專利名稱：通過脂質(zhì)體酶的治療劑腫瘤特異性遞送的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
03本發(fā)明涉及腫瘤學(xué)領(lǐng)域。具體而言，其涉及增強(qiáng)抗癌劑選擇性 毒性的腫瘤治療。
背景技術(shù)：
04能夠殺死癌細(xì)胞的藥物并不缺乏；挑戰(zhàn)是實(shí)現(xiàn)特異性，即殺死 癌細(xì)胞而同時保留正常細(xì)胞。目前存在三種基本策略正被用于實(shí)現(xiàn)這種 特異性。 一種(選擇性毒性)是使用藥物，其對腫瘤細(xì)胞比對正常細(xì)胞 具有更有效的生長抑制效果(h 2)。該策略強(qiáng)調(diào)常規(guī)化學(xué)治療劑的成
效，也強(qiáng)調(diào)更新的靶向治療如伊馬替尼(imatinib)的成效。第二種策略 (遞送)使用藥劑，如抗體或基因，其分別與腫瘤細(xì)胞特異性反應(yīng)或在 腫瘤細(xì)胞內(nèi)突出表達(dá)(3, 4)。第三種策略(血管生成)通過藥劑如阿 瓦斯丁 (Avastin) (、 6)或藥物被引入脂質(zhì)體(7)中而利用腫瘤血管
的異常方面。脂質(zhì)體是相對大的顆粒，其能夠穿透存在于腫瘤和幾個其 它器官的有孔內(nèi)皮(fenestrated endothelium) (S, 9)。 一旦它們進(jìn)入腫
瘤，它們持續(xù)并最終釋放其內(nèi)含物，并通過增強(qiáng)的通透性和保持性 (enhanced permeabilization and retention, EPR)效應(yīng)來提高局部藥物濃 度(/。。雖然己經(jīng)證明這些策略中每個策略的優(yōu)點(diǎn)，但是獲得的治療
8結(jié)果通常不理想。出現(xiàn)問題的部分原因是其中任何一個所達(dá)到的特異性 不完善，限制了可安全施用而不會引起全身毒性的藥物用量。
05在本領(lǐng)域中對開發(fā)更高效和更低毒的癌癥治療存在持續(xù)的需要。
發(fā)明概述
06根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方式，提供用于遞送治療劑的組合物。 所述組合物包括毒素缺陷型諾維梭狀芽孢桿菌(C/o^nW^m "ov力)芽孢 和包含抗腫瘤藥物或生物制劑的脂質(zhì)體。
07根據(jù)本發(fā)明的另一種實(shí)施方式，提供另一種組合物。所述組合 物包括依照SEQ ID NO: 1或依照在GXSXG脂肪酶基序(SEQ ID NO: 1 的殘基160-164)中具有置換突變的SEQ ID NO: 1的毒素缺陷型諾維梭 狀芽孢桿菌脂質(zhì)體酶；和包含抗腫瘤藥物或生物制劑的脂質(zhì)體。
08本發(fā)明的另一方面是試劑盒。所述試劑盒包括依照SEQIDNO: 1或依照在GXSXG脂肪酶基序中具有置換突變的SEQ ID NO: 1的毒素 缺陷型諾維梭狀芽孢桿菌脂質(zhì)體酶；和包含抗腫瘤藥物或生物制劑的脂 質(zhì)體。
09本發(fā)明仍另一方面是試劑盒。所述試劑盒包括毒素缺陷型諾維 梭狀芽孢桿菌芽孢；和包含抗腫瘤藥物或生物制劑的脂質(zhì)體。
10本發(fā)明的又一種實(shí)施方式是治療癌癥患者的方法。第一種藥劑 ——其是毒素缺陷型諾維梭狀芽孢桿菌芽孢——和第二種藥劑——其是 包含抗腫瘤藥物或生物制劑的脂質(zhì)體，被施用給癌癥患者。由此腫瘤退 化或它的生長被減慢或被抑制。
11本發(fā)明另外的方面是治療癌癥患者的方法，其中將第一種藥劑 和第二種藥劑施用給癌癥患者。第一種藥劑是依照SEQIDNO: 1或依照 在GXSXG脂肪酶基序中具有置換突變的SEQ ID NO: 1的毒素缺陷型諾 維梭狀芽孢桿菌脂質(zhì)體酶，而第二種藥劑是包含抗腫瘤藥物或生物制劑 的脂質(zhì)體。由此腫瘤退化或它的生長被減慢或被抑制。
12本發(fā)明還提供治療癌癥患者的方法，其中第一種和第二種藥劑 被施用給癌癥患者。第一種藥劑是載體，其編碼依照SEQIDNO: 1或依照在GXSXG脂肪酶基序中具有置換突變的SEQ ID NO: 1的毒素缺陷型 諾維梭狀芽孢桿菌脂質(zhì)體酶；以及第二種藥劑是包含抗腫瘤藥物或生物 制劑脂質(zhì)體。由此腫瘤退化或它的生長被減慢或被抑制。
13本發(fā)明還提供組合物，其包括依照SEQ ID NO: 1或依照在 GXSXG脂肪酶基序中具有置換突變的SEQ ID NO: 1的分離和純化的毒 素缺陷型諾維梭狀芽孢桿菌脂質(zhì)體酶蛋白質(zhì)。
14本發(fā)明進(jìn)一步提供結(jié)合蛋白質(zhì)，其包括依照SEQIDNO: 1或 依照在GXSXG脂肪酶基序中具有置換突變的SEQ ID NO: 1的毒素缺陷 型諾維梭狀芽孢桿菌脂質(zhì)體酶蛋白質(zhì)；和多肽配體，其與腫瘤細(xì)胞上的 受體結(jié)合。還提供編碼該結(jié)合蛋白質(zhì)的多核苷酸。
15本發(fā)明還進(jìn)一步提供組合物，該組合物包括分離并純化的多核 苷酸，該多核苷酸編碼依照SEQ ID NO: 1或依照在GXSXG脂肪酶基序 中具有置換突變的SEQ ID NO: 1的毒素缺陷型諾維梭狀芽孢桿菌脂質(zhì)體 酶蛋白質(zhì)。
16這些和其它實(shí)施方式——對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言，在閱讀 說明書后其將變得顯而易見，為本領(lǐng)域提供一套用于治療癌癥的工具， 其對一系列腫瘤和一系列治療劑可具有廣泛的適用性。
附圖簡述
17

圖1A-lD。使用諾維梭狀芽孢桿菌-A/T加鹽酸多柔比星(Doxil) 的治療效果。在第0天使用所示藥劑的各種組合處理具有所示腫瘤的小 鼠。游離阿霉素加諾維梭狀芽孢桿菌-^r芽孢導(dǎo)致所有動物在兩周內(nèi)死 亡，這未示出。圖示了從每組至少五只小鼠收集到的數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo) 準(zhǔn)誤差。諾維梭狀芽孢桿菌-A/T加鹽酸多柔比星與其它組之間的差異顯著 (p<0.0006，對數(shù)秩檢驗(yàn)(log-rank test))。圖1A和IB顯示對CT26腫瘤 的效果。圖1C和1D顯示對HT116腫瘤的效果。圖1A和1C顯示腫瘤 體積，并且圖1B和1D顯示存活百分比。
18圖2A-2B。使用諾維梭狀芽孢桿菌-AT治療后，鹽酸多柔比星 的藥物動力學(xué)分布。(圖2A)在0小時，將鹽酸多柔比星施用給具有 300 mr^大小腫瘤的無胸腺裸鼠。另一組小鼠在施用鹽酸多柔比星之前16小時被靜脈注射諾維梭狀芽孢桿菌-AT芽孢。在所示時間點(diǎn)處死小鼠，并且 從組織中提取阿霉素并通過熒光測定法測量。顯示了每時間點(diǎn)三只小鼠
的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。(圖2B)在注射鹽酸多柔比星后16hr突然冰凍腫瘤， 并且使用熒光顯微鏡檢測中央?yún)^(qū)域的恒冷箱切片。來自脂質(zhì)體內(nèi)阿霉素 的熒光信號被猝滅(見補(bǔ)充材料和方法)，而釋放的阿霉素在590 nm處發(fā) 射熒光。在用諾維梭狀芽孢桿菌-AT芽孢處理的腫瘤內(nèi)，觀察到阿霉素?zé)?光與用DAPI染色的核DNA的共定位。
19圖3A-3C。脂質(zhì)體-破裂活性(Liposome-Disrupting activity) 的生化純化和鑒定。(圖3A)諾維梭狀芽孢桿菌-AT在培養(yǎng)基內(nèi)生長直 至對數(shù)晚期，并通過離心將培養(yǎng)基從細(xì)胞中清除。用40%飽和硫酸銨沉 淀后，進(jìn)行離子交換層析，對組分進(jìn)行脂質(zhì)體-破裂活性評估。(圖3B) 來自(圖3A)的峰組分(30-31)被合并，并且用凝膠過濾層析法分離。 (圖3C)來自(圖3B)的峰組分(29-30)用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 分餾。
20圖4A-4D。脂質(zhì)體酶的功能分析。攜帶野生型或突變型形式 的NT01CX2047基因的質(zhì)粒被引入大腸桿菌(E co")中。"消除的" ("cured")細(xì)菌代表那些最初含有野生型基因并在缺乏選擇性抗生素 時生長直到質(zhì)粒丟失的細(xì)菌。每株細(xì)菌菌株三個獨(dú)立克隆的細(xì)胞裂解液 在通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后產(chǎn)生并被用于下述(圖4A)用寡組氨酸的抗體進(jìn)
