專(zhuān)利名稱(chēng)：阿德福韋酯耐藥變異檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)個(gè)體阿德福 韋酯耐藥變異遺傳的試劑盒，通過(guò)檢測(cè)阿德福韋酯用藥靶向位點(diǎn)基因多態(tài)性來(lái)評(píng)估個(gè)體阿 德福韋酯物耐藥性。
背景技術(shù)：
阿德福韋酯是阿德福韋的親脂性口服前體，其腸道吸收率和生物利用度都較高， 口服后在非特異性酯酶水解作用下迅速轉(zhuǎn)化為阿德福韋。阿德福韋是一種無(wú)環(huán)單磷酸脫氧 腺苷類(lèi)似物，在體內(nèi)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為有活性的雙磷酸阿德福韋而起抗病毒作用。實(shí)驗(yàn)研究和 臨床試驗(yàn)都證明阿德福韋酯可迅速降低乙肝病毒DNA的濃度，減輕肝臟組織的病變。長(zhǎng)期使用阿德福韋酯可誘導(dǎo)乙肝病毒變異，并產(chǎn)生耐藥性，使血清中已經(jīng)轉(zhuǎn)陰的 乙肝病毒DNA重新出現(xiàn)，甚至伴有病情復(fù)發(fā)。目前已知的阿德福韋酯耐藥主要原因?yàn)閞tN236T位點(diǎn)變異。rtN236T變異則是由 P基因第836位堿基A到C點(diǎn)突變引起，即發(fā)生了堿基間氫鍵的變化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種檢測(cè)個(gè)體阿德福韋酯耐藥變異遺傳的試劑盒。該試劑盒包括檢測(cè)阿德福韋酯耐藥變異位點(diǎn)P基因rtN236T位點(diǎn)多態(tài)性的特異 性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)，Taq酶，dNTP混合液，MgCl2溶液，反應(yīng)緩沖液，去離子水。本試劑盒中所述的特異性引物和熒光探針對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是能 夠輕易完成設(shè)計(jì)的，特異性引物和熒光探針對(duì)可用常規(guī)的DNA合成技術(shù)進(jìn)行合成。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn) 方法，通常按照常規(guī)條件，或按照廠(chǎng)商所建議的條件。實(shí)施例檢測(cè)試劑盒的使用步驟1:DNA模板的抽取用硅膠吸附法抽提口腔上皮細(xì)胞的基因組DNA。步驟2 熒光定量PCR反應(yīng)使用檢測(cè)試劑盒中的熒光定量PCR套裝，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)的體系為總 體積10 μ 1，包含濃度為20ng/ μ 1的DNA模板2 μ 1、1 μ 1 IOX熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、 0. 1 μ 1 25mM dNTP 混合液、0. 6 μ 1 25mMMgCl2 溶液、0. 025 μ 1 (5units/ μ 1) Taq DNA 聚合 酶、20 μ M的有義引物和反義引物各0. 225 μ 1、10 μ M的帶VIC熒光探針和帶FAM熒光探針 各0. 25μ 1，去離子水5. 325 μ 1。在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為50°C、2分鐘，95°C、10分鐘，進(jìn)行60個(gè)循環(huán) 的95°C、30秒，60°C、1分鐘。反應(yīng)結(jié)束后在熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量。
步驟4:基因型分析根據(jù)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)標(biāo)示的基因分型圖示對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因型分析。熟悉熒光定量PCR技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過(guò)辨識(shí)熒光定量PCR儀上顯示 的最終樣品熒光量，根據(jù)不同序列探針熒光信號(hào)的強(qiáng)弱即可確定所檢測(cè)的SNP位點(diǎn)的基因 型。
權(quán)利要求
1. 一種檢測(cè)個(gè)體阿德福韋酯耐藥變異遺傳的試劑盒，包括特異性引物對(duì)及特異性熒光 探針對(duì)，Taq酶，dNTP混合液，MgCl2溶液，熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液和去離子水，其特征在 于所述的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)是針對(duì)檢測(cè)P基因rtN236T位點(diǎn)多態(tài)性設(shè)計(jì) 的。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)個(gè)體阿德福韋酯耐藥變異遺傳的試劑盒。該試劑盒包括檢測(cè)阿德福韋酯耐藥變異位點(diǎn)P基因rtN236T位點(diǎn)多態(tài)性的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)、熒光定量PCR常規(guī)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過(guò)檢測(cè)P基因rtN236T位點(diǎn)多態(tài)性來(lái)評(píng)估個(gè)體阿德福韋酯耐藥性。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102108391SQ20091020049
公開(kāi)日2011年6月29日 申請(qǐng)日期2009年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月23日
發(fā)明者馮哲民, 賀憲民, 鄒祖燁 申請(qǐng)人:上海主健生物工程有限公司