專利名稱：大青葉中4(3h)喹唑酮的微波提取工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥學(xué)領(lǐng)域，尤其是中藥有效成分提取方法。
背景技術(shù)：
大青葉是我國(guó)的傳統(tǒng)中藥，為十字花科植物菘藍(lán)(Isatis idigotica Fort)的干燥葉，其化學(xué)成分主要有有機(jī)酸、靛藍(lán)、靛玉紅、菘藍(lán)苷、色胺酮、4 (3H)喹唑酮、異牡荊素等化合物。具有清熱解毒，涼血利咽的功效，現(xiàn)代藥理研究表明具有抗菌、抗癌、抗病毒、增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)的作用。臨床上則用作治療各種病毒性流行感冒、乙型腦炎、單純皰疹病毒性角膜炎、流行性腮腺炎和病毒性肝炎等感染性疾病。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，大青葉有效成分4 (3H)喹唑酮具有抗病毒的作用，濃度為0.2%時(shí)，可抑制1(T流感病毒；濃度為O. 1%時(shí)，可抑制克薩奇病毒；濃度在10—3_10—5mol/L范圍內(nèi)，可顯著促進(jìn)脾細(xì)胞增殖及刀豆蛋白誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖。
中藥有效成分提取常用的傳統(tǒng)方法有水煎法、滲漉法、回流提取法、連續(xù)回流提取法等，但這些方法均存在有效成分提取率低、能耗高、提取時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)。微波提取法是利用微波能來(lái)提高提取效率的一種最新發(fā)展起來(lái)的技術(shù)，與傳統(tǒng)提取方法相比，具有設(shè)備簡(jiǎn)單、使用范圍廣、提取效率高、重現(xiàn)性好、節(jié)約時(shí)間、節(jié)省試劑、污染小等特點(diǎn)。
微波提取法是利用微波熱能來(lái)提高提取效率的一種新技術(shù)，即利用物質(zhì)分子偶極振動(dòng)同微波振動(dòng)具有相似的頻率，在快速振動(dòng)的微波場(chǎng)中，分子的偶極振動(dòng)盡力同磁場(chǎng)振動(dòng)匹配，而分子偶極振動(dòng)又往往滯后于磁場(chǎng)，物質(zhì)分子吸收電磁能以每秒數(shù)十億次的高速振動(dòng)而產(chǎn)生熱能。 一方面，它可使永久偶極的分子產(chǎn)生高達(dá)4.9Xl(f次/s的共振頻率，使分子平均動(dòng)能迅速增加。另一方面，離子化的物質(zhì)在超高頻電磁場(chǎng)中超高速運(yùn)動(dòng)，因摩擦而產(chǎn)生熱效率。因此，微波對(duì)物質(zhì)的加熱是從物質(zhì)分子中進(jìn)行的，又稱為"內(nèi)加熱"。在中藥的有效成分提取中，微波具有很強(qiáng)的穿透力，可以在藥材顆粒內(nèi)外同時(shí)均勻、迅速地加熱。同時(shí)，中藥材細(xì)胞吸收微波能后，細(xì)胞內(nèi)部溫度迅速上升，其細(xì)胞內(nèi)部液態(tài)水汽化產(chǎn)生壓力將細(xì)胞膜和細(xì)胞壁沖破，形成微小孔洞，使細(xì)胞外溶劑更容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，加速溶解并釋放出有效成分。大大縮短了提取時(shí)間，提高了提取效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的為提供從大青葉中提取4 (3H)喹唑酮的微波提取工藝，公開(kāi)對(duì)微波提取工藝起決定作用的幾個(gè)因素藥材粉碎粒度、提取溶劑的濃度、微波輻射時(shí)間和溶劑倍量。
實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下
