專利名稱：：血紅蛋白的偶聯(lián)物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種血紅蛋白的偶聯(lián)物，尤其涉及血紅蛋白與人血清白蛋白的偶聯(lián)物用作血液代用品，以及該偶聯(lián)物的制備方法。
背景技術(shù)：
：輸血對于臨床手術(shù)、抗災(zāi)和戰(zhàn)場救護(hù)是不可缺少的醫(yī)療手段?？咳双I(xiàn)血不僅面臨血源短缺問題，而且由于血型復(fù)雜，輸血必須進(jìn)行嚴(yán)格的配型，同時(shí)血液要低溫儲存，保存期短，運(yùn)輸不便，更為嚴(yán)重的是肝炎、艾滋病等病毒的污染使輸血安全受到威脅。近年來，血液需求量不斷增高，而安全有效的血源卻日益緊缺。因此，近幾十年來人血液代用品一直是國際科學(xué)界和企業(yè)界關(guān)注的研究開發(fā)熱點(diǎn)。人血液代用品(humanbloodsubstitutes)，即人紅細(xì)胞代用品(humanredcellsubstitutes)，是具有氧傳遞功能、維持血液滲透壓和酸堿平衡及擴(kuò)充容量的人工制劑。理想的血液代用品要求具有天然紅細(xì)胞的傳遞氧功能、生物相容性、安全性和穩(wěn)定性。其具有廣泛的應(yīng)用前景，不僅能用于和平時(shí)期和戰(zhàn)爭時(shí)期用于臨床外科、急性貧血、和大量出血的治療之外，也可用于各種疾病的治療，如圍術(shù)期常規(guī)使用、創(chuàng)傷治療、血液稀釋、局部缺血組織的灌流、敗血癥休克、多種抗體病人、腫瘤治療等?，F(xiàn)有的人血液代用品主要包括有機(jī)化學(xué)合成的高分子全氟碳化合物類和生物技術(shù)制備的血紅蛋白類及紅細(xì)胞類血液代用品。其中由于全氟碳化合物不具備天然血紅蛋白的生物學(xué)載氧特性，其研究與開發(fā)已不再是重點(diǎn)；通過血型轉(zhuǎn)換成的紅細(xì)胞具有貯存期短、不易運(yùn)輸?shù)热秉c(diǎn)，其研究與應(yīng)用也受到極大的限制；而來源于紅細(xì)胞本身的血紅蛋白(Hb)具有高效的載氧能力和維持膠體滲透壓的功能，當(dāng)前各國都將研制以血紅蛋白為基質(zhì)的攜氧劑作為主攻方向，主要包括化學(xué)修飾血紅蛋白以及脂質(zhì)體包封血紅蛋白和其它包含血紅蛋白的微膠囊(WinslowRM.Hemoglobin-basedredcellsubstitute.TheJohnHopkinsUniversityPress，BaltimoreandLondon.199239)。無基質(zhì)血紅蛋白在體內(nèi)易氧化或解離成單體和二聚體而引起腎毒性，并且存在氧親和性高、循環(huán)半壽期短、膠體滲透壓高等缺陷，采用化學(xué)修飾法實(shí)現(xiàn)血紅蛋白分子內(nèi)交聯(lián)并提高血紅蛋白分子量可在一定程度上解決這些問題。血紅蛋白分子由4個(gè)亞基組成，分子內(nèi)交聯(lián)增強(qiáng)了四聚體的穩(wěn)定性，提高血紅蛋白的分子量可使其不易直接透過腎而被循環(huán)代謝掉，從而延長其在體內(nèi)的循環(huán)半壽期。但并非所有的化學(xué)偶聯(lián)均能降低血紅蛋白的免疫原性。因此修飾要求一方面提高血紅蛋白分子量，消除產(chǎn)品在體內(nèi)代謝過程中的腎毒性副作用，另一方面修飾還要保持血紅蛋白的生物學(xué)活性，消除產(chǎn)品的免疫原性。目前常用的幾種血紅蛋白修飾方法有血紅蛋白自身聚合(RauschCW，GawrylMS，LightWRetal.Stablepolymerizedhemoglobinblood-substitute.EP1093720.2001-04-25)，血紅蛋白表面修飾大分子多聚物如PEG(DavisF，NHOK，ZALIPSKYS.Chemicallymodifiedhemoglobinasaneffective，stablenon-immunogenicredbloodcellsubstitute.US5234903.1993-08-10)，以及血紅蛋白與多糖或蛋白偶聯(lián)(AdamsonGJ.Hemoglobin-polysaccharideconjugates.US6500930.2002-11.31)雖然目前所研制的血液代用品很少具有天然血液的缺點(diǎn)，但還沒有一種血液代用品具有血液的全部優(yōu)點(diǎn)。