專利名稱：選擇性制備1－磷酸化糖衍生物端基異構(gòu)體的方法和制備核苷的方法
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及制備1-磷酸化糖衍生物的方法。1-磷酸化糖廣泛分布在自然界中，是許多酶的反應(yīng)底物，是被利用為制備有用物質(zhì)如藥品和營養(yǎng)食品的原料。已預(yù)期合成的1-磷酸化糖衍生物用作制備藥品如抗病毒制劑和酶抑制劑的原料。
本發(fā)明還涉及制備用作醫(yī)藥如抗病毒藥、抗癌藥和抗致敏藥的原料或藥物物質(zhì)的核苷化合物。
2.現(xiàn)有技術(shù)的描述已知制備1-磷酸化糖的方法，例如1)1-溴代糖和磷酸銀鹽的縮合反應(yīng)(J.Biol.Chem.，Vol.121，P.465(1937)；J.Am.Chem.Soc.，Vol.78，P.811(1956)；J.Am.Chem.Soc.，Vol.79，P.5057(1957))；2)1-鹵代糖和二芐基磷酸的三乙胺鹽的縮合反應(yīng)(J.Am.Chem.Soc.，Vol.77，P.3423(1955)；J.Am.Chem.Soc.，Vol.80，P.1994(1958)；J.Am.Chem.SoC.，Vol.106，P.37851(1984)；J.Org.Chem.，Vol.59，P.690(1994))；3)1-乙酰化糖和正磷酸的熱縮合反應(yīng)(J.Org.Chem.，Vol.27，P.1107(1962)；Carbohydrate Res.，Vol.3，P.117(1966)；Carbohydrate Res.，Vol.3，P.463(1967)；Can.J.Biochem.，Vol.50，P.574(1972))；4)二芐基磷酸和在1-位通過酰亞胺化活化的糖的縮合(Carbohydrate Res.，Vol.61，P.181(1978)；Tetrahedron Lett.，Vol.23，P.405(1982))；5)用氯化二芐基磷處理用醇亞鉈或醇鋰在1-位活化的糖(Carbohydrate Res.，Vol.94，P.165(1981)；Chem.Lett.，Vol.23，P.405(1982))；6)利用核苷磷酸化酶的反應(yīng)磷酸解核苷以形成1-磷酸化糖衍生物(J.Biol.Chem.，Vol.184，P.437(1980))。
這些方法具有下面的缺點(diǎn)。
在上述1)-5)的化學(xué)方法中普遍的問題是難于建立制備所需的具有良好選擇性的異構(gòu)體的一般合成方法，這是因?yàn)橛捎诤?-位相鄰的官能團(tuán)的影響，α/β端基異構(gòu)體之間的端基異構(gòu)體選擇性的變化造成的。為了達(dá)到選擇性和好的收率，2-乙酰氧基或乙酰氨基的存在是必需的。但是，既然2-脫氧糖不穩(wěn)定，這些合成方法可以被限制到相當(dāng)窄的應(yīng)用范圍。由此，難于控制端基異構(gòu)體的選擇性，而需要柱色譜純化，導(dǎo)致差的收率(Chem.Zvesti，Vol.28(1)，P.115(1974)；Izv.Akad.Nauk SSSR，Ser.Khim.，Vol.8，P.1843(1975))。
當(dāng)然，沒有化學(xué)制備1-磷酸化的2-脫氧呋喃糖的報(bào)道，該糖比1-磷酸化2-脫氧吡喃糖更不穩(wěn)定，導(dǎo)致更難于控制選擇性。
在第6)項(xiàng)中，制備核苷本身是困難的，除了相當(dāng)有限類型的核糖核苷例如肌苷之外。因此，可以制備有限類型的1-磷酸化糖衍生物如核糖-1-磷酸酯(phosphate)。此外，既然核苷本身作為原料是昂貴的，那么該方法在成本方面是不令人滿意的。
如上所述，術(shù)語“核苷磷酸化酶”是能夠在磷酸存在下磷酸解核苷中的N-苷鍵的酶的通稱，磷酸催化由下面的反應(yīng)式表示的反應(yīng)核苷+磷酸(鹽)→堿基+1-磷酸化糖衍生物可一般歸入嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶這兩組的酶廣泛分布在自然界中。它們存在于哺乳動物、鳥和魚、酵母和細(xì)菌中。酶反應(yīng)是可逆的，已公開了許多利用逆反應(yīng)合成各種核苷的方法。從1-磷酸2′-脫氧核糖和核酸堿基合成胸苷(胸腺嘧啶、腺嘌呤或鳥嘌呤)(JP-A01-104190)，2′-脫氧腺苷(JP-A11-137290)或2′-脫氧鳥苷(JP-A11-137290)。
而且，Agric.Biol.Chem.，Vol.50(1)，pp.121-126(1986)描述了一種方法，其中通過在磷酸存在下，使用來自產(chǎn)氣桿菌的嘌呤核苷磷酸化酶進(jìn)行反應(yīng)，肌苷被分解成為1-磷酸核糖和次黃嘌呤，使用離子交換樹脂分離前者，也用來自產(chǎn)氣桿菌的嘌呤核苷磷酸化酶處理1，2，4-三唑-3-甲酰胺來制備作為抗病毒制劑的利巴韋林。
