一種基于siRNA的雙偶聯(lián)復(fù)合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基于SiRNA的雙偶聯(lián)復(fù)合物。
【背景技術(shù)】
[0002] RNAi療法能夠使得特定的信使RNA(mRNA)沉默，防止產(chǎn)生造成疾病的蛋白質(zhì)，從 而針對(duì)疾病根源。RNAi療法也可能以根本的新方式，治療疾病和幫助患者。
[0003] 近年來(lái)，基于小分子干擾RNA(SiRNA)技術(shù)的基因治療方法取得了成功。由于 SiRNA可直接在胞漿內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，具有起效快速且給藥的時(shí)間間隔靈活可控的優(yōu)點(diǎn)。因此， 通過(guò)SiRNA輸送進(jìn)行基因治療的相關(guān)生物醫(yī)學(xué)技術(shù)得到了迅速的發(fā)展，這種技術(shù)可單獨(dú)使 用以治療病毒感染性疾病及腫瘤等。
[0004] 目前作為SiRNA基因輸送的載體大多為合成陽(yáng)離子分子、高分子，其實(shí)現(xiàn)基因負(fù) 載與輸送的原理為利用載體陽(yáng)離子功能分子、高分子中的正電荷（+)與SiRNA基因序列中 磷酸基團(tuán)所攜帶的負(fù)電荷（_)的靜電相互作用，結(jié)合組裝形成穩(wěn)定的復(fù)合物，保護(hù)所負(fù)載 的SiRNA，同時(shí)可提高其在體內(nèi)的穩(wěn)定性，從而提高SiRNA輸送的效率。
[0005] 然而，到目前為止，雖然國(guó)內(nèi)外已經(jīng)開(kāi)發(fā)報(bào)道了多種陽(yáng)離子功能分子如陽(yáng)離子聚 合物、陽(yáng)離子脂質(zhì)體等，并作為載體應(yīng)用于體外或體內(nèi)細(xì)胞/組織水平的siRNA輸送，但在 實(shí)際應(yīng)用中，大多數(shù)脂質(zhì)陽(yáng)離子功能分子在血液循環(huán)中不穩(wěn)定，容易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬 后清除而導(dǎo)致其失活。且許多陽(yáng)離子載體具有免疫原性，可刺激、誘導(dǎo)細(xì)胞的免疫應(yīng)激反 應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致毒副作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 基于此，有必要提供一種可改善合成基因載體的生物相容性、減低毒性且能增強(qiáng) siRNA轉(zhuǎn)染效果的新型生物功能材料。
[0007] -種基于siRNA的雙偶聯(lián)復(fù)合物，包括棕櫚酸、葉酸，及同時(shí)偶聯(lián)棕櫚酸和葉酸 的siRNA，雙偶聯(lián)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)式為：
[0009] 其中，siRNA的正義鏈與棕櫚酸偶聯(lián)時(shí)，siRNA的反義鏈與葉酸偶聯(lián)；siRNA的反義 鏈與棕櫚酸偶聯(lián)時(shí)，siRNA的正義鏈與葉酸偶聯(lián)。
[0010] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，葉酸與siRNA之間偶聯(lián)的連接體為聚乙二醇，雙偶聯(lián)復(fù)合 物的結(jié)構(gòu)式為：
[0012] 其中6彡n彡18。
[0013] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，n= 12,雙偶聯(lián)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)式為：
[0015] 這種基于siRNA的雙偶聯(lián)復(fù)合物，棕櫚酸能結(jié)合白蛋白，減少腎臟的濾過(guò)，白蛋白 能增加所攜帶的siRNA進(jìn)入癌細(xì)胞，另外，脂溶性棕櫚酸能幫助水溶性核酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。而 葉酸具有腫瘤靶向的功能，能結(jié)合腫瘤表面的葉酸受體，誘導(dǎo)siRNA復(fù)合物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞， 從而抑制致癌基因的表達(dá)。
[0016] 因此，這種基于siRNA的雙偶聯(lián)復(fù)合物通過(guò)化學(xué)修飾核酸，改善了siRNA的生物相 容性及毒性，且增強(qiáng)了siRNA的轉(zhuǎn)染效果，此外這種復(fù)合物分子小，易于進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，且 成分明確，易于大規(guī)模制備。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1為本發(fā)明一對(duì)比實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞特異性熒光強(qiáng)度的平均值的柱狀對(duì)比圖；