就目前的研究水平看，血液代用品仍存在許多問題尚未解決，其中重要的是血液代用品的安全性和有效性等問題。血液代用品存在一些副作用(如血管收縮和高血壓)限制了它們的應(yīng)用，特別是用于有各種疾病的老年人身上。其次是產(chǎn)品在體內(nèi)循環(huán)中存留時(shí)間短(短則幾小時(shí)，最長壽命為70幾小時(shí)，而天然紅細(xì)胞的壽命則為120天)，只能提供短期的供氧功能，且與正常的血液功能差距較大。人血清白蛋白(HSA)分子量67,000，是血漿的主要蛋白質(zhì)，在人體內(nèi)具有維持血液滲透壓和攜帶血液中多種配基(包括脂肪酸、氨基酸、類固醇、金屬離子及藥物)與組織進(jìn)行交換等生理功能，并能攜帶膽紅素等積累性毒性物質(zhì)從而具有解毒功能。在醫(yī)療上人血清白蛋白作為重要的臨床藥物用于手術(shù)輸血和危重病人補(bǔ)液。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種血紅蛋白與人血清白蛋白的偶聯(lián)物。本發(fā)明的偶聯(lián)物用作血液代用品具有載氧、維持滲透壓及運(yùn)輸營養(yǎng)成分的較完全的血液的功能。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供血紅蛋白與人血清白蛋白偶聯(lián)物的制備方法。本發(fā)明的血紅蛋白與人血清白蛋白的偶聯(lián)物優(yōu)選分子量分布在100KD～300KD之間。偶聯(lián)物中血紅蛋白分子數(shù)目為1～3個(gè)，優(yōu)選為1～2個(gè)，人血清白蛋白分子數(shù)目為1～3個(gè)，優(yōu)選為1個(gè)。偶聯(lián)物中血紅蛋白是分子內(nèi)交聯(lián)或未分子內(nèi)交聯(lián)的血紅蛋白，優(yōu)選為分子內(nèi)交聯(lián)的血紅蛋白。本發(fā)明偶聯(lián)物的血紅蛋白來自于人或其它哺乳動(dòng)物，優(yōu)選為豬、牛、羊、馬、狗的血紅細(xì)胞。本發(fā)明的血紅蛋白與人血清白蛋白的偶聯(lián)物的制備方法，包括無基質(zhì)血紅蛋白的制備、血紅蛋白與人血清白蛋白的偶聯(lián)以及偶聯(lián)產(chǎn)物的純化。其中無基質(zhì)血紅蛋白的制備可以采用本領(lǐng)域公知的制備電泳純或色譜純無基質(zhì)血紅蛋白的方法。優(yōu)選使用膜過濾和離子交換層析集成純化血紅蛋白，得到電泳純或色譜純的無基質(zhì)血紅蛋白。將洗凈的紅細(xì)胞在低滲透壓下溶脹破裂(DocziJ.Injectablestromafreehemoglobinanditsmethodofmanufacture.1976，US3991181)，得到的紅細(xì)胞裂解液經(jīng)0.22～0.65μm膜微濾，再經(jīng)10～30KD膜超過濾，優(yōu)選為0.45μm膜微濾，再經(jīng)30KD膜超過濾進(jìn)行預(yù)處理。所得血紅蛋白溶液經(jīng)透過式陰離子交換層析進(jìn)一步純化，層析介質(zhì)優(yōu)選為DEAESepharoseFastFlow、QMASpherosilLS、QSepharoseBigBeads(Amershamphamacia，Sweden)，層析采用pH值為6.6～8.5，優(yōu)選為pH值為7.0～7.8的磷酸緩沖液，緩沖液濃度為10mM～100mM，優(yōu)選為20～50mM。采用PEG伴隨式層析，選擇PEG400～PEG4000，濃度為0.25％～10％，優(yōu)選為0.5～5％，層析的回收率大于95％。純化各單元的操作溫度為4～10℃。得到用于與人血清白蛋白交聯(lián)。本發(fā)明采用的偶聯(lián)劑是與蛋白質(zhì)氨基、巰基或羥基反應(yīng)的雙功能交聯(lián)劑，優(yōu)選為帶有醛基、琥珀酰亞胺(NHS)基團(tuán)、環(huán)氧基團(tuán)、馬來酰亞胺基團(tuán)、亞胺酸酯基團(tuán)的同型或異性雙功能交聯(lián)劑。