行蛋白質(zhì)印跡法，確證細(xì)菌中存在相似數(shù)量的野生型和突變型蛋白質(zhì)。(圖 4B)使用熒光脂肪酶底物1，2- 二油酰-3-芘癸酰-外消旋-甘油 (1，2-dioleoyl-3-pyrenedecanoyl -rac-glycerol)分析脂肪酶活性。(圖4C) 脂質(zhì)體-破裂活性使用鹽酸多柔比星評估。(圖4D)從十種不同生物體純 化的脂肪酶的脂質(zhì)體-破裂活性使用鹽酸多柔比星評估。來自至少兩次獨(dú) 立實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差顯示于(圖4B)至(圖4D)。
21圖5。使用諾維梭狀芽孢桿菌-AT加脂質(zhì)體CPT-ll的治療效 果。在第0天使用所示藥劑的不同組合處理具有所示腫瘤的小鼠。顯示 從每組至少五只小鼠計(jì)算的數(shù)據(jù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。諾維梭狀芽孢桿菌 -iVr加鹽酸多柔比星與其它組之間的差異顯著(p〈0.0003，對數(shù)秩檢驗(yàn))。22圖6A-6B。脂質(zhì)體-破裂活性。(圖6A)在存在來自諾維梭狀芽 孢桿菌-AT培養(yǎng)物的生長培養(yǎng)基的情況下("條件培養(yǎng)基")，從鹽酸多 柔比星釋放阿霉素的時程。諾維梭狀芽孢桿菌-ivr生長至對數(shù)晚期，并通 過離心將培養(yǎng)基從細(xì)胞中清除。顯著的脂質(zhì)體-破裂活性被標(biāo)注(紅色標(biāo) 記)，而在所示對照中沒有觀察到熒光的增加。(圖6B)作為培養(yǎng)物中 生長時間函數(shù)的脂質(zhì)體-破裂活性。諾維梭狀芽孢桿菌-AT芽孢在生長培 養(yǎng)基中接種并在其后的不同時間收獲。清除細(xì)菌細(xì)胞后，測量上清液中 的脂質(zhì)體-破裂活性并與600nm處的吸光率關(guān)聯(lián)。顯示了來自至少兩次脂 質(zhì)體-破裂活性獨(dú)立試驗(yàn)的數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。當(dāng)代表標(biāo)準(zhǔn)偏差的 線條小于相關(guān)數(shù)據(jù)點(diǎn)的符號時，標(biāo)準(zhǔn)偏差不可見。
發(fā)明詳述
23本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)出治療腫瘤的方法。所述方法提高腫瘤治療 的特異性，從而減少全身毒性。使用由諾維梭狀芽孢桿菌-AT制備的蛋白 質(zhì)和脂質(zhì)體包囊的藥物或生物制劑的組合，大大增加消除腫瘤的功效。 所述蛋白質(zhì)，盡管具有脂肪酶的酶活性，卻顯示出作為脂質(zhì)體破裂劑 (dismptor)發(fā)揮非酶促功能。脂肪酶的酶活性對于脂質(zhì)體破裂活性不是必 要的。因此，野生型和脂肪酶陰性突變體均可用于這一功能。此外，脂 質(zhì)體破裂功能可以通過蛋白質(zhì)來遞送，如同由活性諾維梭狀芽孢桿菌-AT 或由蛋白質(zhì)本身的無細(xì)胞制備物原位精確實(shí)施。此外，所述蛋白質(zhì)可作 為結(jié)合或融合蛋白的一部分遞送，其提供給脂質(zhì)體酶蛋白質(zhì)額外的期望 功能。
24于此所述方法的潛在優(yōu)勢之一在于，其普遍適用于任何可被包 封在脂質(zhì)體內(nèi)的化學(xué)治療藥物或生物制劑。作為實(shí)例，這些包括以下種 類的藥物拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、DNA合成抑制劑、細(xì)胞分裂抑制劑、血 管生成抑制劑和微管抑制劑。抗體和抗體偶聯(lián)物，如美羅華(rituxan)、 赫賽汀(herceptin)和愛必妥(erbitux)，也可包封在脂質(zhì)體內(nèi)。此外， 可以使用可提高患者內(nèi)源性腫瘤對抗系統(tǒng)的細(xì)胞因子和其它生物活性蛋 白質(zhì)。這類細(xì)胞因子包括但不限于IL-2和干擾素-a2b和GM-CSF?？?使用的具體藥物、細(xì)胞因子和抗體包括但不限于阿巴瑞克(abarelix)、阿地白介素(aldesleukin)、阿倫單抗(Alemtuzumab)、阿利維A酸 (alitretinoin)、別嘌呤醇(allopurinol)、六甲蜜胺(altretamine)、氨 磷汀(amifostine)、阿那白滯素(anakinra)、阿那曲唑(anastrozole)、 三氧化二砷(arsenic trioxide)、天冬酰胺酶(asparaginase)、阿扎胞苷 (azacitidine) 、 BCG Live、貝伐單抗(bevaciz醒b)、蓓薩羅丁膠囊 (bexarotene capsules)、蓓薩羅丁凝膠(bexarotene gel)、 博萊霉素 (bleomycin)、硼替佐米(bortezombi) 、 bortezomib、白消安(busulfan)、 卡普睪酮(calusterone)、卡培他濱(capecitabine)、卡鈾(carboplatin)、 卡氮芥(carmustine)、塞來昔布(celecoxib)、西妥昔單抗(cetuximab)、 苯丁酸氮芥(chlorambu-eil)、順鉑(cisplatin)、克拉屈濱(cladribine)、 氯伐拉濱(dofarabine)、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、阿糖胞苷 (cytarabine)、達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)、更生霉素(dactinomycin，方文 線菌素D (actinomycin D))、達(dá)肝素鈉(dalteparin sodium) 、 darbepoetin alfa、達(dá)沙替尼(dasatinib)、道諾紅菌素(daunorubicin)、道諾霉素
(daunomycin)、地西他濱(decitabine)、地尼白介素(denileukin)、 地尼白介素2 (Denileukindiftitox)、右雷佐生(dexrazoxane)、右雷佐 生(dexrazoxane)、紫杉砲(docetaxel)、阿霉素(doxorubicin)、丙酸 屈他雄酮(dromostanolone propionate)、 eculizumab、 Elliott's B溶液、表阿 霉素(epirubicin)、表阿霉素鹽酸(epirubicinhcl)、重組人紅細(xì)胞生成 素(epoetin alfa)、埃羅替尼(erlotinib)、埃羅替尼(erlotinib)、雌莫 司汀(estramustine)、依托泊甙磷酸鹽(etoposide phosphate)、依托泊 武(etoposide， VP- 16)、依西美坦(exemestane)、芬太尼檸檬酸鹽(fentanyl citrate)、非格司亭(Filgrastim)、氟尿苷(floxuridine)、氟達(dá)拉濱 (fludarabine)、氟脲嘧啶(fluorouracil, 5-FU)、氟維司群(folvestrant)、 吉非替尼(gefitinib)、吉西他濱(gemcitabine)、吉西他濱鹽酸(gemcitabine hcl) 、 gemicitabine、吉妥珠單抗奧唑米星(gemtuzumab ozogamicin)、 乙酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、乙酸組氨瑞林(histrelin acetate)、 羥基脲(hydroxyurea)、替伊莫單抗(Ibritumomab Tiuxetan)、伊達(dá)比 星(idarubicin)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate)、千擾素a — 2a (Interferon alfa-2a)、干擾素a - 2b (Interferonalfa陽2b)、伊立替康(irinotecan) 、 二甲苯磺酸拉帕替尼(lapatinib ditosylate)、來那度胺(lenalidomide)、來曲唑(let畫le)、亞葉酸