但是，如上所述，還沒有建立制備1-磷酸化糖衍生物的工業(yè)方法，由此也沒有建立利用核苷磷酸化酶的逆反應(yīng)制備通用的核苷的工業(yè)方法。
而且，既然利用酶的逆反應(yīng)由1-磷酸化糖衍生物和堿基形成核苷的反應(yīng)是可逆的，有轉(zhuǎn)化率不能提高的技術(shù)缺點(diǎn)。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供一種制備1-磷酸化糖衍生物的高度通用的和端基異構(gòu)體選擇性的方法，該方法不受糖骨架如呋喃糖和吡喃糖不同的影響，不受是否存在取代基如脫氧糖的影響或不受糖類型即天然糖或合成糖的影響。
本發(fā)明另一個目的是提供通過用核苷磷酸化酶處理1-磷酸化糖衍生物和核酸堿基，制備核苷的高度通用的方法和提高反應(yīng)中核苷轉(zhuǎn)化率的方法。
換句話說，本發(fā)明根本的目的是提供通過達(dá)到上述第一和第二目的，制備高純度和低成本的核苷的方法。
我們已非常努力以達(dá)到第一目的。最后，我們發(fā)現(xiàn)1-磷酸化糖衍生物在一定條件下和1-磷酸化糖衍生物的端基異構(gòu)體以及二聚物存在著平衡，調(diào)節(jié)該條件以僅使所需的端基異構(gòu)體作為晶體沉淀，以便平衡可以向優(yōu)選的方向轉(zhuǎn)移，以提供所需的具有好的選擇性和高收率的端基異構(gòu)體。由此，基于這些發(fā)現(xiàn)，我們完成了本發(fā)明。
具體地說，本發(fā)明包括下面的實(shí)施方案。
(1)選擇性制備1-磷酸化糖衍生物單體的α或β異構(gòu)體的方法，該方法包含磷酸解和異構(gòu)化1-磷酸化糖衍生物的端基異構(gòu)體混合物，得到1-磷酸化糖衍生物單體的α和β異構(gòu)體，和選擇性結(jié)晶這些異構(gòu)體的一種以取代這些端基異構(gòu)體之間的平衡的步驟。
(2)選擇性制備1-磷酸化糖衍生物單體的α或β異構(gòu)體的方法，該方法包含磷酸解和異構(gòu)化由式(1)表示的1-磷酸化糖衍生物的端基異構(gòu)體混合物的步驟 其中，R1和R2獨(dú)立地表示氫，甲基，被保護(hù)的羥甲基或被保護(hù)的羧基；R3表示酰基；R4表示羥基的保護(hù)基；X表示鹵素，烷氧基或烷硫基；W表示氧或硫；Z表示氧，硫或任選取代的碳；m表示1-3的整數(shù)；n表示0或1；p和q表示0-4的整數(shù)；和r表示0或1；條件是，當(dāng)Z是氧或硫時(shí)，p、q、r和n滿足p+r≤n+1和q≤2×(n+1)-2×(p+r)和當(dāng)Z是碳時(shí)，p+r≤n+2和q≤2×(n+2)-2×(p+r)的條件，得到1-磷酸化糖衍生物單體的α和β異構(gòu)體，和選擇性結(jié)晶這些異構(gòu)體的一種以取代這些端基異構(gòu)體之間的平衡。
(3)制備由式(3)表示的1-磷酸化糖衍生物單體的方法 其中R1和R2獨(dú)立地表示氫，甲基，羥甲基或羧基；R3表示氫或?；缓蚗、W、Z、n、p、q和r是如式(1)定義的，該方法包含磷酸解和異構(gòu)化由式(1)表示的1-磷酸化糖衍生物的端基異構(gòu)體混合物，得到1-磷酸化糖衍生物單體的α和β異構(gòu)體；選擇性結(jié)晶這些異構(gòu)體的一種以取代這些端基異構(gòu)體之間的平衡；然后除去由R4表示的保護(hù)基團(tuán)的步驟。
(4)由式(4)表示的1-磷酸化糖衍生物的三聚物、二聚物或單體或其鹽 其中R1和R2獨(dú)立地表示氫，甲基，用取代的苯甲酰基保護(hù)的羥甲基或被保護(hù)的羧基；R4表示氫或羥基的保護(hù)基；和R3、X、W、Z、m、n、p、q和r是如式(1)定義的。
(5)由式(5)表示的1-磷酸化糖衍生物單體或其鹽 其中p和q表示0-3的整數(shù)；r表示0或1；和R1、R2、R3、R4、X、W和Z是如式(1)定義的；條件是當(dāng)Z是氧或硫時(shí)，p、q和r滿足p+q+r≤3和當(dāng)Z是碳時(shí)，p+q+r≤5的條件。
(6)由式(6)表示的1-磷酸化糖衍生物單體或其鹽 其中R1和R2獨(dú)立地表示氫，甲基，羥甲基或羧基；R3、X、W、Z、n、p、q和r是如式(1)定義的。
(7)由式(7)表示的1-磷酸化糖衍生物單體或其鹽 其中p和q表示0-3的整數(shù)；r表示0或1；和R1、R2、R3、R4、X、W和Z是如式(1)定義的；條件是當(dāng)Z是氧或硫時(shí)，p、q和r滿足p+r≤1，q≤2-2×(p+r)和當(dāng)Z是碳時(shí)，p+r≤2，q≤4-2×(p+r)的條件。
