制備細(xì)胞培養(yǎng)用活性成分組合物的方法及細(xì)胞培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及細(xì)胞培養(yǎng)用的活性成分組合物以及相關(guān)培養(yǎng)基的制備和使用。
【背景技術(shù)】
[0002]干細(xì)胞是一類特殊的細(xì)胞，其具有自我復(fù)制能力，并且在特定條件下，可以分化成多種功能細(xì)胞。依據(jù)不同的分類方法，干細(xì)胞可分為胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞，或者全能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞、專能干細(xì)胞等。干細(xì)胞在受損組織器官的修復(fù)與再生、高效醫(yī)藥活性成分制備等方面具有誘人前景。以干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)的研發(fā)在近幾年急劇增加，成為新的醫(yī)藥和健康領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
[0003]培養(yǎng)細(xì)胞的完全培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基(如MEM和DMEM等)和添加劑(如血清或無血清培養(yǎng)用的激素及生長因子)組成。因此，按照是否含有血清，可將細(xì)胞培養(yǎng)基分成兩類，即含有血清的培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基。血清含有生長因子可促進(jìn)細(xì)胞的繁殖，含有附著因子可促進(jìn)細(xì)胞的貼壁，同時(shí)還具有抗胰酶活性。血清同時(shí)也是礦物質(zhì)、脂類及激素的來源。然而，含有血清的培養(yǎng)基的一個(gè)主要缺陷是有動(dòng)物來源成分，有些成分還沒有完全研究清楚，在與藥物研究有關(guān)的實(shí)驗(yàn)中，動(dòng)物來源成分可能會(huì)帶來生物安全的問題，從這個(gè)角度來說，在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)血清含量越少越好。
[0004]無血清培養(yǎng)基一般由營養(yǎng)成分和和生物活性分子組成，一般需要添加十幾種到幾十種活性分子，各活性分子之間的相對數(shù)量比例關(guān)系難以調(diào)整到最佳狀態(tài)，從而難以發(fā)揮細(xì)胞的最優(yōu)生長性能。
[0005]在干細(xì)胞培養(yǎng)過程中，細(xì)胞培養(yǎng)基是干細(xì)胞生長分化的關(guān)鍵因素。由于干細(xì)胞的特殊性，對培養(yǎng)基的要求尤其高?，F(xiàn)有干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基是由營養(yǎng)型添加物與活性分子組成，但是各活性分子的比例難以準(zhǔn)確把握，在培養(yǎng)干細(xì)胞特別是早期干細(xì)胞時(shí)難以發(fā)揮細(xì)胞的最大生長能力。另外在由干細(xì)胞培養(yǎng)物治療某些疾病的時(shí)候，特別是當(dāng)疾病涉及到多種生物活性分子時(shí)，傳統(tǒng)的干細(xì)胞培養(yǎng)基制備的培養(yǎng)物難以奏效。
[0006]如中國專利申請CN103805562B公開的一種培養(yǎng)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，以DMEM培養(yǎng)液為基礎(chǔ)，還含有成纖維細(xì)胞生長因子受體2、生長激素、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、谷胱甘肽、BMP-4、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、非必需氨基酸以及β -巰基乙醇等。
[0007]又如中國專利申請CN104877962A公開的一種無血清的脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基，包括HffiM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括如下組分:重組人胰島素、重組轉(zhuǎn)鐵蛋白、維生素C、人血清白蛋白、成纖維細(xì)胞生長因子、血小板衍生生長因子、表皮生長因子、胰島素樣生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、纖維連接蛋白、胎球蛋白、茶多酚和干細(xì)胞生長因子。