(leucovorin)、亞卩十酸(leucovorin)、亞卩十酸(leucovorin)、亞葉酸
(leucovorin)、乙酸亮丙瑞林(Leuprolide Acetate)、左旋咪唑(levamisole)、 洛莫司汀(lomustine， CCNU )、氮芥(meclorethamine， nitrogen mustard)、 乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、美法蘭(melphalan, L-PAM)、巰基 嘌呤(mercaptopurine， 6-MP )、美司鈉(mesna)、甲氨蝶呤(methotrexate )、 甲氧沙林(methoxsalen)、絲裂霉素C (mitomycin C)、米托坦(mitotane)、 米托蒽酉昆(mitoxantrone)、苯丙酸諾龍(nandrolone phenpropionate)、奈拉濱 (nelarabine)、諾非單抗(Nofetumomab)、奧普瑞白介素(Oprelvekin)、 奧普瑞白介素(oprelvekin)、奧沙利鉬(oxaliplatin)、紫杉醇(paditaxel)、 紫杉醇蛋白質(zhì)-結(jié)合顆粒(paclitaxel-boundparticles) 、 palifermin、帕米膦 酸(pamidronate)、帕尼單抗(panitumumab)、培力卩酶(pegademase)、 培門冬酶(pegaspargase) 、 Pegfilgrastim、 Peginterferon a-2b、培美曲塞 二鈉(pemetrexed disodium)、噴司他丁 ( pentostatin)、哌泊溴烷
(pipobroman)、光輝霧素(plicamycin， mithramycin)、卩卜盼姆納(porfimer sodium)、甲節(jié)肼(procarbazine)、喹纟內(nèi)克林(quinacrine)、拉布立酶
(Rasburicase)、利妥昔單抗(Rituximab)、沙格司亭(sargramostim)、 索拉非尼(sorafenib)、鏈脲佐菌素(streptozocin)、舒尼替尼(sunitinib)、 舒尼替尼馬來酸鹽(sunitinib maleate)、滑石(talc)、他莫昔芬(tamoxifen)、 替莫唑胺(temozolomide)、替尼泊苷(teniposide, VM-26)、睪內(nèi)酯
(testolactone)、沙利度胺(thalidomide) 、 6-硫代鳥嘌呤(thioguanine， 6-TG)、塞替派(thiotepa)、拓?fù)涮婵?topotecan)、拓?fù)涮婵蝶}酸鹽
(topotecanhcl)、托瑞米芬(toremifene)、托西莫單抗(Tositumomab)、 托西莫單抗/1_131托西莫單抗(Tositumomab/I-131 tositumomab)、曲妥珠單 抗(trastuzumab)、維甲酸(tretinoin, ATRA)、尿嘧啶氮芥(Uracil Mustard)、 戊柔比星(valrubicin)、長春堿(vinblastine)、長春新堿(vincristine)、 長春瑞濱(vinorelbine) 、 vorinostat、唑來膦酸鹽(zoledronate)和唑來 膦酸(zoledronic acid)。25編碼所述脂質(zhì)體酶的基因具有如GenBank的登記號CP000382 所示的序列(SEQ ID NO: 2)。所述蛋白質(zhì)具有登記號ABK60711所示的序 列(SEQIDNO: 1)。前35個氨基酸被預(yù)測作為信號序列而被切割。在高 度保守的GXSXG脂肪酶基序(SEQIDNO: 1的殘基160-164)中具有氨 基酸置換的突變體，還保留脂質(zhì)體酶活性并且可以使用。例如，S127G 突變體(在SEQIDNO: 1的絲氨酸162上的突變)可以用來提供脂質(zhì)體 酶活性。其它脂肪酶缺陷型突變體也可使用。絲氨酸-127的其它置換(在 SEQIDNO:l中的殘基162)可以是與氨基酸A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 T、 V、 W或Y的置換。
26根據(jù)本發(fā)明的組合物可在施甩于人或其它哺乳動物之前或之后 制造。因此，所述組合物的成分可被單獨(dú)或混合施用。如果單獨(dú)施用， 所述成分可以任何順序施用。當(dāng)它們在患者或其它哺乳動物體內(nèi)時，所 述成分可形成所述組合物。所述組合物的成分可以在試劑盒內(nèi)一起或單 獨(dú)包裝。因此，可向最終使用者提供在單一包裝中的多個器皿或容器。 最終使用者可一次或一次以上單獨(dú)或混合施用所述成分。
27包括用于實(shí)踐本發(fā)明抗腫瘤方法的有用成分的試劑盒，可被包 裝在分開或未分開的容器內(nèi)，所述容器如紙盒、瓶、安瓿、管等。所述 芽孢、脂質(zhì)體酶和抗腫瘤劑可以以例如干燥、凍干或液體形式進(jìn)行包裝。 提供的附加成分可包括用于千燥成分重構(gòu)的賦形劑。優(yōu)選地，所有這類 賦形劑是無菌且不致熱的，以便于它們適于注射至哺乳動物中而不產(chǎn)生 副作用。除芽孢之外的抗腫瘤劑也優(yōu)選是無菌的。所述芽孢優(yōu)選地是微 生物學(xué)純的，即除了期望的形成芽孢的厭氧菌之外，不含有其它細(xì)菌。
28用于制造脂質(zhì)體的方法是本領(lǐng)域熟知的。參見例如Mozafari, Cell Mol Biol Lett. 2005; 10(4):711-9; Andresen等，Prog Lipid Res. 2005 Jan; 44(l):68-97; Jensen等，Mol Cancer Ther. 2004 Nov; 3(11): 1451-8; Pupo等, J Control Release. 2005 May 18;104(2):379-96p; Brandl， Biotechnol Annu Rev. 2001;7:59-85。本領(lǐng)域已知用于制造脂質(zhì)體的任何技術(shù)均可使用。
29諾維梭狀芽孢桿菌芽孢可如本領(lǐng)域己知進(jìn)行制備。優(yōu)選地，所 述芽孢將來自毒素缺陷型菌株。參見例如美國專利申請20050079157， 其內(nèi)容明確引用于此。通過細(xì)菌噬菌體或質(zhì)粒自愈的方法可以消除毒素。
15作為原材料使用的諾維梭狀芽孢桿菌(ATCC 19402)可從美國典型培養(yǎng) 物保藏中心(the American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA， 20110-2209)獲得。
30雖然菌株沒有必要是完全無毒素的，但是期望的是，至少一種 毒素基因被突變、缺失或被另外滅活以使細(xì)菌對宿主的有害性更小。如 果毒素基因是游離的或在噬菌體上，則游離基因或噬菌體的消除可被用 于去除毒素基因。技術(shù)是本領(lǐng)域中用于突變體誘變和篩選以及用于消除 游離基因領(lǐng)域所熟知的。
31根據(jù)本發(fā)明的分離的且細(xì)菌學(xué)純的無性繁殖的細(xì)菌或芽孢，是 沒有受到其它細(xì)菌或芽孢污染的那些。用于獲得這類純培養(yǎng)物的微生物 學(xué)技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。典型地，挑取單個菌落并涂布于瓊脂營養(yǎng)培養(yǎng) 基上，分離菌落以產(chǎn)生為單細(xì)胞后代的新菌落。該過程通常被重復(fù)以確 保純培養(yǎng)物?？蛇x地，液體培養(yǎng)物可連續(xù)稀釋并涂板以形成單菌落。為 確保來自單細(xì)胞的菌落形成，連續(xù)重復(fù)是期望的。參見例如J.H. Miller, Experimentals in Molecular Genetics(分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn))，Cold Spring Harbor Laboratory(冷泉港實(shí)驗(yàn)室)，NY， 1972。