(8)制備由式(20)表示的1-磷酸化糖的方法 其中R11表示被保護(hù)的羥甲基和R14表示羥基的被保護(hù)基，該方法包含在堿(base)的存在下，用磷酸處理由式(18)表示的化合物的步驟 其中R11和R14如上定義，得到由式(19)表示的1-磷酸化糖衍生物的端基異構(gòu)體混合物 其中R11和R14如上定義，m是如權(quán)利要求2定義的；磷酸解和異構(gòu)化該混合物；和通過選擇性結(jié)晶形成的α-異構(gòu)體，取代端基異構(gòu)體間的平衡。
(9)制備2-脫氧-α-D-核糖-1-磷酸酯的方法，該方法包含在堿存在下，用磷酸處理式(18)表示的化合物 其中R11表示被保護(hù)的羥甲基和R14表示羥基的保護(hù)基，得到式(19)表示的1-磷酸化糖衍生物的端基異構(gòu)體混合物 其中R11和R14是如上定義的，m是如權(quán)利要求2定義的；磷酸解和異構(gòu)化該混合物；通過選擇性結(jié)晶形成的α-異構(gòu)體，取代端基異構(gòu)體間的平衡，得到α-異構(gòu)體；然后除去保護(hù)基。
我們經(jīng)過努力研究達(dá)到了第二個目的，由此形成了一個高度通用的制備核苷的方法，該方法通過利用廣泛分布在自然界中的核苷磷酸化酶的逆反應(yīng)以及結(jié)合上述制備1-磷酸化糖衍生物的方法而得到的。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)能夠和磷酸根離子形成水不溶性鹽的金屬陽離子可以存在以使反應(yīng)中作為副產(chǎn)物的磷酸根離子作為水不溶性鹽沉淀出來，結(jié)果反應(yīng)平衡向生產(chǎn)核苷的方向移動，由此提高反應(yīng)收率。由此，我們完成了本發(fā)明，提供了一種制備高純度和低成本核苷的方法。
基于上述發(fā)現(xiàn)的本發(fā)明包括下面的實(shí)施方案。
(10)一種制備式(8)表示的核苷的方法 其中B是堿基，獨(dú)立地選自嘧啶、嘌呤、氮嘌呤(azapurine)和去氮嘌呤，其任選地被鹵素、烷基、鹵代烷基、鏈烯基、鹵代鏈烯基、炔基、氨基、烷基氨基、羥基、羥基氨基、氨氧基(aminoxy)、烷氧基、巰基、烷基巰基、芳基、芳氧基或氰基取代；且R1、R2、R3、X、W、Z、n、p、q和r是如式(1)定義的，該方法包含第一步，上述(3)中制備1-磷酸化糖衍生物單體，包括磷酸解和異構(gòu)化1-磷酸化糖衍生物的端基異構(gòu)體混合物的步驟，得到1-磷酸化糖衍生物單體的α和β異構(gòu)體；選擇性結(jié)晶這些異構(gòu)體的一種以取代這些端基異構(gòu)體之間的平衡；然后除去由R4表示的保護(hù)基團(tuán)；和第二步，在核苷磷酸化酶的作用下，第一步獲得的1-磷酸化糖衍生物的磷酸根基團(tuán)和堿基進(jìn)行交換反應(yīng)。
(11)一種制備式(9)表示的核苷的方法 其中B是如式(8)定義的；R1、R2、R3、R4、X、W、Z、n、p、q和r是如式(1)定義的，該方法包含在核苷磷酸化酶的作用下，上述(6)中1-磷酸化糖衍生物單體的磷酸根基團(tuán)和堿基的交換反應(yīng)。
(12)一種制備式(10)表示的核苷的方法 其中B是如式(8)定義的；R1、R2、R3、R4、X、W、Z、p、q和r是如式(1)定義的，該方法包含在核苷磷酸化酶的作用下，上述(7)中1-磷酸化糖衍生物單體的磷酸根基團(tuán)和堿基的交換反應(yīng)。
(13)一種制備式(21)表示的核苷的方法 其中B是如權(quán)利要求11中式(8)所定義的，該方法包含第一步，制備上述(12)中的2-脫氧-α-D-核糖-1-磷酸酯，其中R1是羥甲基，R2是氫，p和r是0，X是氟；和第二步，在核苷磷酸化酶的作用下，第一步獲得的1-磷酸化糖衍生物的磷酸根基團(tuán)和堿基進(jìn)行交換反應(yīng)。
在上述(10)-(13)的實(shí)施方案中，核苷磷酸化酶可以是選自下列的至少一種嘌呤核苷磷酸化酶(EC2.4.2.1)、鳥嘌呤核苷磷酸化酶(EC2.4.2.15)、嘧啶核苷磷酸化酶(EC2.4.2.2)、尿苷磷酸化酶(EC2.4.2.3)、胸苷磷酸化酶(EC2.4.2.4)和脫氧尿苷磷酸化酶(EC2.4.2.23)。
使用表達(dá)至少一種核苷磷酸化酶的微生物來獲得核苷磷酸化酶活性，所述核苷磷酸化酶選自嘌呤核苷磷酸化酶(EC2.4.2.1)、鳥嘌呤核苷磷酸化酶(EC2.4.2.15)、嘧啶核苷磷酸化酶(EC2.4.2.2)、尿苷磷酸化酶(EC2.4.2.3)、胸苷磷酸化酶(EC2.4.2.4)和脫氧尿苷磷酸化酶(EC2.4.2.23)。
在上述(10)-(13)的實(shí)施方案中，在核苷磷酸化酶的作用下，1-磷酸化糖衍生物單體的磷酸根基團(tuán)和堿基進(jìn)行交換反應(yīng)的過程中，能夠和磷酸根離子形成水不溶性鹽的金屬陽離子可以存在于反應(yīng)溶液中。
在上述(10)-(13)的實(shí)施方案中能夠和磷酸根離子形成水不溶性鹽的金屬陽離子可以是至少一種選自鈣、鋇、鋁和鎂離子的金屬陽離子。
而且，本發(fā)明包括由式(11)-(13)和式(20)任一表示的化合物。