[0008]綜上所述，本領(lǐng)域仍然需要適合用于細(xì)胞培養(yǎng)尤其是干細(xì)胞培養(yǎng)的活性成分及培養(yǎng)基。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種能夠滿足細(xì)胞生長需求的新型的細(xì)胞培養(yǎng)用活性成分組合物及其制備方法以及包含該活性成分組合物的培養(yǎng)基及其用途。
[0010]本發(fā)明的活性成分組合物及含有該組合物的細(xì)胞培養(yǎng)基克服了現(xiàn)有的含血清培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基的缺點(diǎn)。如上文【背景技術(shù)】中所述，現(xiàn)有的細(xì)胞培養(yǎng)基分為兩種，含有或不含血清。含有血清的培養(yǎng)基的主要缺陷是有動(dòng)物來源成分，在與藥物研究有關(guān)的實(shí)驗(yàn)中，動(dòng)物來源成分可能會(huì)帶來生物安全的問題。另一方面，無血清培養(yǎng)基一般由營養(yǎng)型添加物和十幾種到幾十種活性分子組成，各活性分子的比例難以準(zhǔn)確把握，從而難以發(fā)揮細(xì)胞的最大生長能力。
[0011]根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供一種制備細(xì)胞培養(yǎng)用活性成分組合物的方法，包括以下步驟:1)培養(yǎng)第一種細(xì)胞，細(xì)胞為哺乳動(dòng)物脂肪干細(xì)胞，培養(yǎng)至融合率80%以上，除去細(xì)胞，獲得第一種細(xì)胞上清液；2)培養(yǎng)第二種細(xì)胞，細(xì)胞為哺乳動(dòng)物成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)至融合率80%以上，除去細(xì)胞，獲得第二種細(xì)胞上清液；以及3)將以上兩種上清液混合，從而制成細(xì)胞培養(yǎng)用活性成分組合物。
[0012]—個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，第一種細(xì)胞上清液與第二種細(xì)胞上清液的體積比為
1:0.2 ?5ο
[0013]另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該方法還包括培養(yǎng)第三種細(xì)胞的步驟，第三種細(xì)胞與待用細(xì)胞培養(yǎng)用活性成分組合物培養(yǎng)的細(xì)胞來自于同一物種，培養(yǎng)至融合率85%以上，除去細(xì)胞，獲得第三種細(xì)胞上清液，并將獲得的三種上清液混合，從而制成細(xì)胞培養(yǎng)用活性成分組合物。
[0014]更優(yōu)選地，第一種細(xì)胞上清液與第二種細(xì)胞上清液的體積比為1:0.2?5，第一種細(xì)胞上清液與第三種細(xì)胞上清液的體積比為1:0.2?5。
[0015]可選擇地，第一種細(xì)胞、第二種細(xì)胞和第三種細(xì)胞分別來自于同一種哺乳動(dòng)物，比如人類、猿類或鼠類。
[0016]可選擇地，第一種細(xì)胞、第二種細(xì)胞和第三種細(xì)胞可以分別來自于不同的哺乳動(dòng)物，比如:第一種細(xì)胞和第二種細(xì)胞來自于人類，第三種細(xì)胞來自于鼠類。
[0017]另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，還包括向上清液混合液中添加至少一種選自以下的活性成分的步驟:胰島素、胎球蛋白、亞油酸、轉(zhuǎn)鐵蛋白、地塞米松、成纖維細(xì)胞生長因子或亞砸酸鈉。
[0018]優(yōu)選地，分別向上清液混合液中加入胰島素、胎球蛋白、亞油酸、轉(zhuǎn)鐵蛋白、地塞米松、成纖維細(xì)胞生長因子、亞砸酸鈉，使以上成分的終濃度分別為0.2-17.2ng/L、0.2?0.8mg/mL、0.5 ?2 μ g/mL、30 ?70 μ g/mL、0.025-2.54ng/L、80 ?150ng/mL、0.12-0.29ng/L0
[0019]本發(fā)明第二方面提供用本發(fā)明上述方法制備的細(xì)胞培養(yǎng)用活性成分組合物。
[0020]本發(fā)明第三方面提供一種細(xì)胞培養(yǎng)基，包括細(xì)胞基礎(chǔ)營養(yǎng)培養(yǎng)基和本發(fā)明的活性成分組合物。
[0021]優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)用活性成分組合物與細(xì)胞基礎(chǔ)營養(yǎng)培養(yǎng)基的體積比為1:5?