32芽孢、脂質(zhì)體酶、脂質(zhì)體酶偶聯(lián)物和編碼脂質(zhì)體酶或其融合蛋 白的核酸，可通過任何能提供接近腫瘤的方法施用給具有腫瘤的哺乳動 物。芽孢可靜脈注射、皮內(nèi)注射、皮下注射、肌肉內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、 腫瘤內(nèi)注射、鞘內(nèi)注射、外科手術(shù)注射等。優(yōu)選的技術(shù)是靜脈內(nèi)和腫瘤 內(nèi)注射。具有腫瘤的哺乳動物可以是例如人類；寵物，如狗和貓；農(nóng) 業(yè)動物，如奶牛、綿羊、山羊和豬；以及實(shí)驗(yàn)動物，如大鼠、倉鼠、猴 子、小鼠和兔子。
33本遞送系統(tǒng)用于蛋白質(zhì)治療或基因治療或它們的組合。因此， 脂質(zhì)體酶可作為蛋白質(zhì)或作為編碼脂質(zhì)體酶的多核苷酸來提供。類似地， 所述抗腫瘤藥物或生物制劑可以是蛋白質(zhì)或多核苷酸，以及小化學(xué)實(shí)體， 例如不是生物聚合物。多核苷酸可以提供在病毒或非病毒載體中。任何 本領(lǐng)域已知的載體可使用而不受限制。載體構(gòu)建物可含有腫瘤特異性啟 動子以增強(qiáng)治療的特異性。這些啟動子的實(shí)例是本領(lǐng)域已知的。CXCR4 啟動子在黑素瘤中是腫瘤特異性的；己糖激酶n型啟動子在肺癌中是腫瘤特異性的；TRPM4 (瞬時受體電位-Melastatin 4， Transient Receptor Potential-Melastatin4)啟動子優(yōu)先在前列腺癌具有活性。所述抗腫瘤藥物 可以是直接或間接對腫瘤起作用的藥物。因此，例如它可以是刺激對腫 瘤的天然免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)。可選地，它可以是調(diào)動免疫系統(tǒng)其它成分 來破壞腫瘤細(xì)胞的抗體。還有其它物質(zhì)可對腫瘤細(xì)胞具有毒性。對試劑 的選擇正好在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員技能內(nèi)。
34結(jié)合蛋白質(zhì)是翻譯后被連接的蛋白質(zhì)；它們可通過兩個多肽的 化學(xué)連接——直接或通過中間體——而連接?？蛇x地，所述蛋白質(zhì)可通 過單一開放讀碼框內(nèi)的兩個編碼區(qū)的共翻譯來連接。任何用于連接兩個 未被天然連接的多肽的方法均可使用。可使用的一種偶聯(lián)物類型采用抗 體分子或其部分作為第二種蛋白質(zhì)。因此，作為實(shí)例，脂質(zhì)體酶可以被 連接到抗體的可變區(qū)，從而提供給所述脂質(zhì)體酶靶向表達(dá)與抗體結(jié)合的 抗原的機(jī)體內(nèi)特定位點(diǎn)的途徑。連接物可根據(jù)期望在結(jié)合蛋白質(zhì)的部分 之間使用。
35根據(jù)本發(fā)明的分離并純化的脂質(zhì)體酶蛋白質(zhì)是這樣的制備物， 其中所述脂質(zhì)體酶活性占組合物中的蛋白質(zhì)的至少10%、 25%、 40%、 55%、 70%、 85%或95%。編碼分離并純化的脂質(zhì)體酶的多核苷酸是從
諾維梭狀芽孢桿菌基因組的其它基因中分離出的多核苷酸。因此，它與 編碼假設(shè)蛋白質(zhì)NT01CX—2046和NT01CX—2048的基因組鄰近序列是分
開的。諾維梭狀芽孢桿菌-AT的完整基因組已被測定并在NCBI中以 NC—008593可用。它是2,5478,720 nt的環(huán)狀DNA。
36本發(fā)明的方法和組合物可用于任何腫瘤類型。本發(fā)明依賴的原 理(如脂質(zhì)體穿透存在于腫瘤和幾個其它器官的有孔內(nèi)皮的選擇性能力
P)，和在脂質(zhì)體酶存在情況下來自脂質(zhì)體的內(nèi)含物的釋放增強(qiáng)) 適用于任何腫瘤。因此，本發(fā)明可用于治療胃腸道如胃、小腸、結(jié)腸、 直腸、食道的腫瘤，腎、乳房、肺、肝、頭頸和腦的腫瘤。
37上述公開內(nèi)容概括描述本發(fā)明。所有于此公開的參考通過引用 明確引入。更完整的理解可通過參考以下具體實(shí)施例獲得，所述實(shí)施例 提供于此的目的僅用于說明，并不企圖限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例l 材料與方法
38細(xì)胞系。HCT116 (CCL-247，人結(jié)直腸癌)和CT26 (CRL-2638，
小鼠結(jié)直腸腺癌)購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。兩種細(xì)胞系在37'C 5 %C02中生長于補(bǔ)充5%FBS (Hyclone)的McCoy's 5A培養(yǎng)基(Invitrogen) 中。
39試劑。阿霉素購自Bedford Laboratories, Bedford, OH。 PEG 化的脂質(zhì)體阿霉素(DOXIL )購自Tibotec Therapeutics, Raritan， NJ。 雞蛋L-a-磷酸卵磷脂(Egg L-a-Phosphatidylcholine， EPC)，氫化雞蛋 L-a-磷酸卵磷月旨(Hydrogenated Chicken Egg L-a-Phosphatidylcholine, HEPC) 、 1,2-雙十八烷酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二 醇)-2000] (1 ，2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Methoxy Polyethylene glycol)-2000]， DSPE- PEG2000)和膽固醇(Choi)均購自 Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL。鹽酸伊立替康(Camptosar)購自 Pharmacia & Upjohn Co. ， Kalamazoo, MI。 卡西霉素(Calcimycin) A23187 和甘油三油酸酯(Triolein)從Sigma (St. Louis, MO)獲得。1，2-二油酰-3-芘癸酰_外消旋_甘油(DPG)從MarkerGene Technologies (Eugene, OR)獲 得。 一組九種純化脂肪酶購自瑞士Fluka。諾維梭狀芽孢桿菌-AT芽孢如 前所述制備(7)。
40脂質(zhì)體制備。HEPC:Chol:DSPE-PEG2,摩爾比為50:45:5的混 合物溶解于氯仿，并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)下干燥成薄膜，然后在真空下進(jìn)一步干 燥2小時。該膜用300 mM MnS04水合，并浸沒在65'C超聲處理浴中
(Bransonic，Danbury,CT)，以形成大的多層脂質(zhì)體(Large Multilamellar Vesicles, MLVs)。這種脂類懸浮物使用Lipex Thermobarrel擠壓機(jī)
(Northern Lipids, Vancouver, BC,力口拿大)通過雙層0.1 um Nuclepore濾 器(Whatman, Florham Park, NJ)擠壓10次。所產(chǎn)生的單一單層脂質(zhì)體
(Single Unilamellar Vesicles, SUV)的膠態(tài)懸浮體被無菌過濾，然后在 4。C使用300mM蔗糖透析，以交換脂質(zhì)體外部環(huán)境。SUV的平均大小為100.2 nm(多分散指數(shù)=0.129)，如使用Malvern Zetasizer 3000(Malvern， Worcestershire, UK)通過準(zhǔn)彈性光散射測定。
41脂質(zhì)體CPT-ll。使用硫酸錳pH梯度裝載法將CPT-11主動填 充到脂質(zhì)體中(24)。伊立替康與脂質(zhì)體以1:3的藥物:脂質(zhì)摩爾比混合， 并在65'C溫育10 min。然后以l嗎卡西霉素:IO |imol脂質(zhì)比率添加卡西 霉素，并在65'C溫育懸浮液45min。然后，將所述填充藥物的脂質(zhì)體無 菌過濾并用300 mM蔗糖在4'C透析，以去除未包囊的CPT-11 。透析在 黑暗中進(jìn)行以最小化藥物的光降解。包囊效率通常>99%，如使用1-丁醇 對脂質(zhì)體破裂以及利用熒光板閱讀器(Fluostar Galaxy, BMG LabTech, GmbH)進(jìn)行熒光測量(在390nm激發(fā)，在460nm發(fā)射)測定。通過參 考CPT-11標(biāo)準(zhǔn)曲線得出濃度。