即，本發(fā)明還包括不是天然產(chǎn)生的由式(11)表示的合成核苷或其鹽 其中B、R1、R2、R3、R4、X、W、Z、n、p、q和r是如式(1)和(8)定義的，不包括三氟胸苷、利巴韋林、乳清酸核苷、尿嘧啶阿拉伯糖苷、腺嘌呤阿拉伯糖苷、2-甲基腺嘌呤阿拉伯糖苷、2-氯-次黃嘌呤阿拉伯糖苷、硫代鳥嘌呤阿拉伯糖苷、2，6-二氨基嘌呤阿拉伯糖苷、阿糖胞苷、鳥嘌呤阿拉伯糖苷、阿糖胸苷、依諾他濱、吉西他濱、疊氮胸苷、碘苷、雙脫氧腺苷、雙脫氧肌苷、雙脫氧胞苷、雙脫氫脫氧胸苷、硫雜雙脫氧胞苷、sorivudine、5-甲基尿苷、三氮唑核苷、硫代肌苷、呋氟尿嘧啶、doxifluridine、布雷青霉素、水松蕈素、別嘌醇尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、2′-氨基尿苷、2′-氨基腺苷、2′-氨基胍、2-氯-2′-氨基肌苷、DMDC和FMDC。
不是天然產(chǎn)生的由式(12)表示的合成核苷或其鹽 其中B、R1、R2、R3、R4、X、W、Z、n、p、q和r是如式(1)和(8)定義的，不包括三氟胸苷、利巴韋林、乳清酸核苷、尿嘧啶阿拉伯糖苷、腺嘌呤阿拉伯糖苷、2-甲基腺嘌呤阿拉伯糖苷、2-氯-次黃嘌呤阿拉伯糖苷、硫代鳥嘌呤阿拉伯糖苷、2，6-二氨基嘌呤阿拉伯糖苷、阿糖胞苷、鳥嘌呤阿拉伯糖苷、阿糖胸苷、依諾他濱、吉西他濱、疊氮胸苷、碘苷、雙脫氧腺苷、雙脫氧肌苷、雙脫氧胞苷、雙脫氫脫氧胸苷、硫雜雙脫氧胞苷、sorivudine、5-甲基尿苷、三氮唑核苷、硫代肌苷、呋氟尿嘧啶、doxifluridine、布雷青霉素、水松蕈素、別嘌醇尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、2′-氨基尿苷、2′-氨基腺苷、2′-氨基胍、2-氯-2′-氨基肌苷、DMDC和FMDC；式(13)表示的核苷或其鹽 其中B、R1、R2、R3、R4、X、W、Z、n、p、q和r是如式(1)和(8)定義的，不包括三氟胸苷、利巴韋林、乳清酸核苷、尿嘧啶阿拉伯糖苷、腺嘌呤阿拉伯糖苷、2-甲基腺嘌呤阿拉伯糖苷、2-氯-次黃嘌呤阿拉伯糖苷、硫代鳥嘌呤阿拉伯糖苷、2，6-二氨基嘌呤阿拉伯糖苷、阿糖胞苷、鳥嘌呤阿拉伯糖苷、阿糖胸苷、依諾他濱、吉西他濱、疊氮胸苷、碘苷、雙脫氧腺苷、雙脫氧肌苷、雙脫氧胞苷、雙脫氫脫氧胸苷、硫雜雙脫氧胞苷、sorivudine、5-甲基尿苷、三氮唑核苷、硫代肌苷、呋氟尿嘧啶、doxifluridine、布雷青霉素、水松蕈素、別嘌醇尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、2′-氨基尿苷、2′-氨基腺苷、2′-氨基胍、2-氯-2′-氨基肌苷、DMDC和FMDC；和式(20)表示的1-磷酸化糖及或其鹽 其中R11和R14是如式(18)定義的。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述下面詳細(xì)描述本發(fā)明。
用于本發(fā)明的糖包括但不限于衍生自D-和L-型天然單糖的殘基，包括6-脫氧糖如巖藻糖、鼠李糖、毛地黃毒素糖、齊墩果糖和異鼠李糖，己糖如阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖和塔羅糖，戊糖如核糖、阿拉伯糖、木糖和來蘇糖，丁糖如赤蘚糖和蘇糖，氨基糖如葡糖胺和daunosamine，糖醛酸如葡糖醛酸和半乳糖醛酸，酮糖如阿洛酮糖、果糖、山梨糖、塔格糖和pentulose，和脫氧糖如2-脫氧核糖；衍生自合成吡喃糖和呋喃糖的殘基；和上述任何殘基中的羥基和/或氨基被保護(hù)或酰化的糖殘基衍生物或具有鹵化糖殘基的糖，其中羥基被鹵素如氟取代。
本發(fā)明中，1-磷酸化糖衍生物是指其中殘基衍生自天然或合成單糖的糖衍生物，1-羥基是磷酸化的。除非另外說明，它可以包括單體、二聚物或三聚物或其混合物，對其混合比例沒有限制。
就“被保護(hù)的羥甲基”和“羥基的保護(hù)基”而論的保護(hù)基是指可通過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)方法例如氫解、水解和光解除去的基團(tuán)，包括甲酰基、?；?、甲硅烷基、烷基、芳烷基、羰基，優(yōu)選甲?；?、脂族?；?、芳族?；?、甲硅烷基、烷氧烷基、鹵化的烷基、芳烷基、烷氧羰基和芳烷氧羰基。
脂族?；梢允峭榛驶望u化的低級烷基羰基。
烷基羰基的實(shí)例包括乙?；?、丙酰基、丁?；?、異丁?；?、戊?；?、新戊酰、戊?；?、異戊?；?、辛?；⑷苫驶?、癸基羰基、3-甲基壬基羰基、8-甲基壬基羰基、3-乙基辛基羰基、3，7-二甲基辛基羰基、十一烷羰基、十二烷羰基、十三烷羰基、十四烷羰基、十五烷羰基、十六烷羰基、1-甲基十五烷羰基、14-甲基十五烷羰基、13，13-二甲基十四烷羰基、十七烷羰基、15-甲基十六烷羰基和十八烷羰基。