本發(fā)明的人血清白蛋白與血紅蛋白偶聯(lián)的方法，可以是液相一步偶聯(lián)法或兩步偶聯(lián)法，或采用將蛋白質(zhì)吸附在固相介質(zhì)上進(jìn)行偶聯(lián)的方法。一步偶聯(lián)方法將蛋白質(zhì)溶于pH6～12，優(yōu)選為pH7.5～9.5的磷酸、HEPES、硼酸、硼砂-氫氧化鈉或碳酸鈉緩沖溶液中，蛋白質(zhì)濃度為1～150mg/ml，優(yōu)選蛋白質(zhì)濃度為10～100mg/ml，加入交聯(lián)劑，交聯(lián)劑與蛋白質(zhì)的摩爾比為3∶1～600∶1，優(yōu)選為10∶1～200∶1，控制反應(yīng)溫度4～55℃，優(yōu)選為25～37℃，反應(yīng)時(shí)間0.1～48小時(shí)，優(yōu)選為0.5～10小時(shí)。兩步交聯(lián)方法先活化血紅蛋白或先活化人血清白蛋白，將其溶于pH6～12，優(yōu)選為pH7.0～9.5的磷酸、HEPES、硼酸、硼砂-氫氧化鈉或碳酸鈉緩沖溶液中，蛋白質(zhì)濃度為1～150mg/ml，優(yōu)選蛋白質(zhì)濃度為5-60mg/ml，控制反應(yīng)溫度4～55℃之間，優(yōu)選為25～37℃，加入交聯(lián)劑，交聯(lián)劑與蛋白質(zhì)的摩爾比為3∶1～600∶1，優(yōu)選為10∶1～500∶1，反應(yīng)時(shí)間0.1～48小時(shí)，優(yōu)選為0.5～10小時(shí)。交聯(lián)劑與血紅蛋白或人血清白蛋白的活性基團(tuán)反應(yīng)(該活性基團(tuán)可以為巰基或氨基)后，過SephadexG～25脫鹽柱或低溫透析脫修飾劑，同時(shí)調(diào)節(jié)緩沖液pH值，使pH與第一步反應(yīng)pH相同或不同，但其pH范圍仍為6～12，優(yōu)選為7.5～9.5，再等量加入另一種蛋白，使交聯(lián)劑與其活性基團(tuán)(該活性基團(tuán)可以為巰基或氨基)再繼續(xù)反應(yīng)1～48小時(shí)。固相介質(zhì)上的偶聯(lián)介質(zhì)選用陰離子交換介質(zhì)或陽離子交換介質(zhì)，優(yōu)選為DEAESepharoseFastFlow、QSepharoseBigBeads、QSepharoseFastFlow、SPSepharoseFastFlow以及CMSepharoseFastFlow(Amershamphamacia，Sweden)。用50mMpH4.0～8.5，優(yōu)選為pH4.5～7.5的磷酸鹽或HEPES緩沖液平衡層析介質(zhì)，加入0.5～5mg/ml的血紅蛋白或人血清白蛋白溶液，使蛋白質(zhì)首先吸附在介質(zhì)上。再加入交聯(lián)劑，使交聯(lián)劑與蛋白質(zhì)的摩爾比為30∶1～600∶1，優(yōu)選為10∶1～500∶1，反應(yīng)時(shí)間0.1～12小時(shí)，優(yōu)選為0.5～10小時(shí)。用上述平衡緩沖液洗柱除去過量的交聯(lián)劑后，再用含有0.5MNaCl的該緩沖液將帶有交聯(lián)劑的活化的蛋白質(zhì)洗脫，收集蛋白峰。經(jīng)SephadexG-25凝膠過濾柱，脫去溶液中的NaCl。收集含蛋白的洗脫液，超過濾濃縮至蛋白濃度為1～5mg/ml，加入等摩爾的另外一種蛋白質(zhì)，同時(shí)調(diào)節(jié)緩沖液pH值，使pH與第一步反應(yīng)pH相同或不同，其pH范圍仍為6～12，優(yōu)選為7.5～9.5，使活化的蛋白質(zhì)交聯(lián)劑與另外一種蛋白質(zhì)活性基團(tuán)(該活性基團(tuán)可以為巰基或氨基)再繼續(xù)反應(yīng)1～24小時(shí)，可以得到血紅蛋白與人血清白蛋白摩爾比為1∶1的偶聯(lián)物。本發(fā)明制備的偶聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行純化時(shí)，優(yōu)選的方法選自離子交換層析、超過濾和凝膠過濾層析純化，可以是其中的任一種方法，二種或三種方法同時(shí)使用。