42動物模型。所有動物實(shí)驗(yàn)由約翰霍普金斯大學(xué)動物福利委員會 (the Animal Welfare Committee of Johns Hopkins University)監(jiān)督禾時比準(zhǔn) 并遵守大學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。購自Harlan Breeders, IN的6到8周齡的小鼠用于腫瘤 移植研究。Balb/c小鼠用于建立CT26腫瘤，無胸腺裸鼠(athymic nu/nu mice)用于建立HCT116異種移植。每實(shí)驗(yàn)組使用最少五只動物。將500 萬個腫瘤細(xì)胞皮下注射至每只小鼠的右肋腹并在隨機(jī)選擇和處理前使其 生長~10天。諾維梭狀芽孢桿菌-AT芽孢以丸尾靜脈注射懸浮在0.2 ml 磷酸鹽緩沖液中的3億芽孢來施用。在相關(guān)組中游離的和含脂質(zhì)體的藥 物在16小時后通過同樣的途徑施用。鹽酸多柔比星、阿霉素、脂質(zhì)體伊 立替康和伊立替康的劑量分別為10 mg/kg和25 mg/kg。腫瘤體積被計(jì)算 為長度x寬度、0.5。
43藥物動力學(xué)研究。在無胸腺裸鼠中建立HCT116異種移植物并 如上所述處理。在處理后不同時間收獲組織樣品，懸浮于70%乙醇、0.3 NHC1中并勻漿(Ultra-Turrax T25 Basic, IKA,NC)以提取阿霉素。離 心后，用熒光板閱讀器(FluoStar Galaxy, BMG LabTech, GmbH)測定上 清液中的阿霉素?zé)晒?在470 nm激發(fā)，在590 nm發(fā)射)。通過參考阿 霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線得出濃度。
44脂質(zhì)體破裂測定。樣品與鹽酸多柔比星混合(在96孔板中100 (il樣品+ 5 ^鹽酸多柔比星或在384孔板中50 ^樣品+2 pl鹽酸多柔比
19星)。使用470 nm處的激發(fā)和590 nm處的發(fā)射，在30-60分鐘內(nèi)，動 力學(xué)測量由釋放阿霉素的去猝滅(d叫uench)引起的熒光增加(5)。所 有測量在37"C在熒光板閱讀器中進(jìn)行。典型的讀數(shù)示于圖Sl中。脂質(zhì)體 破裂活性被定義為釋放曲線的最大斜率。
45生化純化。諾維梭狀芽孢桿菌-iVr芽孢接種于20mlBagadi培 養(yǎng)基(6)中并在厭氧室(A型，Coy Labs, Grass Lake, MI)中于37"C溫 育 16小時。1 ml這種發(fā)酵劑培養(yǎng)物(starter culture)用于接種100 ml已 在厭氧室中預(yù)平衡的Bagadi培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)物生長至對數(shù)后期，隨后 5,000 g離心去除細(xì)菌。上清液用50%飽和硫酸銨在4 "C沉淀1小時，然 后5,000 g離心。棄上清液后，沉淀溶解于TN緩沖液(100 mM Tris-HCl, pH 7.5， 0.1 M NaCl)并無菌過濾。所有隨后的層析都在AKTA Purifier FPLC系統(tǒng)(Amersham Biosciences, Piscataway,NJ)上進(jìn)行。所過濾的樣 品裝填至在TN緩沖液中平衡的單Q 5/50 GL (Amersham)柱。蛋白質(zhì)用由 TN緩沖液和100 mM Tris-HCl 7.5, 1 M NaCl形成的10倍柱體積線性梯度 洗脫。如上所述測定收集組分的阿霉素釋放活性。收集來自單Q柱的兩 種最具活性的組分并裝填至在100 mM Tris-HCl pH 7.5、 0.5MNaCl中平 衡的HiLoad 16/60 Superdex 200 (Amersham)柱上。用超過1.5柱體積的相 同緩沖液無梯度洗脫柱。如上所述測定組分的阿霉素破裂活性。兩種最 具活性組分中的蛋白質(zhì)通過經(jīng)過SDS -聚丙烯酰胺凝膠的電泳進(jìn)行分離， 并使用SilverSNAP染色試劑盒II (Pierce， Rockford， IL)進(jìn)行銀染色。切取 單一顯著條帶45 kD)用于LC/MS/MS分析。
46LC/MS/MS肽分析。使用胰蛋白酶在凝膠中消化切取的蛋白 條帶并對其進(jìn)行如前所述的分析(7)。簡言之，使用Agilent 1100 Series Capillary-LC系統(tǒng)，在5。％緩沖液B中將純化的胰蛋白酶片段注入到 150x0.3 mmVydac反相柱上，以10 (iL/min進(jìn)行5分鐘。緩沖液A (0.1 %乙酸)和B (99.9%乙腈和0.1 %乙酸)用于LC/MS/MS分析的液相層 析(LC)步驟。使用10-65X的緩沖液B梯度，以2 ^L/min的速度，在 90分鐘內(nèi)，將肽從柱上洗脫。使用LCQ DECA XP質(zhì)譜儀(Thermo, MA) 檢測洗脫的肽，該質(zhì)譜儀配有電噴霧電離源、以數(shù)據(jù)依賴型模式操作的 低流量金屬針裝配。該方法由兩種掃描事件組成，即全面掃描和二級數(shù)據(jù)依賴型MS/MS掃描。全面掃描的動態(tài)質(zhì)量范圍設(shè)定在300至3000 m/z。 所產(chǎn)生的MS/MS數(shù)據(jù)依賴型掃描拒絕下述的已知"污染"值371.0、 391.0、 445.0、 462.0、 1221.89、 1321.9、 1421.9、 1521.8、 1521.9、 1621.9、 1721.9和1821.9 m/z。其它方法設(shè)置包括設(shè)定為4的默認(rèn)充電狀態(tài)，帶有 重復(fù)計(jì)數(shù)設(shè)定為2的動態(tài)排除，重復(fù)期間lmin，排除列表大小25和排除 期間3分鐘。所有其它方法參數(shù)都是由Xcaliber軟件v丄2 (Thermo， MA) 設(shè)定的默認(rèn)值。
47寡組氨酸-融合蛋白的克隆。缺乏N-端分泌信號(如SignalP 3.0 預(yù)測)的NT01CX2047編碼序列用Phusion Taq聚合酶(Finnzymes, Espoo， Finland)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用正向引物5'-TGCACCACCACCACCACCA
TTGTCATGG (SEQ ID NO: 3)和反向引物5'-C丁GACCGGTTTATTAT TCAGTTACAGGAAGATTTCTAAGCATTTGAGCC (SEQ ID NO: 4)。 正向引物中的(CAC)6序列在編碼蛋白質(zhì)的N-端增加6個組氨酸殘基。用 」ge I消化這種PCR產(chǎn)物以產(chǎn)生具有一^^粘性末端的插入。用A^e I消化 克隆載體pCR2.1/T7-GFP (Invitrogen， Carlsbad， CA)，使用T4 DNA聚合 酶平端化，然后使用乂gel消化以產(chǎn)生單個粘性末端。連接載體和插入以 產(chǎn)生pLip。通過DNA測序驗(yàn)證預(yù)期的插入序列。
48S127G和S127X變體的克隆。用S"aB I消化pLip質(zhì)粒以切出 含有要被突變的絲氨酸殘基的45bp片段。pLip (S127G)質(zhì)粒是通過平 端連接所消化的質(zhì)粒與45 bp置換雙鏈寡核苷酸產(chǎn)生的，所述雙鏈寡核苷 酸 具 有 序 歹ij 5'-GTAAAGTTCATTT
AATAGGACACGGTCAAGGTGGACAAACTATAC (SEQIDNO:5)。
質(zhì)粒 pLip ( S127X ) 質(zhì)粒是利用雙鏈寡核苷酸 5'-GTAAAGTTCATTTAATAGGACACTAATAAGGTGGACA AACTATAC (SEQIDNO:6)以同樣的方式產(chǎn)生。靶向更替(上面下劃 線處)和插入方向用DNA測序驗(yàn)證。