鹵代低級烷基羰基的實(shí)例包括氯乙?；?、二氯乙?；⑷纫阴；腿阴；?br> 芳族?；梢允欠蓟驶?、鹵化的芳基羰基、低級烷基化的芳基羰基、低級烷氧基化的芳基羰基、硝化芳基羰基、低級烷氧羰基化的芳基羰基或芳化的芳基羰基。
芳基羰基的實(shí)例包括苯甲酰基、α-萘甲酰基和β-萘甲?；?br> 鹵化的芳基羰基的實(shí)例包括2-氟苯甲?；?-氟苯甲?；?、4-氟苯甲酰基、2-氯苯甲?；?-氯苯甲?；?、4-氯苯甲?；?-溴苯甲?；?-溴苯甲?；?-溴苯甲?；?、2，4-二氯苯甲酰基、2，6-二氯苯甲?；?，4-二氯苯甲?；?，5-二氯苯甲?；?。
低烷基化的芳基羰基的實(shí)例包括2-甲苯甲酰、3-甲苯甲酰、4-甲苯甲酰和2，4，6-三甲基苯甲?；?。
低級烷氧基芳基羰基的實(shí)例包括2-茴香?；?、3-茴香?；?-茴香?；?。
硝化芳基羰基的實(shí)例包括2-硝基苯甲酰基、3-硝基苯甲?；?、4-硝基苯甲?；?，5-二硝基苯甲?；?。
低級烷氧羰基化的芳基羰基的實(shí)例包括2-(甲氧基羰基)苯甲?；?。芳化的芳基羰基的實(shí)例包括4-苯基苯甲酰基。
甲硅烷基可以是低級烷基甲硅烷基和芳基取代的低級烷基甲硅烷基。
低級烷基甲硅烷基的實(shí)例包括三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、異丙基二甲基甲硅烷基、叔-丁基二甲基甲硅烷基、甲基二異丙基甲硅烷基和三異丙基甲硅烷基。
芳基取代的低級烷基甲硅烷基的實(shí)例包括二苯基甲基甲硅烷基、二苯基異丙基甲硅烷基和苯基二異丙基甲硅烷基。
芳烷基可以是芐基、用低級烷基取代的芳烷基、用低級烷氧基取代的芳烷基、用硝基取代的芳烷基、用鹵素取代的芳烷基或用氰基取代的芳烷基。
這些實(shí)例包括2-甲基芐基、3-甲基芐基、4-甲基芐基、2，4，6-三甲基芐基、2-甲氧基芐基、3-甲氧基芐基、4-甲氧基芐基、2-硝基芐基、3-硝基芐基、4-硝基芐基、2-氯芐基、3-氯芐基、4-氯芐基、2-溴芐基、3-溴芐基、4-溴芐基、2-氰基芐基、3-氰基芐基和4-氰基芐基。
芳烷氧基羰基可以是用低級烷基取代的芳烷氧基羰基、用低級烷氧基取代的芳烷氧基羰基、用硝基取代的芳烷氧基羰基、用鹵素取代的芳烷氧基羰基或用氰基取代的芳烷氧基羰基。
這些的實(shí)例包括2-甲基芐氧基羰基、3-甲基芐氧基羰基、4-甲基芐氧基羰基、2，4，6-三甲基芐氧基羰基、2-甲氧基芐氧基羰基、3-甲氧基芐氧基羰基、4-甲氧基芐氧基羰基、2-硝基芐氧基羰基、3-硝基芐氧基羰基、4-硝基芐氧基羰基、2-氯芐氧基羰基、3-氯芐氧基羰基、4-氯芐氧基羰基、2-溴芐氧基羰基、3-溴芐氧基羰基、4-溴芐氧基羰基、2-氰基芐氧基羰基、3-氰基芐氧基羰基和4-氰基芐氧基羰基。
烷氧基羰基可以是低級烷氧基羰基、用鹵素取代的烷氧基羰基或用烷基甲硅烷基取代的烷氧基羰基。
低級烷氧基羰基的實(shí)例包括甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基、丁氧基羰基、仲丁氧基羰基和叔-丁氧基羰基。
用鹵素取代的烷氧基羰基的實(shí)例包括2，2，2-三氯乙氧基羰基。用烷基甲硅烷基取代的烷氧基羰基的實(shí)例包括2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰基。
烷基可以是烷氧基烷基如甲氧乙基、乙氧甲基、2-甲氧乙基和2-甲氧乙氧甲基；鹵化的烷基如2，2，2-三氯乙基；或用芳基取代的低級烷基如芐基、α-萘甲基、β-萘甲基、二苯基甲基和三苯基甲基。
其中，優(yōu)選脂族?；⒎甲艴；头纪榛?；更優(yōu)選4-甲苯甲?；?-氯苯甲酰基和芐基。就“被保護(hù)的羧基”中的R1和R2而論的保護(hù)基是指通過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)方法如氫解、水解和光解而被除去的基團(tuán)，包括優(yōu)選低級烷基如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基和叔丁基；甲硅烷基化的低級烷基如2-(三甲基甲硅烷基)乙基和2-(三乙基甲硅烷基)乙基；或上述芳烷基或烷氧烷基，更優(yōu)選甲基、叔丁基或芐基。
以X表示的鹵素是指氟、氯、溴或碘。
以X表示的烷氧基和烷硫基可以是具有上述低級烷基、芳烷基或烷氧烷基的烷氧基和烷硫基，優(yōu)選甲氧基、甲氧乙氧基或甲硫基。
用Z表示的任選取代的碳是指具有一個或兩個由式(Xq和NHR3)表示的取代基的碳，或當(dāng)不具有取代基時(shí)，具有氫原子的碳。
R3表示的?；梢允巧鲜鲋艴；?、芳族酰基、烷氧羰基或芳烷氧羰基、或低級鏈烷磺?；缂谆酋；腿谆酋；蚍蓟酋；绫交酋；蛯?甲苯磺?；粌?yōu)選脂族?；⒎减；虻图夋溚榛酋；痪唧w地說，乙?；?、三氟乙?；?、苯甲酰基和甲磺?；?。當(dāng)使用超過一種NHR3作為取代基時(shí)，在各個NHR3中的R3獨(dú)立地是上述任一基團(tuán)。