除去未發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)及分子量大于300KD和小于100KD的成分。將純化后的偶聯(lián)產(chǎn)物pH值調(diào)至7.4，對于受2，3-二磷酸甘油酸影響的血紅蛋白，需要向溶液中加入2，3-DPG或磷酸吡哆醛等調(diào)節(jié)血紅蛋白氧親和力的共價(jià)調(diào)節(jié)劑。終產(chǎn)品其具有良好的血液代用品的特性。將血紅蛋白與人血清白蛋白偶聯(lián)制備血液代用品的優(yōu)勢非常明顯。一方面，血紅蛋白是主要的載氧蛋白質(zhì)，白蛋白能夠維持血液滲透壓，運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)，攜帶膽紅素等積累性毒性物質(zhì)從而具有解毒功能，因此該新型血液代用品與現(xiàn)有的血液代用品相比，將具有更完全的血液的功能。另一方面，偶聯(lián)人血清白蛋白大大增加血紅蛋白的分子量，同時(shí)進(jìn)行的分子內(nèi)交聯(lián)可增強(qiáng)四聚體的穩(wěn)定性，并且HSA在體內(nèi)顯負(fù)電性，由于電荷作用不易透過膜，這樣更進(jìn)一步延長了偶聯(lián)物在體內(nèi)的循環(huán)半壽期。并且更容易形成分子量較均一的的交聯(lián)產(chǎn)物，避免多聚體的聚集，消除腎毒副作用。更重要的是，不同于其它動(dòng)物的血清白蛋白，來源于人的血清白蛋白不會(huì)產(chǎn)生免疫原性，若與動(dòng)物血紅蛋白偶聯(lián)，還會(huì)在很大程度上減弱或消除異體的血紅蛋白輸入人體內(nèi)造成的免疫原性。因此本發(fā)明采取來自于人或豬、牛、馬、羊、狗等動(dòng)物的血紅蛋白與人血清白蛋白偶聯(lián)的方式，制備一種安全有效的新型血液代用品。圖1A為血紅蛋白溶脹破裂液電泳掃描圖譜圖1B為純化后的血紅蛋白電泳掃描圖譜圖2為純化后的血紅蛋白高效凝膠過濾液相色譜色譜柱為TSK3000SW，檢測波長280nm圖3為DEAESepharoseFastFlow陰離子交換法分離純化偶聯(lián)物圖4為Superdex200凝膠過濾法鑒定偶聯(lián)物a為離子交換法收集的蛋白峰上凝膠過濾柱b為反應(yīng)混合物上凝膠過濾柱圖5為SDS-PAGE鑒定偶聯(lián)物圖譜1為標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白，2為偶聯(lián)物，3為標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白，4為純化的無基質(zhì)血紅蛋白圖6為偶聯(lián)產(chǎn)物的載氧活性圖7偶聯(lián)產(chǎn)物的高效凝膠過濾色譜8失血性休克大鼠存活情況具體實(shí)施方式實(shí)施例1電泳純無基質(zhì)牛血紅蛋白的制備取一定體積洗凈的新鮮牛血紅細(xì)胞，用兩倍體積的冷溶脹液(含0.6％NaCl的20mmol/LKH2PO4/Na2HPO4(PBS)緩沖液，pH7.4)懸浮，4℃振蕩1h；以每分鐘溶液總體積10％的速度泵入2倍紅細(xì)胞體積的20mmol/LPBS緩沖液(pH7.4)，振蕩1h后調(diào)NaCl鹽濃度為0.9％，即得血紅細(xì)胞溶脹破裂液。采用MilliporePellicon錯(cuò)流膜過濾系統(tǒng)對破裂液進(jìn)行預(yù)處理。先采用0.22μm膜微濾去除細(xì)胞碎片及大分子雜質(zhì)，再進(jìn)一步用截留分子量10KD的膜超過濾除去小分子雜質(zhì)。所得血紅蛋白溶液經(jīng)DEAESepharoseFastFlow陰離子交換層析進(jìn)一步純化。采用PEG伴隨式層析，用含有5％PEG400的20mM磷酸緩沖液，調(diào)節(jié)pH值為7.4進(jìn)行層析，收集透過的血紅蛋白峰經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測為一條帶(圖1A和B)。層析的回收率為97％。操作溫度為10℃。