49蛋白質(zhì)表達(dá)。通過熱休克將如上所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿 菌Rosetta-gami (DE3) pLysS菌株(Novagen, Madison， WI)。每個表達(dá)構(gòu)建 物挑選三個克隆，每個克隆在室溫下在20 ml具有抗生素選擇(100 |ig/ml氨芐青霉素+ 34 |ig/ml氯霉素)的HyperBroth (AthenaES, Baltimore, MD) 培養(yǎng)。作為陰性對照，攜帶pLip質(zhì)粒的細(xì)菌通過在選擇性抗生素不存在 時生長，它們的質(zhì)粒被"消除(cured)"。質(zhì)粒的丟失通過PCR驗(yàn)證。 使用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)1小時，達(dá)到OD6『0.2時，之后，通過離心來沉淀 細(xì)菌并將其懸浮于100mMTris-HCl，pH7.5。裂解液通過在Bioruptor超 聲浴(Diagenode， Belgium)中超聲處理來制備，并進(jìn)行~14,000 g離心以 去除不溶物。使用a-多組氨酸小鼠mAb (R&D Systems, MN)進(jìn)行的蛋白 質(zhì)印跡用于確定期望蛋白質(zhì)的存在。
50脂肪酶分析。EPC三油酸甘油酯:DPG以摩爾比2:5:1在氯仿 中混合并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)下干燥成薄脂質(zhì)膜，然后在高真空下進(jìn)一步干燥2 小時。該膜用100mM甘氨酸緩沖液pH9.5、 19mM脫氧膽酸鈉水合以 產(chǎn)生1 mM的DPG終濃度。劇烈渦旋這種懸浮物以形成用做底物的乳狀 液。在384-孔板中將樣品與該底物混合(30 pl樣品+5 pl樣品)。動力 學(xué)測量由芘癸酸催化釋放引起的熒光增加2小時，使用320nm下的激發(fā) 和405 nm下的發(fā)射。所有測量在37 。C在FluoStar Galaxy熒光板閱讀器 中進(jìn)行。脂肪酶活性單位通過參考洋蔥假單胞菌(i^e"domo"wce;^c7'a) 脂肪酶標(biāo)準(zhǔn)曲線得出。1個單位(unit, U)對應(yīng)相同數(shù)量的洋蔥假單胞 菌脂肪酶活性，其每分鐘從甘油三油酸酯釋放1 pmol油酸。
51脂肪酶平板實(shí)驗(yàn)。將純化的NT01CX2047酶和九種其它純化 的脂肪酶溶解于100 mM Tris-HCl, pH 7.5至濃度為1 mg/ml。用移液管將 50 ^的檢測緩沖液(100mMTris-HClpH7.5 + 0.125MNaC1))加至384-孔板，隨后加入2pl相關(guān)的脂肪酶和1^1鹽酸多柔比星。如上所述重復(fù) 測定樣品的脂質(zhì)體破裂活性。
實(shí)施例2——在第一個模型中體內(nèi)芽孢加脂質(zhì)體
52我們在BALB/c小鼠中使用同系CT26結(jié)直腸腫瘤。靜脈注射 諾維梭狀芽孢桿菌-AT芽孢，并且一旦在腫瘤中開始萌發(fā)(注射后 16小 時)，通過尾靜脈施用10mg/kg單劑量鹽酸多柔比星。鹽酸多柔比星是 包封阿霉素的脂質(zhì)體配制物，阿霉素是一種DNA損傷劑和廣泛使用的化
學(xué)治療藥物。在多種實(shí)驗(yàn)和臨床研究中，脂質(zhì)體包封的阿霉素與未包封
22的阿霉素相比已經(jīng)顯示出產(chǎn)生改進(jìn)的結(jié)果。在鹽酸多柔比星中 的脂質(zhì)體通過peg化進(jìn)行表面修飾以提高其循環(huán)時間(/<§)。如前所記 錄(7h ")，用諾維梭狀芽孢桿菌-at芽孢單獨(dú)治療在腫瘤中央低氧區(qū) 域內(nèi)產(chǎn)生萌發(fā)和壞死，但留下最終再生的充分氧化的可生存邊緣(圖1a)。 單獨(dú)使用阿霉素和鹽酸多柔比星在這些小鼠中都不能產(chǎn)生長期治療效 果。但是，當(dāng)鹽酸多柔比星與諾維梭狀芽孢桿菌-at芽孢組合時，效果顯 著，在所有小鼠中產(chǎn)生完全的腫瘤退化(圖1a)并且其一半以上治愈(圖
ib)。值得注意的是，用相同劑量的諾維梭狀芽孢桿菌-;vr和游離阿霉
素處理的小鼠表現(xiàn)出顯著的發(fā)病率，100%小鼠在2周內(nèi)死亡，這強(qiáng)調(diào)了 脂質(zhì)體包囊在減少全身毒性上的關(guān)鍵作用(18)。
實(shí)施例3——在第二種模型中體內(nèi)芽孢加脂質(zhì)體
53為測定在其它腫瘤模型系統(tǒng)中是否可以觀察到這些明顯的抗腫 瘤效果，我們用相同方法處理在裸鼠中生長的人結(jié)直腸癌異種移植物 [hct116]。如圖1c和1d所示，諾維梭狀芽孢桿菌-at芽孢與鹽酸多柔 比星組合使用時，導(dǎo)致腫瘤hct116腫瘤退化，類似于在ct26腫瘤中觀 察到的結(jié)果。在這些腫瘤模型中使用的脂質(zhì)體阿霉素劑量與目前用于臨 床治療癌癥患者的那些劑量相匹配(i9-")。
實(shí)施例4——體內(nèi)鹽酸多柔比星分布
54在上所述實(shí)驗(yàn)中觀察到的協(xié)同效應(yīng)推測是由于諾維梭狀芽孢桿 菌-at感染導(dǎo)致阿霉素在腫瘤內(nèi)的濃度增加。為證實(shí)這一推測，比較僅接 受鹽酸多柔比星的小鼠和用鹽酸多柔比星加諾維梭狀芽孢桿菌-at芽孢 處理的小鼠體內(nèi)的阿霉素的分布。如圖2a所示，在諾維梭狀芽孢桿菌-at 存在下施用鹽酸多柔比星時，阿霉素的腫瘤內(nèi)濃度有顯著增加。相反， 在存在或缺乏芽孢的情況下，在心臟、肝、脾、腎和肌肉中的阿霉素水 平相似(圖2a)。在感染腫瘤內(nèi)發(fā)現(xiàn)的阿霉素已從脂質(zhì)體釋放并結(jié)合到 腫瘤細(xì)胞核，如免疫熒光顯示(圖2b)。注意，以前顯示常規(guī)治療腫瘤 內(nèi)阿霉素濃度，在施用鹽酸多柔比星后比施用阿霉素后更高且更穩(wěn)定 (22)。實(shí)際上，在不增加正常組織中藥物濃度的情況下，施用諾維梭狀芽孢桿菌-AT芽孢加鹽酸多柔比星引起的腫瘤藥物暴露與同等劑量的
游離阿霉素所實(shí)現(xiàn)的腫瘤藥物暴露相比，具有大于ioo倍的增加。
實(shí)施例5——可能的脂質(zhì)體破裂因子的嘗試性鑒定
55我們下一步試圖鑒定解釋在注射鹽酸多柔比星后諾維梭狀芽孢 桿菌-AT在腫瘤中釋放阿霉素能力的機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)通過諾維梭狀芽孢桿 菌-AT生長而調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基含有強(qiáng)大的脂質(zhì)體破裂因子，并且這種因子的 濃度在對數(shù)后期為最大值(圖6)。我們預(yù)測該因子是磷脂酶，因?yàn)橐阎?這些酶破壞脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙層以及紅細(xì)胞的脂質(zhì)雙層(/7)。兩種磷脂 酶C酶已從諾維梭狀芽孢桿菌純化，并且其中一種具有溶血活性("-乃)。 所述諾維梭狀芽孢桿菌-AAr基因組包含四個預(yù)測編碼磷脂酶的基因(2(5)。 這四個基因(NT01CX0979)中的一個編碼在生長細(xì)菌中高水平表達(dá)的 (26)細(xì)胞外磷脂酶C蛋白(a， Z5)。
56迄今為止因?yàn)橐呀?jīng)證實(shí)諾維梭狀芽孢桿菌-ivr排斥通過外源
DNA的轉(zhuǎn)化，我們采取不同的策略來測試脂質(zhì)體破裂因子是磷脂酶C NT01CX0979的假設(shè)。在MNNG-介導(dǎo)的誘變后，我們在血瓊脂平板上平 板接種 10,000個細(xì)菌，并鑒定一個可繁殖地缺乏溶血活性的菌落。通過 DNA測序證明該克隆在NT01CX0979磷脂酶C基因內(nèi)具有971G>A的轉(zhuǎn) 換，導(dǎo)致相當(dāng)保守的甘氨酸向谷氨酰胺的突變(25)。意料不到的是， 這種溶血陰性克隆的生長培養(yǎng)基保持其脂質(zhì)體破裂活性，這說明這種活 性不是NT01CX0979的結(jié)果，或者實(shí)際上是足以溶血的任何其它酶的結(jié) 果。
實(shí)施例6——脂質(zhì)體破裂因子及其編碼序列的鑒定
57為了鑒定脂質(zhì)體破裂因子，我們通過硫酸銨沉淀、離子交換層
析和凝膠過濾的組合分離來自對數(shù)晚期諾維梭狀芽孢桿菌-wr的培養(yǎng)基。
