五環(huán)三萜類化合物在制備usp7抑制劑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域，更具體地講，涉及五環(huán)三萜類化合物在制備USP7抑制劑中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]泛素化作為一種動(dòng)態(tài)、可逆的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)及膜轉(zhuǎn)運(yùn)等細(xì)胞過程中扮演著重要角色。泛素化(ubiquitylat1n)是介導(dǎo)蛋白質(zhì)降解的重要方式之一，它通過將泛素(ubiquitin，Ub)結(jié)合到靶蛋白上，形成多聚泛素鏈，被蛋白酶體識(shí)別，引起蛋白質(zhì)降解。其逆過程，即去泛素化是由去泛素化蛋白酶(Deubiquitinating enzyme，DUBs)所介導(dǎo)的。其中，泛素特異性蛋白酶(ubiquitinspecific proteases，USPs)家族在DUBs中數(shù)量最多，研究也最為深入。研究顯示，USPs參與了細(xì)胞周期調(diào)控、信號(hào)傳導(dǎo)、免疫應(yīng)答、DNA修復(fù)等多種細(xì)胞生命活動(dòng)。近年來，在腫瘤研究方面，已發(fā)現(xiàn)多種USPs與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。其中，USP7(也被稱為HAUSP，herpeSvirus-associated ubiqui tin-specific protease)已經(jīng)成為新興的腫瘤治療革巴標(biāo)。
[0003]已有的研究結(jié)果表明，USP7對(duì)多種重要的腫瘤相關(guān)蛋白如p53、PTEN、F0X04等，都具有調(diào)控作用。其中，P53是腫瘤抑制因子中的研究熱點(diǎn)。USP7可以將p53的負(fù)調(diào)控蛋白如MDM2、MDM4等去泛素化，使p53負(fù)調(diào)控蛋白的細(xì)胞內(nèi)水平增加，進(jìn)而導(dǎo)致p53的細(xì)胞內(nèi)水平下降，活性降低，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活。因此，抑制USP7的活性，可以升高p53的細(xì)胞內(nèi)水平，進(jìn)而促使癌細(xì)胞凋亡。目前研究發(fā)現(xiàn)，USP7在前列腺癌、多發(fā)性骨髓瘤等癌細(xì)胞中存在過度表達(dá)的情況，且這種過度表達(dá)與腫瘤的發(fā)生直接相關(guān)。
[0004]由于USP7在導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程中的關(guān)鍵作用，發(fā)展USP7選擇性抑制劑日益受到人們的重視。目前已經(jīng)報(bào)道的USP7抑制劑均屬于有機(jī)小分子抑制劑，按照抑制劑的分子結(jié)構(gòu)可以分為四類:氰基茚并吡嗪類、吡咯酮類、9-氯四氫吖啶酰胺類及噻吩類，其代表性化合物及其對(duì)USP7的抑制效果如圖1所示。前三類小分子抑制劑由法國(guó)Hybrigenics醫(yī)藥公司研發(fā)，其代表化合物分別為化合物I (HBX41108)、化合物2、化合物3(HBX28258)。其中HBX41108是首個(gè)報(bào)道的USP7抑制劑，其對(duì)USP7的EC5q達(dá)到了0.4ymol/L。然而，HBX41108的選擇性較差，它對(duì)USP家族的其他成員(如USP8等)也有強(qiáng)的抑制作用。第四類以噻吩結(jié)構(gòu)為母核的小分子抑制劑是由專門致力于泛素通路研究的美國(guó)Progenra公司研發(fā)的，這種此類小分子抑制劑對(duì)USP7具有最優(yōu)的選擇性，其代表化合物為化合物4(P5091)。研究表明，P5091只對(duì)USP7(EC5Q = 4.2ymol/L)和與其結(jié)構(gòu)最接近的USP47(EC5Q = 4.3ymol/L)具有抑制活性，而對(duì)USP2、USP8等其他的DUBs基本沒有影響。Progenra公司的研究人員還對(duì)P5091進(jìn)行了結(jié)構(gòu)改造和構(gòu)效關(guān)系分析，其衍生物可以進(jìn)一步提高對(duì)USP7的抑制效果。但是此類小分子抑制劑也存在一定的缺陷:首先，噻吩類小分子抑制劑與USP7蛋白的具體結(jié)合模式及相互作用機(jī)制并不清楚;其次，此類小分子抑制劑依然無法區(qū)分USP7與USP47，其選擇性有待進(jìn)一步提高;最后，此類小分子抑制劑在生物體內(nèi)的穩(wěn)定性較差，在一定程度上影響了其在細(xì)胞水平的抑制效果。綜上所訴，USP7選擇性抑制劑的發(fā)現(xiàn)已成為當(dāng)前抗腫瘤藥物開發(fā)中的一個(gè)熱點(diǎn)，國(guó)際上多家醫(yī)藥公司和學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)紛紛開始投入大量人力物力開展這方面的研究。然而國(guó)內(nèi)尚未有USP7選擇性抑制劑報(bào)道。