用HEMOX血?dú)夥治鰞x檢測純化后的血紅蛋白的50％氧飽和度(P50)為25.6mmHg，Hill系數(shù)為2.41。實(shí)施例2色譜純無基質(zhì)豬血紅蛋白的制備取一定體積洗凈的新鮮豬血紅細(xì)胞，用兩倍體積的冷溶脹液(含0.6％NaCl的20mmol/LKH2PO4/Na2HPO4(PBS)緩沖液，pH7.4)懸浮，4℃振蕩1h；以每分鐘溶液總體積10％的速度泵入2倍紅細(xì)胞體積的20mmol/LPBS緩沖液(pH7.4)，振蕩1h后調(diào)NaCl鹽濃度為0.9％，即得血紅細(xì)胞溶脹破裂液。采用MilliporePellicon錯(cuò)流膜過濾系統(tǒng)對破裂液進(jìn)行預(yù)處理。先采用0.45μm膜微濾去除細(xì)胞碎片及大分子雜質(zhì)，再進(jìn)一步用截留分子量30KD的膜超過濾除去小分子雜質(zhì)。所得血紅蛋白溶液經(jīng)QSepharoseBigBeads陰離子交換層析進(jìn)一步純化。操作溫度為4℃。采用PEG伴隨式層析，用含有0.5％PEG4000的20mM磷酸緩沖液，采用10mM的磷酸緩沖液，調(diào)節(jié)pH值為7.8進(jìn)行層析，收集透過的血紅蛋白峰經(jīng)高效凝膠過濾液相色譜(HPLC)檢測為單峰(圖2)，層析的回收率為95％。實(shí)施例3間-馬來酰亞胺苯甲酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)一步交聯(lián)人血紅蛋白與人血清白蛋白由于HSA分子的巰基基團(tuán)會(huì)與MBS反應(yīng)，從而影響偶聯(lián)反應(yīng)。因此，在用MBS活化HSA前需要封閉剩余的巰基。向10ml的5mg/mlHSA溶液(pH7.8的HEPES緩沖液)緩慢加入0.2ml的30mM碘代乙酰胺，室溫下反應(yīng)20分鐘。隨后加入0.5ml的30mMMBS溶液(溶于二甲基甲酰胺)，室溫下反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)混合液通過SephadexG-25凝膠過濾柱，除去過量的MBS和碘代乙酰胺，收集蛋白組分。因血紅蛋白分子有反應(yīng)活性的巰基基團(tuán)(β-93半胱氨酸的巰基)，活化的HSA可直接與血紅蛋白分子反應(yīng)。收集的蛋白組分與10ml的20mg/ml血紅蛋白溶液分別充氮?dú)?小時(shí)，混合后在氮?dú)獗Ｗo(hù)下于室溫反應(yīng)2小時(shí)。隨后，加入0.2ml的30mM碘乙酰胺來終止偶聯(lián)反應(yīng)。實(shí)施例4乙二醇二縮水甘油醚兩步法交聯(lián)羊血紅蛋白與人血清白蛋白血紅蛋白濃度60mg/ml，溶液體系為pH7.5的50mM的HEPES緩沖液、溶液總體系為10ml，乙二醇二縮水甘油醚與血紅蛋白摩爾比為500∶1，37℃水浴搖床反應(yīng)10小時(shí)，通過SephadexG-25凝膠過濾除修飾劑，換緩沖液為pH9.5的50mM的硼砂-氫氧化鈉緩沖液，按血紅蛋白∶白蛋白＝3∶1(摩爾比)加入白蛋白，37℃水浴搖床反應(yīng)48小時(shí)。交聯(lián)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果顯示有83kD和97kD條帶生成。血紅蛋白單亞基分子量約為16kD，白蛋白分子量為67kD，83kD為單個(gè)血紅蛋白亞基與血清白蛋白的交聯(lián)物，97kD為交聯(lián)的兩個(gè)血紅蛋白亞基與一個(gè)血清白蛋白的偶聯(lián)物。說明生成了血紅蛋白與血清白蛋白的偶聯(lián)物。實(shí)施例5戊二醛兩步法交聯(lián)狗血紅蛋白與人血清白蛋白白蛋白濃度1mg/ml，溶液體系為pH7.0的50mM的HEPES緩沖液、溶液總體系為10ml，戊二醛與白蛋白摩爾比為100∶1，37℃水浴搖床反應(yīng)1小時(shí)，通過SephadexG-25凝膠過濾除修飾劑，換緩沖液為pH8.5的50mM的硼酸-硼砂緩沖液，按血紅蛋白∶白蛋白＝1∶3加入血紅蛋白，37℃水浴搖床反應(yīng)10小時(shí)。交聯(lián)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果顯示有83kD條帶生成。