大青葉中4 (3H)喹唑酮的微波提取工藝，將大青葉粉碎為20 — 80目粒度，用30 — 70%體積濃度乙醇溶液作為提取液，溶劑用量為大青葉原料重量的8 — 20倍，微波爐中微波輸出功率為120W時(shí)輻照8 — 20分鐘進(jìn)行提取。
優(yōu)選的工藝為將大青葉粉碎為40目，用50%體積濃度乙醇溶液作為提取液，用量為大青葉重量的10倍，在微波爐中微波輸出功率為120W時(shí)輻照10分鐘。
用上述方法提取的大青葉中4 (3H)喹唑酮的含量用RP-HPLC法進(jìn)行分析。
試驗(yàn)過(guò)程如下
1、 儀器與試藥1.1儀器
高效液相色譜儀(美國(guó)瓦里安公司)；25"1微量進(jìn)樣器(寧波市鎮(zhèn)海玻璃儀器廠)；色譜柱；symmetry C18 (4. 6X 150咖5u m) (Waters corporation);格蘭仕微波爐(P70D20TL—D5)。
1.2試藥
4 (3H)喹唑酮對(duì)照品(上海至誠(chéng)醫(yī)藥基礎(chǔ)科技發(fā)展有限公司)，甲醇(色譜純)，乙腈(色譜純)，三蒸水，其它試劑均為分析純。大青葉購(gòu)自蘭州市安寧醫(yī)藥公司(產(chǎn)于甘肅定西)。
2、 方法與結(jié)果
2. 1對(duì)照品溶液的制備
精密稱取4 (3H)喹唑酮對(duì)照品2mg,用甲醇定容于50ml容量瓶中，作為儲(chǔ)備液(濃度為40ug/ml)。然后，分別配成O. 5ug/ml、 lwg/ml、 2yg/ml、 4ug/ml、 8 u g/ml五個(gè)濃度的對(duì)照品溶液。2. 2供試品溶液的制備
精密稱取大青葉粉末15g，置于圓底燒瓶中，加入提取液浸泡12h。然后進(jìn)行微波提取， 提取液過(guò)濾濃縮至無(wú)醇味，用PH為2的酸水回流提取，靜置過(guò)夜，過(guò)濾除去不溶于酸的雜質(zhì)， 然后用氯仿萃取，除去脂溶性雜質(zhì)，用氨水將酸水母液調(diào)至pH為9，濃縮制得浸膏。精密稱 取制得的浸膏0.5g，用甲醉定容于25ml容量瓶，作為供試品溶液，備用。
2. 3 4 (3H)喹唑酮含量測(cè)定
2.3.1色譜條件流動(dòng)相乙腈甲醇水=5: 15: 80，測(cè)定波長(zhǎng)225nm,流速0. 8ml/min， 進(jìn)樣量20u 1。
2.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出回 歸方程為y= IX 107x—15867， R2=0. 9998。結(jié)果表明4 (3H)喹唑酮濃度在0. 5 — 8 y g/ml范 圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。見(jiàn)表l、圖l。
表l對(duì)照品濃度和峰面積4 (3H)喹唑酮對(duì)照品濃度(進(jìn)樣20nl)測(cè)得平均峰面積
0. 5 u g/ml83908
1 U g/ml188067
2 li g/ml362476
4 u g/ml759174
8 u g/ral1545470
2.3.3精密度試驗(yàn)取同一對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積，分別為
1520888、 1553731、 1505470、 1555978、 1513926， RSD為1,68X。
2.3.4穩(wěn)定性試驗(yàn)將對(duì)照品溶液在室溫(20 — 25X:)下保存一周，每天測(cè)定峰面積分別為 1520888、 1569537、 1535648、 1555440、 1485164、 1535224、 1501112，結(jié)果表明穩(wěn)定性良好， 無(wú)明顯變化，RSD為1.92%。
2. 3. 5加樣回收率試驗(yàn)稱取藥材樣品3份，每份15g，分別精密添加己知濃度的對(duì)照品適量,
5按樣品提取和含量測(cè)定方法操作，平均回收率為97.93%， RSD為1.54X。見(jiàn)表2。