[0005]五環(huán)三萜類化合物及其衍生物廣泛存在于自然界的植物當(dāng)中，并具有廣泛的抗炎、抗腫瘤、抗病毒等生物活性。近年來，五環(huán)三萜類化合物在抗腫瘤藥物的篩選中獲得了不少有活性的化合物，而且這些化合物抗腫瘤作用呈現(xiàn)多部位、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，既能使藥物長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)發(fā)揮效力，又能使患者帶瘤生存時(shí)間延長(zhǎng)，使其有望成為新一代的抗腫瘤藥物。五環(huán)三萜類化合物的抗腫瘤作用機(jī)制研究目前已經(jīng)被廣泛研究，受到越來越多的科研工作者重視。
[0006]本發(fā)明通過對(duì)大量天然五環(huán)三萜類化合物對(duì)USP7抑制效果的篩選發(fā)現(xiàn)熊果酸等天然五環(huán)三萜類化合物對(duì)USP7具有明顯的抑制活性。此類新型的USP7抑制劑具有新穎的分子骨架結(jié)構(gòu)。細(xì)胞水平的研究顯示熊果酸可以在癌細(xì)胞內(nèi)有效抑制USP7的活性，進(jìn)而上調(diào)p53，最終誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供五環(huán)三萜類化合物在制備USP7抑制劑中的應(yīng)用。
[0008]為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明公開以下技術(shù)方案:五環(huán)三萜類化合物在制備USP7抑制劑中的應(yīng)用。
[0009]作為一個(gè)優(yōu)選方案，所述五環(huán)三萜類化合物包括熊果酸、齊墩果酸、樺木酸、科羅索酸、常春藤皂甙元和扁塑藤素中的一種或幾種。
[0010]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:USP7可以調(diào)控重要的腫瘤抑制因子，在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。設(shè)計(jì)優(yōu)化具有高活性高選擇性的USP7小分子抑制劑，有利于新型抗腫瘤藥物的開發(fā)以及更為全面的理解與USP7相關(guān)的多種腫瘤的發(fā)生機(jī)理。當(dāng)前國(guó)際范圍內(nèi)，已有多種USP7小分子抑制劑被報(bào)道，但是其中還有諸多不足亟待解決，如選擇性不高、缺乏抑制劑與靶標(biāo)蛋白結(jié)合模式的研究、抑制效果有待提高等等。本發(fā)明公開的五環(huán)三萜類化合物是一類全新的USP7小分子抑制劑，其中熊果酸等天然五環(huán)三萜類小分子更是已經(jīng)廣泛地用作醫(yī)藥原料以及抗腫瘤研究當(dāng)中，這一研究對(duì)于開拓熊果酸等天然五環(huán)三萜類小分子應(yīng)用范圍，進(jìn)一步了解此類小分子化合物抑制腫瘤的作用機(jī)制有重要?jiǎng)?chuàng)新意義，同時(shí)也為開發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的以USP7為靶標(biāo)的創(chuàng)新藥物奠定先導(dǎo)化合物基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0011]圖1USP7抑制劑的分子結(jié)構(gòu)及其對(duì)USP7的抑制效果。
[0012]圖2天然五環(huán)三萜類化合物的分子結(jié)構(gòu)及其對(duì)USP7的抑制效果。
[0013]圖3計(jì)算機(jī)模擬熊果酸與USP7晶體結(jié)構(gòu)(PDBID:4M5W)的對(duì)接結(jié)果。
[0014]圖4(A)使用CETSA(cellular thermal shift assay)的方法驗(yàn)證熊果酸在細(xì)胞內(nèi)是否可以直接與USP7相結(jié)合:實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，熊果酸可以提高USP7在高溫下的穩(wěn)定性，證明熊果酸在細(xì)胞內(nèi)直接作用于USP7; (B)熊果酸對(duì)H08910細(xì)胞的增值抑制效果；(C) (D)卵巢癌細(xì)胞H08910經(jīng)CDDO-Me處理后，western blot檢測(cè)所示蛋白水平。
[0015]圖5熊果酸對(duì)USP7及USP47的抑制效果。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合具體實(shí)施例，