[0018] 圖2為本發(fā)明一對(duì)比實(shí)驗(yàn)的裸鼠體內(nèi)腫瘤攝取情況的全身攝影對(duì)比圖；
[0019] 圖3為本發(fā)明一對(duì)比實(shí)驗(yàn)的siRNA在腫瘤組織中濃度隨時(shí)間變化的折線圖；
[0020] 圖4為本發(fā)明一對(duì)比實(shí)驗(yàn)的siRNA在排泄倒尿液中濃度隨時(shí)間變化的折線圖；
[0021] 圖5為本發(fā)明一對(duì)比實(shí)驗(yàn)的siRNA在不同器官中含量的體外攝影對(duì)比圖；
[0022] 圖6為本發(fā)明一對(duì)比實(shí)驗(yàn)的腫瘤組織對(duì)siRNA攝取24h后的體內(nèi)與體外攝影對(duì)比 圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 為了便于理解本發(fā)明，下面將用具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更全面的描述。但是，本 發(fā)明可以以許多不同的形式來(lái)實(shí)現(xiàn)，并不限于本文所描述的實(shí)施例。相反地，提供這實(shí)施例 的目的是使對(duì)本發(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容的理解更加透徹全面。
[0024] -種基于siRNA的雙偶聯(lián)復(fù)合物，包括棕櫚酸、葉酸，及同時(shí)偶聯(lián)棕櫚酸和葉酸的 SiRNA0
[0025] 棕櫚酸與葉酸分別與siRNA的雙鏈偶聯(lián)。即當(dāng)siRNA的正義鏈與棕櫚酸偶聯(lián)時(shí)， siRNA的反義鏈與葉酸偶聯(lián)；當(dāng)siRNA的反義鏈與棕櫚酸偶聯(lián)時(shí)，siRNA的正義鏈與葉酸偶 聯(lián)。
[0026] 棕櫚酸在合成RNA時(shí)加在3'端。葉酸與siRNA之間偶聯(lián)的連接體為聚乙二醇， siRNA上的炔烴與葉酸鏈接的聚乙二醇疊氮化物形成穩(wěn)定的三氮唑鍵。
[0028] 這種基于siRNA的雙偶聯(lián)復(fù)合物，棕櫚酸能結(jié)合白蛋白，減少腎臟的濾過(guò)，白蛋白 能增加所攜帶的siRNA進(jìn)入癌細(xì)胞。
[0029] 葉酸具有腫瘤靶向的功能，能結(jié)合腫瘤表面的葉酸受體，誘導(dǎo)siRNA復(fù)合物進(jìn)入 腫瘤細(xì)胞，從而抑制致癌基因的表達(dá)。
[0030] 以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)上述基于SiRNA的雙偶聯(lián)復(fù)合物進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0031] 實(shí)施例1，一種基于siRNA的雙偶聯(lián)復(fù)合物，包括棕櫚酸、葉酸，及同時(shí)偶聯(lián)棕櫚酸 和葉酸的siRNA。葉酸與siRNA之間偶聯(lián)的連接體是長(zhǎng)度為6的聚乙二醇。實(shí)施例1的雙 偶聯(lián)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)如下：
[0033] 實(shí)施例2, 一種基于siRNA的雙偶聯(lián)復(fù)合物，包括棕櫚酸、葉酸，及同時(shí)偶聯(lián)棕櫚酸 和葉酸的siRNA。葉酸與siRNA之間偶聯(lián)的連接體是長(zhǎng)度為12的聚乙二醇。實(shí)施例2的雙 偶聯(lián)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)如下：
[0035] 實(shí)施例3, 一種基于siRNA的雙偶聯(lián)復(fù)合物，包括棕櫚酸、葉酸，及同時(shí)偶聯(lián)棕櫚酸 和葉酸的siRNA。葉酸與siRNA之間偶聯(lián)的連接體是長(zhǎng)度為18的聚乙二醇。實(shí)施例3的雙 偶聯(lián)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)如下：
[0036]
[0037] 對(duì)比實(shí)驗(yàn)I :對(duì)比不同長(zhǎng)度的聚乙二醇連接體對(duì)保持葉酸的細(xì)胞結(jié)合功能的影 響。結(jié)合圖1，通過(guò)血清培養(yǎng)基，在37°C環(huán)境下，分別讓實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3的siRNA 攝入KB細(xì)胞株，放置4小時(shí)后，通過(guò)用流式細(xì)胞儀測(cè)量各實(shí)施例中的細(xì)胞特異性熒光強(qiáng)度 的平均值，比較siRNA的細(xì)胞結(jié)合以及攝入效果。
[0038] 通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)1，可見(jiàn)長(zhǎng)度為12的聚乙二醇作為連接體，對(duì)保持葉酸的細(xì)胞結(jié)合 功能最強(qiáng)。
[0039] 對(duì)比例1 :在未經(jīng)化學(xué)修飾的siRNA上標(biāo)記