劑中的用途。
[0008]為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明提供了一種肝炎疫苗致敏樹突狀細胞誘導特異性T細胞的構建方法，其包括如下步驟:
[0009](1)獲得抗原負載單核細胞衍生樹突狀細胞；
[0010](2) T細胞擴增；
[0011](3)獲得肝炎病毒特異性T細胞。
[0012]優(yōu)選地，所述步驟⑴為:采集外周血10ml，分離外周血單個核細胞，重懸于4ml的A頂-V培養(yǎng)液，然后置于37 °C、50 % C02培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)2小時；2小時后取出，輕搖，移走懸浮細胞，貼壁細胞，即單核細胞中加入4ml AIM - V培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基內含濃度為20ng/ml的IL - 4(白介素-4)以及濃度為100ng/ml的GM - CSF(巨噬細胞-集落刺激因子);3天后，單核細胞補充AIM - V培養(yǎng)液2ml，該培養(yǎng)液含濃度為20ng/ml的IL - 4以及濃度為100ng/ml的GM -CSF，仍置于37°C、50% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使其誘導成熟為單核細胞衍生樹突狀細胞(moDCs細胞);第6天時向moDCs細胞加入肝炎病毒疫苗原液10 μ g，培養(yǎng)24小時，獲得抗原負載單核細胞衍生樹突狀細胞(HPDCs細胞)。
[0013]優(yōu)選地，所述步驟(2)為:將步驟(1)中獲得的懸浮細胞，即T細胞，移至含4mlAIM - V培養(yǎng)液的T75培養(yǎng)瓶，以A頂-V培養(yǎng)基洗滌3次，洗滌液量為2ml/次；然后加入終濃度為1 μ g/ml的0KT3 (⑶3單克隆抗體)以及終濃度為1 μ g/ml的抗-⑶28，置于37 °C、50% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；第2天:T細胞培養(yǎng)液中補充AIM - V培養(yǎng)液5 - 10ml，該培養(yǎng)液內含濃度為300IU/ml的IL - 2(白介素-2)以及質量體積濃度為20%的白蛋白1.5ml ;第4天:補充A頂-V培養(yǎng)液5 - 10ml，該培養(yǎng)液內含濃度為300IU/ml的IL - 2以及質量體積濃度為20%的白蛋白1.5ml，繼續(xù)在37°C、50% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至第8天，獲得增殖的T細胞。
[0014]優(yōu)選地，所述步驟(3)為:將步驟(1)中獲得的抗原負載單核細胞衍生樹突狀細胞和步驟⑵中獲得的增殖的T細胞混合共培養(yǎng)；第10天:補充A頂-V培養(yǎng)液5 - 10ml，該培養(yǎng)液內含濃度為300IU/ml的IL-2以及質量體積濃度為20%的白蛋白1.5ml ;第12天:補充A頂-V培養(yǎng)液5 - 10ml，該培養(yǎng)液內含濃度為300IU/ml的IL - 2以及質量體積濃度為20%白蛋白1.5ml ;第14天:獲得肝炎病毒特異性T細胞?；颊咄庵苎?0ml進行定向誘導DC產(chǎn)生特異性T細胞數(shù)量達107 - 10s。
[0015]更優(yōu)選地，所述的肝炎疫苗為甲肝疫苗、乙肝疫苗或丙肝疫苗中的任意一種。更優(yōu)選地，所述的肝炎疫苗為乙肝疫苗。
[0016]本發(fā)明還提供了根據(jù)上述方法制得的體外細胞體系。
[0017]本發(fā)明還提供了包含上述體外細胞體系的細胞制劑。
[0018]本發(fā)明還提供了根據(jù)上述方法在制備用于治療肝炎的細胞制劑中的用途。
[0019]優(yōu)選地，所述肝炎為甲肝、乙肝或丙肝中的任意一種。更優(yōu)選地，所述肝炎為乙肝。
[0020]具體地，本發(fā)明公開了肝炎疫苗(特別是乙肝疫苗)致敏樹突狀細胞(DC)誘導特異性T細胞(HPDCT)的構建方法，利用外周血單核細胞通過定向誘導獲得功能性的成熟DC，再通過過繼免疫誘導出HBV特異性多表位的CD4+T細胞和CD8+T細胞；所述的T細胞能分泌高水平的效應性細胞因子IL - 17、IL - 2、IFN - γ。
[0021]本發(fā)明首先制備患者自體來源的活化DC細胞，利用患者外周血PBMC，分離單核細胞后，利用細胞因子白介素-4(IL - 4)和集落刺激因子(GSF)誘導獲得功能性DC，以多色流式細胞鑒定DC成熟標記；然后以去佐劑的乙肝疫苗沖擊，獲得表面抗原致敏的DC。
[0022]平行實驗進行T細胞擴增，使用0KT3和抗-⑶28建立和優(yōu)化淋巴細胞擴增培養(yǎng)體系，體外培養(yǎng)7天后，再與負載表面抗原的成熟DC混合培養(yǎng)，從而獲得HBV特異性IFN - γ和Τ細胞。
[0023]本方法制得的體外細胞系可顯著改善患者的特異性細胞免疫，將制得的體外細胞體系回輸患者體內，從而靶向攻擊體內HBV，降解病毒基因和清除受感染的肝細胞，為慢性乙肝治愈提供新的途徑。
[0024]比較聯(lián)合抗病毒藥物疊加HPDCT細胞治療與單用藥物或單用細胞治療效應性Τ細胞和細胞因子的差異。結果發(fā)現(xiàn)，抗病毒藥物治療患者單核細胞衍生樹突狀細胞誘導特異性Τ細胞分泌IFN - γ水平高于無抗病毒治療的慢乙肝患者?？共《舅幬锆B加HPDCT細胞治療具有更尚的抗病毒效應。
【附圖說明】
[0025]圖1示出了含成熟標記的單核細胞衍生樹突狀細胞。
[0026]圖2示出了抗原負載樹突狀細胞誘導較高水平特異性T細胞。
[0027]圖3示出了抗原負載樹突狀細胞誘導較高水平IFN - γ。
[0028]圖4示出了抗病毒藥物疊加HPDCT顯示更強的抗病毒效應。
[0029]圖5示出了 ETV單藥治療和ETV+HPDCT聯(lián)合治療流程。
[0030]圖6示出了 ETV聯(lián)合HPDCT治療組患者產(chǎn)生對降解病毒起關鍵作用的Τ細胞效應因子(IL- 17和IFN - γ )顯著高于ETV單藥治療。
【具體實施方式】
[0031]下面結合附圖和具體實施例，對本發(fā)明的技術方案作進一步的詳述，但本發(fā)明并不限于以下實施例。下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。以下天數(shù)的表述，如未特別指出，均從開始構建時計算。
[0032]實施例1:獲得抗原負載單核細胞衍生樹突狀細胞
[0033]采集慢性乙肝患者外周血10ml，按照常規(guī)方法分離外周血單個核細胞(PBMC)，重懸于4ml的A頂-V培養(yǎng)液，然后置于37°C、50% (體積濃度)C02培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)2小時。
[0034]2小時后取出，輕搖，移走懸浮的非貼壁細胞，貼壁細胞中加入A頂-V培養(yǎng)基4ml，該培養(yǎng)基內含 IL - 4(20ng/ml)及 GM - CSF (100ng/ml)。
[0035]3天后，貼壁細胞補充A頂-V培養(yǎng)液2ml，該培養(yǎng)液內含IL - 4(20ng/ml)及GM -CSF(100ng/ml)，仍置于37°C、50% (體積濃度)0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0036]第6天