R4、R11和R14表示的“被保護(hù)的羥甲基”和“羥基的保護(hù)基”中的保護(hù)基可選自R1和R2所定義的那些。
具有由式(1)-(17)任一表示的結(jié)構(gòu)的糖殘基優(yōu)選但不限于那些衍生自上述天然單糖的殘基、上述那些衍生自合成糖的殘基、來自糖殘基的衍生物或鹵化的糖殘基，正如上面所述。
由式(4)-(7)任一表示的化合物的鹽可以是那些通過化合物中的磷酸根基團(tuán)形成的鹽。該鹽的實(shí)例包括堿金屬鹽如鈉、鉀和鋰鹽；堿土金屬鹽如鎂、鈣和鋇鹽；金屬鹽如鋁和鐵鹽；銨鹽；或烷基胺鹽如伯、仲和叔烷基胺鹽。
在此伯胺可以是烷基胺如甲胺、乙胺、丙胺、異丙胺、丁胺、己胺和辛胺；環(huán)烷基胺如環(huán)己胺；或芐胺。
仲胺可以是二烷基胺如二乙胺、二異丙基胺、二丁胺、二己胺和二辛胺；二環(huán)烷基胺如二環(huán)己基胺；或環(huán)胺如哌啶、嗎啉和N-甲基哌啶(piperadine)。
叔胺可以是叔烷基胺如三甲胺、三乙胺、三丙胺、N-乙基二異丙胺、三丁胺、三己胺、三辛胺、N-乙基二環(huán)己胺、N-甲基哌啶、N-甲基嗎啉和N，N，N′N′-四甲基乙二胺；苯胺化合物如苯胺、N，N-二甲基苯胺、N，N-二乙基苯胺、N，N-二丁基苯胺和N，N-二辛基苯胺、吡啶化合物如吡啶、2，6-二甲基吡啶、2，4，6-二甲基吡啶和煙酰胺；氨基酸如甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、賴氨酸、精氨酸和谷氨酸；或任選的活性胺如辛可尼丁、1-(1-萘基)乙胺和1-苯基乙胺，所有這些包括一價(jià)和二價(jià)鹽。
本發(fā)明的由式(4)-(7)任一表示的化合物可吸收水分以具有吸收的水或成為水合物，它們都包括在本發(fā)明中。
可通過但不限于由反應(yīng)式(I)表示的反應(yīng)來制備本發(fā)明的1-磷酸化糖衍生物的端基異構(gòu)體混合物反應(yīng)式(I) 在該式中，R1、R2、R3、R4、X、W、Z、m、n、p、q和r是如式(1)定義的，Y表示氟、氯、溴或碘。當(dāng)m是1、2或3時(shí)，分別得到磷酸三酯、磷酸二酯或磷酸單酯。這些分別稱作1-磷酸化糖衍生物三聚物、1-磷酸化糖衍生物二聚物和1-磷酸化糖衍生物單體。而且，1-磷酸化糖衍生物三聚物、1-磷酸化糖衍生物二聚物和1-磷酸化糖衍生物單體共同稱為1-磷酸化糖衍生物，對其混合比例沒有限制。
優(yōu)選的磷酸可以是但不限于具有低水分含量的磷酸如正磷酸。
對堿沒有限定，只要它不抑制作為脫氧劑的反應(yīng)和功能。優(yōu)選的無機(jī)堿包括堿金屬和堿土金屬的碳酸鹽和氫氧化物。優(yōu)選的有機(jī)堿包括叔烷基胺、苯胺類、吡啶類和任選的活性胺。
當(dāng)來自溶劑或添加劑的水分對反應(yīng)有副作用時(shí)，可以使用脫水劑。對脫水劑沒有限定，只要它具有充分的吸水性或和水的反應(yīng)性；優(yōu)選分子篩和五氧化二磷。
反應(yīng)一般在溶劑存在下進(jìn)行。對溶劑沒有限定只要它在某種程度上不抑制反應(yīng)和溶解原料?？梢允褂玫娜軇┌ㄖ鍩N如己烷和庚烷；芳烴如苯、甲苯、二甲苯和茴香醚；鹵代烴如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、氯苯和二氯苯；酯如甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸正丁酯和碳酸二乙酯；醚如二乙醚、二異丙醚、四氫呋喃、二噁烷、二甲氧乙烷和二甘醇二甲醚；腈如乙腈、丙腈和異丁腈；酰胺如甲酰胺、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮、N-甲基吡咯烷酮和N，N-二甲基-2-咪唑酮(imidazolydinone)；酮如丙酮、2-丁酮、甲基異丙基酮和甲基異丁基酮；和選自上述兩種或多種的混合物。
對反應(yīng)溫度沒有限定，一般是-80℃至60℃，優(yōu)選-10℃至25℃。
完成反應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間可以取決于許多因素如原料、試劑、溶劑的類型和反應(yīng)溫度，一般是1分鐘-24小時(shí)，優(yōu)選10分鐘-2小時(shí)。
對糖衍生物(14)與磷酸的比例沒有限定，反應(yīng)一般在化合物(14)∶磷酸＝1∶10-3∶1的比例下進(jìn)行。此時(shí)，產(chǎn)物(1)是其和磷酸偶合的糖殘基數(shù)(即m)為1、2或3的化合物的混合物，這取決于化合物(14)∶磷酸的比例。
而且，可以通過由反應(yīng)式(II)表示的反應(yīng)制備α-或β-形式的1-磷酸化糖衍生物(16a)或(16b) 在該式中，R1、R2、R3、R4、X、W、Z、m、n、p、q和r是如式(1)定義的。