血紅蛋白單亞基分子量約為16kD，白蛋白分子量為67kD，83kD為單個(gè)血紅蛋白亞基與血清白蛋白的交聯(lián)物，說明生成了血紅蛋白與血清白蛋白的偶聯(lián)物。實(shí)施例6乙醇醛固相交聯(lián)馬血紅蛋白與人血清白蛋白用50mMHEPES緩沖液(pH6.6)平衡5mlQSepharoseFastFlow介質(zhì)，與10ml的2mg/ml血清白蛋白溶液混合，使蛋白吸附在介質(zhì)上。加入乙醇醛，其與蛋白質(zhì)的摩爾比為500∶1，混勻后在10℃下靜置，并將柱封住。2小時(shí)后用300ml50mMHEPES緩沖液(pH6.6)洗柱，隨后改用含有0.5MNaCl的50mMHEPES緩沖液(pH6.6)洗脫，收集蛋白峰。收集物隨后上用50mMHEPES緩沖液(pH6.6)平衡的SephadexG-25凝膠過濾柱，脫去溶液中的NaCl。收集含蛋白的洗脫液，超過濾濃縮至蛋白濃度為5mg/ml，加入等摩爾的血紅蛋白，同時(shí)調(diào)節(jié)緩沖液pH值9.5，使活化的白蛋白所帶交聯(lián)劑與血紅蛋白再繼續(xù)反應(yīng)24小時(shí)，得到兩種蛋白質(zhì)的偶聯(lián)物。實(shí)施例7戊二醛固相交聯(lián)牛血紅蛋白與人血清白蛋白用50mM磷酸緩沖液(pH8.0)平衡5mlDEAESepharoseFastFlow介質(zhì)，與10ml的5mg/ml血紅蛋白溶液混合，使蛋白吸附在介質(zhì)上。加入交聯(lián)劑戊二醛，其與蛋白質(zhì)的摩爾比為10∶1，混勻后在4℃下靜置，并將柱封住，血紅蛋白在戊二醛的作用下分子內(nèi)交聯(lián)同時(shí)帶上具有反應(yīng)活性端的交聯(lián)劑。0.5小時(shí)后用300ml50mM磷酸緩沖液(pH8.0)洗柱，隨后改用含有0.5MNaCl的50mMHEPES緩沖液(pH8.0)洗脫，收集蛋白峰。收集物隨后上用50mMHEPES緩沖液(pH8.0)平衡的SephadexG-25凝膠過濾柱，脫去溶液中的NaCl。收集含蛋白的洗脫液，超過濾濃縮至蛋白濃度為1mg/ml，加入等摩爾的白蛋白，緩沖液pH值仍為8.0，使活化的血紅蛋白的戊二醛醛基與白蛋白再繼續(xù)反應(yīng)8小時(shí)，得到兩種蛋白質(zhì)的偶聯(lián)物。實(shí)施例8偶聯(lián)產(chǎn)物的純化用300KD和100KD的超濾膜除去聚合產(chǎn)物中大于300KD和小于100KD的成分，所得產(chǎn)物為分子量分布在100KD～300KD之間的偶聯(lián)產(chǎn)物，即1～3個(gè)已經(jīng)分子內(nèi)交聯(lián)或未分子內(nèi)交聯(lián)的血紅蛋白與1～3個(gè)人血清白蛋白分子的偶聯(lián)物。實(shí)施例9偶聯(lián)產(chǎn)物的純化將實(shí)施例6中偶聯(lián)產(chǎn)物的pH值調(diào)至7.0，上DEAESepharoseFastFlow陰離子交換層析柱，該柱已用含有0.1MNaCl的50mMHEPES緩沖液(pH7.0)平衡。用25ml平衡液洗脫，流速為0.5ml/min。隨后改用55ml含有0.1-0.5MNaCl的50mMHEPES緩沖液(pH7.0)洗脫，流速為0.5ml/min。洗脫液在280nm下檢測，圖譜見圖3。收集含有偶聯(lián)物的蛋白峰，濃縮后上Superdex200凝膠過濾柱。以50mMHEPES緩沖液(pH7.0)為流動(dòng)相，流速為0.35ml/min。洗脫后在280nm下檢測出現(xiàn)兩個(gè)洗脫峰，其中偶聯(lián)物在第一個(gè)洗脫峰(圖4)，收集用SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)一步鑒定(圖5)。純化的偶聯(lián)物主要含兩條蛋白帶(第2泳道)，分子量約為16kDa和83kDa。這是由于血紅蛋白為四聚體蛋白，加入上樣緩沖液煮沸后，解聚為16kDa的亞基。而血紅蛋白與HSA偶聯(lián)后，四聚體蛋白中的3個(gè)亞基解離出來，而剩下的1個(gè)亞基與BSA分子結(jié)合為分子量83kDa的蛋白。