表2加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果_
大青葉中4 (3H)喹唑加入40u g/ml對(duì)照測(cè)得4 (3H)喹唑
編號(hào) 回收率/%_酮含量/lig/ml_品溶液/ml_酮含量/y g/ml_
1 55.2 5 67.25 98.90
2 55.2 5 65.41 96.19
3 55.2 5 67.12 98.71
2.3.6大青葉中4 (3H)喹唑酮含量的測(cè)定分別稱取相應(yīng)藥材粒度(過(guò)20、 40、 80目篩)的大青葉各三份，每份15g，按正交實(shí)驗(yàn)編號(hào)。按2.2制備供試品溶液，取供試品溶液2ml，0.45um微孔濾膜濾過(guò)，按正交實(shí)驗(yàn)號(hào)分別進(jìn)樣20ul測(cè)定含量。見(jiàn)圖2、圖3。
2.3.7正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)選用了對(duì)提取率有影響的四個(gè)因素(藥材粒度、提取溶劑濃度、微波輻射時(shí)間、溶劑倍量)，考慮三個(gè)水平，以L (3"正交表進(jìn)行試驗(yàn)分析。見(jiàn)表3、表4、表5。
表3正交試驗(yàn)影響因素水平表_
_^_
水平 J_^_^_p_
藥材粒度/目 乙醇濃度/% 微波時(shí)間/min 溶劑倍量
1 20 30 10 10
2 40 50 15 15
3 80 70 20 20
6表4 U (34)正交試驗(yàn)結(jié)果
實(shí)驗(yàn)號(hào)ABCD大青葉中4 (3H)喹唑酮含量/
W g/g
1111129,8
2122221. 14
3133317.05
421239. 57
5223155. 2
6231240. 24
7313213.37
8321328.43
9332134.48
Ki67. 9952. 7498. 47119. 48
K2105. 01104. 7765. 1974. 75
E =249. 28
K376. 2891. 7785.6255. 05
R12. 3417. 3411.0918. 14
表5方差分析結(jié)果
方差來(lái)源 離均差平方和 自由度 均方_^_^_
A 251.6242 2 125.8121 1.3400 〉0.05
B 488.8291 2 244.4146 2.6031 〉0.05
C (誤差) 187.7851 2 93.8926
D_726. 6765_^_363. 3383 3. 8697 〉0. 05注Fo.05 (2' 2) =19，F(xiàn)o.oi (2, 2) =99
由表4、表5結(jié)果表明，大青葉中4 (3H)喹唑酮含量采用微波提取方法時(shí)，各因素對(duì)4(3H)喹唑酮提取影響的大小為D〉B〉A(chǔ)〉C，其中因素D各水平間具有顯著性差異。在本實(shí)驗(yàn)條件下微波提取工藝的最佳組合是A2B2CA，即藥材粒度40目、50%乙醇、微波輻射時(shí)間lOmin、IO倍量溶劑為優(yōu)，其余各因素采用的試驗(yàn)水平都能提取到4 (3H)喹唑酮。
試驗(yàn)結(jié)果表明，溶劑倍量，提取溶劑濃度是微波提取工藝的主要影響因素，對(duì)4 (3H)喹唑酮的提取有顯著差異。在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，考慮試劑生產(chǎn)成本，最佳提取條件是AACJX,即藥材粒度40目、50%乙醇、微波輻射時(shí)間lOmin、 IO倍量提取溶劑為優(yōu)。
本發(fā)明的有益效果
1、 最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)表明，分別稱取3份大青葉藥材，按照最佳組合提取工藝進(jìn)行提取，結(jié)果3份藥材中4 (3H)喹唑酮的含量分別為55. 26ug/g, 56.26pg/g， 53. 81 u g/g， RSD=2.24%。說(shuō)明本工藝用微波提取4 (3H)喹唑酮是完全可行的。