根據(jù)該制備方法，由式(15)表示的1-磷酸化糖衍生物可以是單體、二聚物或三聚物或其以任何混合比例的混合物，因?yàn)樗鼈冊诜磻?yīng)系統(tǒng)中可以被轉(zhuǎn)化為由式(16)表示的1-磷酸化糖衍生物。
優(yōu)選的磷酸可以是但不限于水分含量低的磷酸，如正磷酸。
堿對在化合物(16)中和磷酸根基團(tuán)形成鹽以選擇性結(jié)晶α-和β-化合物即(16a)或(16b)之一是重要的。根據(jù)用于反應(yīng)中的溶劑可以選擇最適合的堿，優(yōu)選上述無機(jī)堿、叔烷基胺、苯胺類、吡啶、氨基酸和任選的活性胺，和形成的鹽包括一價(jià)和二價(jià)鹽。
當(dāng)來自溶劑或添加劑的水分對反應(yīng)有副作用時(shí)，可以使用脫水劑。對脫水劑沒有限定，只要它具有充分的吸水性或和水的反應(yīng)性；優(yōu)選分子篩和五氧化二磷。
反應(yīng)一般在溶劑存在下進(jìn)行。對溶劑沒有限定只要它在某種程度上不抑制反應(yīng)，溶解原料和促進(jìn)選擇性結(jié)晶α-和β-形式，即(16a)或(16b)之一，該形式是通過在化合物(16)中的磷酸根基團(tuán)形成鹽產(chǎn)生的，溶劑包括上述脂族烴、芳烴、鹵代烴、酯、醚、腈、酰胺、酮和選自其中的兩種或多種的混合物。
對反應(yīng)溫度沒有限定，只要它加速化合物(15)和(16)之間的平衡反應(yīng)以促進(jìn)選擇性結(jié)晶α-和β-形式即(16a)或(16b)之一，該形式是通過在化合物(16)中的磷酸根基團(tuán)形成鹽產(chǎn)生的，一般是-80℃至60℃，優(yōu)選-10℃至25℃。
完成反應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間可以取決于許多因素如原料、試劑、溶劑的類型和反應(yīng)溫度，一般是3小時(shí)-1周，優(yōu)選6小時(shí)-24小時(shí)。
對糖衍生物(1)與磷酸的比例沒有限定，反應(yīng)一般在化合物(1)∶磷酸＝1∶10-3∶1的比例下進(jìn)行。此時(shí)，反應(yīng)系統(tǒng)的pH一般是1-7，適合的是在1-4的酸性范圍。
α-或β-形式的1-磷酸化糖衍生物(16a)或(16b)可以用不同于用于由鹽交換反應(yīng)產(chǎn)生的的反應(yīng)系統(tǒng)中的堿作為磷酸鹽分離出來。
在此使用的堿包括上述無機(jī)堿基、伯烷基胺、仲烷基胺、叔烷基胺、苯胺類、吡啶類、氨基酸和任選的活性胺，和形成的鹽包括一價(jià)和二價(jià)鹽。
通過反應(yīng)式(III)可除去保護(hù)基以制備1-磷酸化糖衍生物(17a)或(17b)。反應(yīng)式(III) 在該式中，R1、R2、R3、R4、X、W、Z、n、p、q和r是如式(1)定義的；R1′和R2′獨(dú)立地代表氫、甲基、羥甲基或羧基；和R3′代表氫或?；?br> 當(dāng)使用上述脂族?；?、芳?；蛲檠豸驶鳛镽1和R2中的羥甲基或R4中的羥基的保護(hù)基時(shí)，或使用上述低級烷基作為化合物(16a)或(16b)的R1和R2中的羧基的保護(hù)基時(shí)，它可通過用在含水溶劑中的堿處理該化合物而被除去?？墒褂玫膲A優(yōu)選包括堿金屬碳酸鹽如碳酸鈉和碳酸鉀；堿金屬氫氧化物如氫氧化鋰、氫氧化鈉和氫氧化鉀；氫氧化銨如氫氧化銨和氫氧化叔正丁基銨；和上述無機(jī)堿、伯烷基胺、仲烷基胺和叔烷基胺。
可使用的溶劑沒有限制，包括通常用于水解中的溶劑；優(yōu)選水；醇如甲醇、乙醇、正丙醇和異丙醇；和上述醚。反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間沒有限制，隨許多因素而變化，如原料和所使用的堿。反應(yīng)一般可以在-10℃至100℃下進(jìn)行1小時(shí)至5天。如果適當(dāng)?shù)脑挘ㄟ^調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和試劑的當(dāng)量值，保護(hù)基R3可以脫離或同時(shí)除去。
當(dāng)使用上述芳烷基或芳烷氧基羰基作為R1和R2中的羥甲基或R4中的羥基的保護(hù)基時(shí)或使用上述芳烷基作為化合物(16a)或(16b)的R1和R2中的羧基的保護(hù)基時(shí)，例如可通過使用金屬催化劑催化氫化除去它們。
催化劑可以優(yōu)選選自鈀-碳、阮內(nèi)鎳、氧化鉑、鉑黑、銠-鋁氧化物、三苯基膦-氯化銠和鈀-鋇硫酸鹽。對反應(yīng)壓力沒有限制。一般來說，所用溶劑可以是任何通常用于水解的溶劑，沒有限制。優(yōu)選水，醇如甲醇、乙醇、正丙醇和異丙醇；和上述醚；和上述酯。反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間沒有限制，隨許多因素而變化，如原料和所使用的堿。反應(yīng)一般可以在-10℃至100℃下進(jìn)行1小時(shí)至5天。一般可以除去保護(hù)基R3。