因此，可確定該蛋白為1∶1結(jié)合的HSA-血紅蛋白偶聯(lián)物。實(shí)施例10本血液代用品成品制得及特性將純化后的偶聯(lián)產(chǎn)物的pH值調(diào)至7.4。對于受2，3-二磷酸甘油酸影響的血紅蛋白，需要向溶液中加入2，3-DPG或磷酸吡哆醛等調(diào)節(jié)血紅蛋白氧親和力的共價(jià)調(diào)節(jié)劑。實(shí)施例7中偶聯(lián)產(chǎn)物用HEMOX血?dú)夥治鰞x檢測純化后的血紅蛋白的P50為26.8mmHg，Hill系數(shù)為2.30(圖6)。產(chǎn)品經(jīng)高效凝膠過濾液相色譜(HPLC)與多角度激光散射檢測器(MALLS，DAWNEOS，WyattTechnologyCo.，USA)聯(lián)用檢測，將HPLC分離出的單峰進(jìn)行分子量鑒定(圖7)，色譜柱為TSK3000SW，檢測波長280nm。結(jié)果表明，88.5％為重均分子量(Mw)138kD的血紅蛋白與人血清白蛋白1∶1偶聯(lián)物，4.3％為重均分子量202kD的2～4個(gè)蛋白偶聯(lián)體，未偶聯(lián)的白蛋白和血紅蛋白分別只占4.5％和0.5％。產(chǎn)品組成單一，經(jīng)測定其膠體滲透壓(COP)為21.5mmHg，接近人血液的正常膠體滲透壓25mmHg。而其它修飾血紅蛋白產(chǎn)品組成復(fù)雜，分子量分布寬，膠體滲透壓偏離正常值較大，如聚合血紅蛋白的COP一般在10mmHg以下，聚乙二醇(PEG)或聚氧乙烯(POE)修飾的血紅蛋白COP達(dá)70mmHg以上，會(huì)影響體內(nèi)的滲透壓平衡。實(shí)施例11產(chǎn)品的異常毒性試驗(yàn)依據(jù)2000版《中國生物制品規(guī)程》通則生物制品異常毒性試驗(yàn)規(guī)程，測試產(chǎn)品的異常毒性。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為5只ICR小鼠(18-22克)和2只普通級豚鼠(271.1-277.7克)。給藥方式為腹腔注射，小鼠0.5ml/只，豚鼠5ml/只，觀察7天。觀察期內(nèi)，動(dòng)物全部健存，無異常反應(yīng)，到期每只體重均增加，產(chǎn)品的異常毒性試驗(yàn)合格。實(shí)施例12對失血性休克大鼠救助試驗(yàn)將麻醉的SD大鼠固定在酒精消毒的手術(shù)臺上，在左大腿動(dòng)脈和靜脈以及右大腿動(dòng)脈，分別插入直徑0.5mm的充滿0.3％肝素的聚乙烯管，其中右大腿動(dòng)脈插管與多導(dǎo)生理記錄儀聯(lián)接，在線監(jiān)測大鼠血壓變化，以0.5ml/min的速度從做大腿動(dòng)脈抽取30％原血后，穩(wěn)定10min，大鼠身體自行代償，再以同樣的速度繼續(xù)抽血至60％原血，穩(wěn)定30min。此時(shí)大鼠血壓降至原始血壓的25％左右。再以0.5ml/min的速度從左大腿靜脈分別輸入相同體積的偶聯(lián)產(chǎn)品、純化血紅蛋白溶液、HSA溶液、原血，以及三倍體積的乳酸鹽溶液，救助失血性休克大鼠，將大鼠手術(shù)處縫合后飼養(yǎng)，觀察生長狀況，14天仍健在則視為存活，每組6只大鼠。結(jié)果只有偶聯(lián)產(chǎn)品與原血回輸?shù)膶φ战M大鼠存活達(dá)14天(圖8)，說明本產(chǎn)品對失血性休克大鼠具有類似原血的救助效果。實(shí)施例13狗換血試驗(yàn)將6只Beagle狗麻醉，用蠕動(dòng)泵從腿動(dòng)脈抽血，同時(shí)從腿靜脈輸入偶聯(lián)產(chǎn)品，并監(jiān)測動(dòng)脈血壓變化。換血50％后監(jiān)測2小時(shí)，狗的血壓基本維持在原始血壓水平。將手術(shù)傷口縫合后，飼養(yǎng)并觀察生長狀況，狗在手術(shù)2天后精神狀態(tài)恢復(fù)正常，飼養(yǎng)20天生長未出現(xiàn)異常，未有血紅蛋白尿出現(xiàn)，血常規(guī)指標(biāo)未見異常。權(quán)利要求1.