觀察到脂質(zhì)體破裂活性的單一主峰(圖3A、 B) 。 SDS-聚丙烯酰胺凝膠 電泳顯示在活性成分中的主要銀染色條帶(圖3C)。純化該條帶，用胰 蛋白酶消化并用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。利用諾維梭狀芽孢桿菌-AT基因 組作為參考，發(fā)現(xiàn)該多肽由NT01CX2047編碼，NT01CX2047是一種假定的脂肪酶。這兩種在諾維梭狀芽孢桿菌-ivr基因組中鑒定的細(xì)胞外脂肪
酶(NT01CX0630和NT01CX2047)互相之間(47%的氨基酸同一性) 或與其它細(xì)菌中最接近的相似物(與破傷風(fēng)梭菌脂肪酶具有50~55%的氨 基酸同一性)不具有高度同源性。對作為NT01CX2047產(chǎn)物的脂質(zhì)體破 裂因子的鑒定與來自諾維梭狀芽孢桿菌-A^基因組分析的信息一致，這顯 示出NT01CX2047優(yōu)先在對數(shù)晚期表達(dá)，預(yù)測其將在細(xì)胞外，并且用諾 維梭狀芽孢桿菌-AT感染后在腫瘤中高度表達(dá)(2(5)。
實(shí)施例7——脂質(zhì)體破裂因子的ORF的克隆
58為了檢測通過NT01CX2047編碼的蛋白質(zhì)的性質(zhì)，我們克隆 其ORF至誘導(dǎo)表達(dá)載體中，然后將該表達(dá)載體引入遺傳修飾的大腸桿菌 菌株以允許諾維梭狀芽孢桿菌-AT基因的表達(dá)(其具有與大腸桿菌差別很 大的密碼子使用)。通過IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)后，轉(zhuǎn)化的大腸桿菌生長不 佳，推測是因?yàn)榛虍a(chǎn)物有毒。通過l,2-二油酰-3-芘癸酰-外消旋-甘油的 水解進(jìn)行測量來測試來自這些細(xì)胞的裂解液的脂肪酶活性。表達(dá) NT01CX2047的克隆顯示出脂肪酶活性，而消除載體的克隆(見下文) 沒有顯示(圖4B)。作為進(jìn)一步的對照，產(chǎn)生127位氨基酸處的絲氨酸 殘基用終止密碼子置換的衍生物(S127X)。我們還產(chǎn)生了其中在127位殘 基處的絲氨酸被甘氨酸置換的突變體(S127G)。發(fā)現(xiàn)S127位于高度保 守的GXSXG脂肪酶基序內(nèi)，并預(yù)測其是負(fù)責(zé)脂酶活性的主要催化絲氨 酸(27)。因此，S127G錯義突變體和S127X截?cái)嗤蛔凅w都缺乏脂酶活 性，雖然每種突變型均產(chǎn)生相似數(shù)量的NT01CX2047多肽(圖4A、 B)。 有趣的是，非催化S127G突變體表現(xiàn)出與野生型NT01CX2047 —樣差的 生長，而S127X突變體的生長要有力得多。不具備脂酶活性的S127G突 變體的明顯毒性令人費(fèi)解，但其通過下述實(shí)驗(yàn)進(jìn)行說明。
實(shí)施例8——脂肪酶活性和脂質(zhì)體破裂活性的基因分離
59為了測試如上所述裂解液的脂質(zhì)體破裂活性，我們將它們與脂 質(zhì)體阿霉素共溫育。在該試驗(yàn)中，含有NT01CX2047野生型形式的菌株 具有有效活性(圖4C)。當(dāng)在無選擇性抗生素的情況下培養(yǎng)該菌株直至細(xì)菌通過隨機(jī)分離丟失表達(dá)載體時，脂質(zhì)體破裂活性消失(圖4C)。此
外，已丟失質(zhì)粒的細(xì)胞能夠如同其親本大腸桿菌和S127X突變體一樣有 力生長。如所預(yù)期的，S127X截?cái)嗤蛔凅w沒有可檢測的脂質(zhì)體破裂活性 (圖4C)。然而，意料不到的是，缺乏脂肪酶活性的S127G突變體保留 了基本的脂質(zhì)體破裂活性(圖4C)。為了測定破壞脂質(zhì)體的能力是否是 諾維梭狀芽孢桿菌-^r的NT01CX2047脂肪酶特定的，我們測試了 9種 具有明確脂肪酶活性的商用酶的脂質(zhì)體破裂活性，它們都不具有顯著的 脂質(zhì)體破裂活性(圖4D)。
實(shí)施例9——帶有其他藥劑的脂質(zhì)體也有效 —
60因此，我們測試含有CPT-ll (伊立替康)的脂質(zhì)體，CPT-ll 是一種異構(gòu)酶抑制劑，類似阿霉素，其被廣泛用于癌癥治療。單劑量的 脂質(zhì)體CPT-ll單獨(dú)或在施用諾維梭狀芽孢桿菌-iVr后16小時注射，正 如在所述鹽酸多柔比星實(shí)驗(yàn)中。當(dāng)單獨(dú)注射時，兩種腫瘤類型(同系小 鼠中的CT26和裸鼠中的人結(jié)直腸癌細(xì)胞異種移植物)對脂質(zhì)體CPT-ll 具有相對抗性。但是，在芽孢存在情況下，所有腫瘤退化并在>60%的小 鼠中實(shí)現(xiàn)長期治愈(圖5)。
61同樣值得注意的是在這些和所述脂質(zhì)體阿霉素實(shí)驗(yàn)中，脂質(zhì)體 酶策略在小腫瘤以及大腫瘤中是有效的，在體積小至136 mir^的腫瘤中 觀察到治愈。在以前的研究中，證明小腫瘤對溶菌治療具有抗性，因?yàn)?在小腫瘤內(nèi)具有相對小的壞死區(qū)域(n)。我們猜想脂質(zhì)體藥物和諾維
梭狀芽孢桿菌-AT芽孢組合的有效性是因?yàn)樗鼈儽舜讼嗷ピ鰪?qiáng):通過EPR 效應(yīng)在腫瘤中積累的細(xì)胞毒性藥物導(dǎo)致壞死和缺氧，這導(dǎo)致諾維梭狀芽 孢桿菌-ivr的萌發(fā)，這進(jìn)而導(dǎo)致通過脂質(zhì)體酶的更多藥物釋放。
62在腫瘤內(nèi)阿霉素從鹽酸多柔比星的部分釋放(圖2)理論上可 能是由于從諾維梭狀芽孢桿菌-AT或感染的腫瘤細(xì)胞釋放的其它酶。但 是，分泌自諾維梭狀芽孢桿菌-AT的主要鹽酸多柔比星破裂因子是脂質(zhì)體 酶(圖3)，并且其基因在感染腫瘤中高水平表達(dá)(2(5)，這表明脂質(zhì)體 酶明顯有助于體內(nèi)作用。此外，現(xiàn)在已鑒定并克隆脂質(zhì)體酶，它可以被 納入其它抗癌藥物策略中。這些策略包括癌癥基因治療，其使用病毒或非病毒遞送系統(tǒng)和抗體介導(dǎo)的酶前體藥物治療(L 4, 3/, 。在過
去，這類方法受限于可用前體藥物的量小和獲得在細(xì)胞中代謝的藥物以
對其它腫瘤細(xì)胞發(fā)揮旁觀者效應(yīng)的必要性(3h 32)。利用脂質(zhì)體酶， 種類繁多的"前體藥物"已經(jīng)商業(yè)可得，因?yàn)榭杀话庠谥|(zhì)體內(nèi)的任 何化學(xué)治療藥物在理論上均可使用。也可以設(shè)想多藥物治療——其中每 種藥物在單獨(dú)的脂質(zhì)體中結(jié)合。最后，因?yàn)橹|(zhì)體酶被分泌并且脂質(zhì)體 在腫瘤細(xì)胞外部，所以基本的旁觀者效應(yīng)是可以預(yù)期的。
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所引用的每篇參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容于此明確引入。
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28
權(quán)利要求
1. 組合物，其包括毒素缺陷型諾維梭狀芽孢桿菌芽孢；和脂質(zhì)體，其包含抗腫瘤藥物或生物制劑。
2. 組合物，其包括依照SEQ ID NO: 1或依照在GXSXG脂肪酶基序的殘基160-164處具 有置換突變的SEQ ID NO: 1的毒素缺陷型諾維梭狀芽孢桿菌脂質(zhì)體酶； 和脂質(zhì)體，其包含抗腫瘤藥物或生物制劑。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述組合物在體內(nèi)形成。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述抗腫瘤藥物或生物 制劑是阿霉素。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述抗腫瘤藥物或生物 制劑是伊立替康。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述抗腫瘤藥物或生物 制劑是抗體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述抗腫瘤藥物或生物 制劑是多核苷酸。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述抗腫瘤藥物或生物 制劑是在病毒載體中的多核苷酸。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述抗腫瘤藥物或生物 制劑是在非病毒載體中的多核苷酸。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述抗腫瘤藥物或生物 制劑是蛋白質(zhì)。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述抗腫瘤藥物或生物 制劑是細(xì)胞因子。