2、 本發(fā)明提取效率高，提取速度快，節(jié)省時(shí)間，能耗少。
3、 節(jié)省試劑，成本低，污染少。


圖1為本發(fā)明4(3H)喹唑酮含量色譜分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖
圖2為4(3H)喹唑酮對(duì)照品色譜圖
圖3為樣品中4(3H)喹唑酮色譜圖
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
稱取大青葉15g，粉碎為20目粉末，置于圓底燒瓶中，加入體積濃度為30%的乙醇溶液作為提取液，用量為120ml，浸泡12h，然后在微波輸出功率為700W爐中，采用底火功率，即輸出功率為17%， g卩 120W微波提取8min，提取液過(guò)濾，濃縮至無(wú)醇味，用pH為2的鹽酸溶液回流提取，靜置過(guò)夜，過(guò)濾，除去不溶于酸的雜質(zhì)，然后再用氯仿萃取，除去脂溶性雜質(zhì)，用氨水將酸度調(diào)至PH9，濃縮制得含有4(3H)喹唑酮的浸膏。實(shí)施例2
稱取大青葉15g，粉碎為40目粉末，置于圓底燒瓶中，加入體積濃度為50%的乙醇溶液 作為提取液，用量為150ml，浸泡12h，然后微波提取10min，以下步驟與實(shí)施例1相同，制 得含有4(3H)喹唑酮的浸膏。
實(shí)施例3
稱取大青葉15g，粉碎為40目粉末，置于圓底燒瓶中，加入體積濃度為70%的乙醇溶液
作為提取液，用量為225ral，浸泡12h，然后微波提取20min，以下步驟與實(shí)施例1相同，制
得含有4(3H)喹唑酮的浸膏。 實(shí)施例4
稱取大青葉15g，粉碎為80目粉末，置于圓底燒瓶中，加入體積濃度為50%的乙醇溶液 作為提取液，用量為300ml，浸泡12h，然后微波提取15min,以下步驟與實(shí)施例1相同，制 得含有4(3H)喹唑酮的浸膏。
9
權(quán)利要求
1、大青葉中4(3H)喹唑酮的微波提取工藝，其特征為將大青葉粉碎為20—80目粒度，用30—70％體積濃度乙醇溶液作為提取液，用量為大青葉原料重量的8—20倍，在微波爐中微波輸出功率為120W時(shí)輻照8—20分鐘進(jìn)行提取。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的大青葉中4 (3H)喹唑酮的微波提取工藝，其特征為將大青葉 粉碎為40目，用50%體積濃度乙醇溶液作為提取液，提取溶劑用量為大青葉重量的IO倍， 在微波爐中微波輸出功率為120W時(shí)輻照10分鐘。
全文摘要
本發(fā)明為大青葉中4(3H)喹唑酮的微波提取工藝，涉及中藥的有效成分提取方法，傳統(tǒng)的水煎、滲漉、回流提取等方法存在著有效成分提取率低、能耗高，提取時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)。本發(fā)明采用微波能進(jìn)行提取，公開(kāi)了下列影響提取效率的重要因素的范圍提取時(shí)大青葉粉碎粒度為20-80目，用30-70％體積濃度的乙醇溶液作為提取液，用量為大青葉重量的8-20倍，在微波中微波輸出功率為120W時(shí)輻照8-20分鐘進(jìn)行微波提取，本發(fā)明具有提取效率高、能耗少，節(jié)省試劑，成本低，污染小的有益效果。
文檔編號(hào)C07D239/88GK101486685SQ20081000117
公開(kāi)日2009年7月22日 申請(qǐng)日期2008年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月18日
發(fā)明者宇 劉, 華蘭英, 梁劍平, 王學(xué)紅, 王曙陽(yáng), 濤 許, 郭志延, 恒 魏 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所