一種血紅蛋白的偶聯(lián)物，其特征在于，該偶聯(lián)物為血紅蛋白與人血清白蛋白的偶聯(lián)物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血紅蛋白的偶聯(lián)物，其特征在于偶聯(lián)物的分子量分布在100KD～300KD之間。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血紅蛋白的偶聯(lián)物，其特征在于偶聯(lián)物分子中血紅蛋白分子數(shù)目為1～3個(gè)，人血清白蛋白分子數(shù)目為1～3個(gè)。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的血紅蛋白的偶聯(lián)物，其特征在于偶聯(lián)物中血紅蛋白分子數(shù)目為1～2個(gè)，人血清白蛋白分子數(shù)目為1～2個(gè)。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的血紅蛋白的偶聯(lián)物，其特征在于血紅蛋白數(shù)目為1個(gè)，人血清白蛋白數(shù)目為1個(gè)。6.根據(jù)權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的血紅蛋白的偶聯(lián)物，其特征在于血紅蛋白是分子內(nèi)交聯(lián)的血紅蛋白。7.一種權(quán)利要求1所述的血紅蛋白的偶聯(lián)物的制備方法，包括無基質(zhì)血紅蛋白的制備、血紅蛋白與人血清白蛋白的偶聯(lián)以及偶聯(lián)產(chǎn)物的純化步驟。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的血紅蛋白的偶聯(lián)物的制備方法，其特征在于無基質(zhì)血紅蛋白的制備方法是將膜過濾和離子交換層析集成純化血紅蛋白，步驟如下1)用0.22～0.65μm膜微濾，得到的透過液經(jīng)10～30KD膜超濾；2)超過濾后的血紅蛋白濃縮液經(jīng)透過式陰離子交換層析，層析pH值為6.6～8.5，緩沖液濃度為10mM～50mM，采用PEG伴隨式層析，選擇PEG400～PEG4000，濃度為0.25％～10％，操作溫度為4～10℃。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的血紅蛋白的偶聯(lián)物的制備方法，其特征在于血紅蛋白與人血清白蛋白的偶聯(lián)是在液相中將兩種蛋白質(zhì)直接與交聯(lián)劑反應(yīng)的一步偶聯(lián)法，或者先修飾一種蛋白質(zhì)再偶聯(lián)另外一種蛋白質(zhì)的兩步偶聯(lián)法，或者將蛋白質(zhì)吸附在固相介質(zhì)上進(jìn)行偶聯(lián)的方法。10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的血紅蛋白的偶聯(lián)物的制備方法，其特征在于偶聯(lián)產(chǎn)物的純化方法選自離子交換層析、超過濾和凝膠過濾層析純化方法中的一種或兩種或三種方法。11.一種權(quán)利要求1所述的血紅蛋白偶聯(lián)物在制備血液代用品中的用途。全文摘要本發(fā)明提供了一種血紅蛋白與人血清白蛋白偶聯(lián)物及其制備方法。通過制備無基質(zhì)血紅蛋白，然后將血紅蛋白與人血清白蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，偶聯(lián)產(chǎn)物經(jīng)過離子交換層析、超過濾或凝膠過濾層析法純化，制得的偶聯(lián)產(chǎn)物分子量分布在100KD～300KD之間，含有1～3個(gè)已經(jīng)分子內(nèi)交聯(lián)或未分子內(nèi)交聯(lián)的血紅蛋白分子與1～3個(gè)人血清白蛋白分子。制得的蛋白偶聯(lián)物具有良好的血液代用品的特性。文檔編號C07K14/805GK1767851SQ200480009102公開日2006年5月3日申請日期2004年2月2日優(yōu)先權(quán)日2003年4月9日發(fā)明者蘇志國,路秀玲,鄭春揚(yáng),徐宇紅申請人:蘇志國,路秀玲,鄭春揚(yáng),徐宇紅