12. 試劑盒，其包括依照SEQ ID NO: 1或依照在GXSXG脂肪酶基序的殘基160-164處 具有置換突變的SEQ ID NO: 1的毒素缺陷型諾維梭狀芽孢桿菌脂質(zhì)體 酶；禾口脂質(zhì)體，其包含抗腫瘤藥物或生物制劑。
13. 試劑盒，其包括 毒素缺陷型諾維梭狀芽孢桿菌芽孢；禾口 包括抗腫瘤藥物或生物制劑的脂質(zhì)體。
14. 根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的試劑盒，其中所述抗腫瘤藥物或生 物制劑是阿霉素。
15. 根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的試劑盒，其中所述抗腫瘤藥物或生 物制劑是伊立替康。
16. 根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的試劑盒，其中所述抗腫瘤藥物或生 物制劑是抗體。
17. 根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的試劑盒，其中所述抗腫瘤藥物或生 物制劑是多核苷酸。
18. 根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的試劑盒，其中所述抗腫瘤藥物或生 物制劑是在病毒載體中的多核苷酸。
19. 根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的試劑盒，其中所述抗腫瘤藥物或生物制劑是在非病毒載體中的多核苷酸。
20. 治療癌癥患者的方法，其包括向癌癥患者施用第一種藥劑和第二種藥劑，所述第一種藥劑是毒素缺 陷型諾維梭狀芽孢桿菌芽孢，所述第二種藥劑是包含抗腫瘤藥物或生物 制劑的脂質(zhì)體，藉此所述腫瘤退化或其生長被減慢或被抑制。
21. 治療癌癥患者的方法，其包括向癌癥患者施用第一種藥劑和第二種藥劑，所述第一種藥劑是依照SEQ ID NO: 1或依照在GXSXG脂肪酶基序的殘基160-164處具有置換 突變的SEQ ID NO: 1的毒素缺陷型諾維梭狀芽孢桿菌脂質(zhì)體酶，所述第 二種藥劑是包含抗腫瘤藥物或生物制劑的脂質(zhì)體，藉此所述腫瘤退化或 其生長被減慢或被抑制。
22. 治療癌癥患者的方法，其包括向癌癥患者施用第一種藥劑和第二種藥劑，所述第一種藥劑是載體， 該載體編碼依照SEQ ID NO: 1或依照在GXSXG脂肪酶基序的殘基 160-164處具有置換突變的SEQ ID NO: 1的毒素缺陷型諾維梭狀芽孢桿 菌脂質(zhì)體酶，所述第二種藥劑是包括抗腫瘤藥物或生物制劑的脂質(zhì)體， 藉此所述腫瘤退化或其生長被減慢或被抑制。
23. 根據(jù)權(quán)利要求20、 21或22所述的方法，其中所述第一種藥劑和 所述第二種藥劑被順序施用。
24. 根據(jù)權(quán)利要求20、 21或22所述的方法，其中所述第一種藥劑和 所述第二種藥劑被同時施用。
25. 根據(jù)權(quán)利要求20、 21或22所述的方法，其中所述抗腫瘤藥物或 生物制劑是阿霉素。
26. 根據(jù)權(quán)利要求20、 生物制劑是伊立替康。
27. 根據(jù)權(quán)利要求20、 生物制劑是抗體。
28. 根據(jù)權(quán)利要求20、 生物制劑是多核苷酸。21或22所述的方法， 21或22所述的方法， 21或22所述的方法，其中所述抗腫瘤藥物或 其中所述抗腫瘤藥物或 其中所述抗腫瘤藥物或 其中所述抗腫瘤藥物或
29.根據(jù)權(quán)利要求20、 21或22所述的方法， 生物制劑是在病毒載體中的多核苷酸。
30. 根據(jù)權(quán)利要求20、 21或22所述的方法，其中所述抗腫瘤藥物或 生物制劑是在非病毒載體中的多核苷酸。
31. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述載體是病毒載體。
32. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述載體是非病毒載體。
33. 組合物，其包括依照SEQ ID NO: 1或依照在GXSXG脂肪酶基 序的殘基160-164處具有置換突變的SEQ ID NO: 1的分離的和純化的毒 素缺陷型諾維梭狀芽孢桿菌脂質(zhì)體酶蛋白質(zhì)。
34. 結(jié)合蛋白質(zhì)，其包括依照SEQ ID NO: 1或依照在GXSXG脂肪酶基序的殘基160-164處具 有置換突變的SEQ ID NO: 1的毒素缺陷型諾維梭狀芽孢桿菌脂質(zhì)體酶蛋 白質(zhì)；和多肽配體，其在腫瘤細(xì)胞上與受體結(jié)合。
35. 根據(jù)權(quán)利要求34所述的結(jié)合蛋白質(zhì)，其中所述多肽配體是抗體 的重鏈或輕鏈可變區(qū)。
36. 根據(jù)權(quán)利要求34所述的結(jié)合蛋白質(zhì)，其進(jìn)一步包括在所述脂質(zhì) 體酶蛋白質(zhì)與所述多肽配體之間的連接肽。
37. 根據(jù)權(quán)利要求34所述的結(jié)合蛋白質(zhì)，其中所述多肽配體包括抗 體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。
38. 根據(jù)權(quán)利要求37所述的結(jié)合蛋白質(zhì)，其包括在所述重鏈可變區(qū) 與所述輕鏈可變區(qū)之間的連接肽。
39. 根據(jù)權(quán)利要求34所述的結(jié)合蛋白質(zhì)，其是翻譯后結(jié)合的。
40. 根據(jù)權(quán)利要求34所述的結(jié)合蛋白質(zhì)，其作為單一多肽鏈被翻譯。
41. 多核苷酸，其編碼根據(jù)權(quán)利要求40所述的結(jié)合蛋白質(zhì)。
42. 組合物，其包括分離的和純化的多核苷酸，所述多核苷酸編碼依 照SEQ ID NO: 1或依照在GXSXG脂肪酶基序的殘基160-164處具有置 換突變的SEQ ID NO: 1的毒素缺陷型諾維梭狀芽孢桿菌脂質(zhì)體酶蛋白 質(zhì)。
43. 根據(jù)權(quán)利要求42所述的組合物，其中所述多核苷酸包括依照SEQ IDNO:2的核苷酸序列。
44. 根據(jù)權(quán)利要求42所述的組合物，其中所述多核苷酸包括載體。
45. 根據(jù)權(quán)利要求42所述的組合物，其中所述多核苷酸包括病毒載體。
46. 根據(jù)權(quán)利要求42所述的組合物，其中所述多核苷酸包括非病毒 載體。
47. 根據(jù)權(quán)利要求42所述的組合物，其中所述多核苷酸包括啟動子， 其在腫瘤中的轉(zhuǎn)錄活性比在正常組織中高出至少兩倍。
全文摘要
諾維梭狀芽孢桿菌(Clostridium novyi)是一種專性厭氧菌，其可以感染實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤內(nèi)的低氧區(qū)域。我們發(fā)現(xiàn)用諾維梭狀芽孢桿菌(C.novyi)加單劑量脂質(zhì)體阿霉素治療時，具有大的已建立腫瘤的小鼠通常被治愈。負(fù)責(zé)這種現(xiàn)象的分泌因子已被鑒定，并且意料不到的是，證實(shí)其是脂肪酶家族的成員。編碼被稱為脂質(zhì)體酶(liposomase)的蛋白質(zhì)的基因具有被引入不同的治療方法用以向腫瘤特異性地提供各種化學(xué)治療劑的潛力。
文檔編號A61K48/00GK101489593SQ200780027001
公開日2009年7月22日 申請日期2007年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月19日
發(fā)明者B·沃戈?duì)査跪v, I·鄭, K·W·金澤勒, S·周 申請人:約翰·霍普金斯大學(xué)