20 ο
[0022]其中，細(xì)胞基礎(chǔ)營養(yǎng)培養(yǎng)基包括但不限于DMEM或MEM培養(yǎng)基。
[0023]本發(fā)明第四方面提供一種細(xì)胞培養(yǎng)方法，所述方法包括使用本發(fā)明的活性成分組合物或本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的步驟。一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，待培養(yǎng)的細(xì)胞是干細(xì)胞，優(yōu)選脂肪干細(xì)胞或骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0024]本發(fā)明第五方面提供本發(fā)明的活性成分組合物或本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基在細(xì)胞培養(yǎng)中的用途。一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，待培養(yǎng)的細(xì)胞是干細(xì)胞，優(yōu)選脂肪干細(xì)胞或骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0025]本發(fā)明的有益效果是:與現(xiàn)有技術(shù)的培養(yǎng)基相比，本發(fā)明的活性成分組合物包含特定的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，含有本發(fā)明活性成分組合物的細(xì)胞培養(yǎng)基不含血清(即不含其他動(dòng)物來源成分)，而且添加較少的其他活性分子。本發(fā)明的活性成分組合物中已含有細(xì)胞生長所需要的多種活性成分，而且這些活性成分相互之間的比例是天然狀態(tài)下的比例，符合細(xì)胞生長的自然需求，因而可以保證細(xì)胞的最佳生長。此外，當(dāng)需要用干細(xì)胞治療的疾病涉及多種生物活性分子而傳統(tǒng)的干細(xì)胞培養(yǎng)基制備的培養(yǎng)物難以奏效時(shí)，利用本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)的干細(xì)胞培養(yǎng)物可以達(dá)到較好的治療效果。
【具體實(shí)施方式】
[0026]下面通過參考【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明作出進(jìn)一步地詳細(xì)闡述，但這些闡述并不對本發(fā)明做任何形式的限定。除非另有說明，否則本文所用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語具有本發(fā)明所屬和相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域的一般技術(shù)人員通常理解的含義。
[0027]本發(fā)明提供一種制備細(xì)胞培養(yǎng)用活性成分組合物的方法，所述方法包括以下步驟:1)培養(yǎng)第一種細(xì)胞，所述細(xì)胞為哺乳動(dòng)物脂肪干細(xì)胞，培養(yǎng)至融合率80%以上，除去細(xì)胞，獲得第一種細(xì)胞上清液；2)培養(yǎng)第二種細(xì)胞，所述細(xì)胞為哺乳動(dòng)物成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)至融合率80%以上，除去細(xì)胞，獲得第二種細(xì)胞上清液；以及3)將以上兩種上清液混合，從而制成所述細(xì)胞培養(yǎng)用活性成分組合物。
[0028]—個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述第一種細(xì)胞上清液:第二種細(xì)胞上清液的體積比為10:1到1:10，優(yōu)選5:1到1:5，最優(yōu)選1:1。另一優(yōu)選實(shí)施方式中，融合率為80% -97%，優(yōu)選85% -95%。可采用過濾或者其他本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的方式從細(xì)胞培養(yǎng)液中除去細(xì)胞以獲得上清液。上述方法中的步驟1)和步驟2)不分先后順序。
[0029]另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，上述方法除包括培養(yǎng)第一種和第二種細(xì)胞之外，還任選包括培養(yǎng)第三種細(xì)胞，尤其是當(dāng)預(yù)期用本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞與所述第一種和/或第二種細(xì)胞不來源于同一物種時(shí)，優(yōu)選培養(yǎng)第三種細(xì)胞，該第三種細(xì)胞與預(yù)期用本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞來自于同一物種。例如，如果制備用于鼠胚胎纖維原細(xì)胞的培養(yǎng)基，則選擇大鼠肝細(xì)胞或