當(dāng)使用上述甲硅烷基作為R1和R2中的羥甲基或R4中的羥基的保護(hù)基時(shí)或使用上述甲硅烷基化的低級烷基作為化合物(16a)或(16b)的R1和R2中的羧基的保護(hù)基時(shí)，例如可通過使用產(chǎn)生氟化物陰離子的化合物如氟化叔正丁基銨除去它們。
對溶劑沒有限制只要它不抑制反應(yīng)，例如可使用上述醚。反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間沒有限制，隨許多因素而變化，如原料和所使用的堿。反應(yīng)一般可以在-10℃至50℃下進(jìn)行10分鐘至10小時(shí)。一般可以除去保護(hù)基R3。
在除去任何保護(hù)基中，產(chǎn)物中的磷酸根基團(tuán)，作為與存在于反應(yīng)系統(tǒng)中的堿的鹽得到。如果需要，該鹽可以轉(zhuǎn)化為與另一種堿基的鹽。此時(shí)，所用堿可選自上述無機(jī)堿、伯烷基胺、仲烷基胺、叔烷基胺、苯胺類、吡啶類、氨基酸和任選的活性胺，和形成的鹽包括一價(jià)和二價(jià)鹽。
本文使用的1-磷酸化糖衍生物是糖或其衍生物，其中磷酸部分在1-位通過酯鍵偶合。
它可由式(6)具體表示 其中R1和R2獨(dú)立地表示氫、甲基、羥甲基或羧基；R3、X、W、Z、n、p、q和r是如式(4)定義的。
典型的實(shí)例包括但不限于核糖-1-磷酸酯、2-脫氧核糖-1-磷酸酯、2，3-二脫氧核糖-1-磷酸酯和阿拉伯糖-1-磷酸酯，但可以使用任何衍生物而沒有區(qū)別，只要它可通過任何上述高通用和端基異構(gòu)體選擇性的制備方法獲得。
來自天然物質(zhì)構(gòu)成1-磷酸化糖衍生物的糖的實(shí)例包括但不限于戊醛糖如D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、L-來蘇糖和D-核糖；戊酮糖如D-木糖、L-木糖和D-核酮糖；己醛糖如D-半乳糖、L-半乳糖、D-葡萄糖、D-塔羅糖和D-甘露糖；己酮糖如D-塔格糖、L-山梨糖、D-阿洛酮糖和D-果糖；脫氧糖如D-2-脫氧核糖、D-2，3-二脫氧核糖、D-巖藻糖、L-巖藻糖、D-鼠李糖、L-鼠李糖、D-吡喃巖藻糖(fucopyranose)、L-吡喃巖藻糖、D-鼠李呋喃糖、L-鼠李呋喃糖、D-阿洛甲基糖、D-異鼠李糖、D-antiallose、D-塔羅甲基糖、L-塔羅甲基糖、D-毛地黃糖、D-毛地黃毒素糖、D-磁麻糖、泰威糖、阿比可糖、泊雷糖、可立糖和ascarilose、氨基糖如葡糖胺和daunosamine；和糖醛酸如葡糖醛酸和半乳糖醛酸。
將描述制備本發(fā)明的核苷的方法。用在該方法中的堿基是天然或合成的堿基，選自嘧啶、嘌呤、氮嘌呤和脫氮嘌呤，它們可用鹵素、烷基、鹵代烷基、鏈烯基、鹵代鏈烯基、炔基、氨基、烷氨基、羥基、羥氨基、氨氧基、烷氧基、巰基、烷巰基、芳基、芳氧基和/或氰基取代。
作為取代基的鹵素的實(shí)例包括氯、氟、溴和碘。烷基的實(shí)例包括1-7個碳原子的低級烷基如甲基、乙基和丙基。鹵代烷基的實(shí)例包括具有1-7個碳原子的烷基的那些如氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、溴甲基和溴乙基。鏈烯基的實(shí)例包括具有2-7個碳原子的那些如乙烯基和烯丙基。鹵代烷基的實(shí)例包括具有2-7個碳原子的鏈烯基如那些如溴乙烯基和氯乙烯基。炔基的實(shí)例包括帶有2-7個碳原子的那些如乙炔基和丙炔基。烷氨基的實(shí)例包括具有1-7個碳原子的烷基的那些如甲氨基和乙氨基。烷氧基的實(shí)例包括具有1-7個碳原子的那些如甲氧基和乙氧基。烷巰基的實(shí)例包括具有1-7個碳原子的烷基的那些如甲巰基和乙?guī)€基。芳基的實(shí)例包括苯基；帶有1-5個碳原子的烷基的烷基苯基如甲基苯基和乙基苯基；；帶有1-5個碳原子的烷氧基的烷氧基苯基如甲氧基苯基和乙氧基苯基；帶有1-5個碳原子的烷氨基的烷氨基苯基如二甲氨基苯基和二乙氨基苯基；和鹵代苯基如氯苯基和溴苯基。
嘧啶堿基的實(shí)例包括胞嘧啶、尿嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶(胸腺嘧啶)、5-乙基胞嘧啶、5-乙基尿嘧啶、5-氟甲基胞嘧啶、5-氟甲基尿嘧啶、5-三氟胞嘧啶、5-三氟尿嘧啶、5-乙烯基尿嘧啶、5-溴乙烯基尿嘧啶、5-氯乙烯基尿嘧啶、5-乙炔基胞嘧啶、5-乙炔基尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、嘧啶-2-酮、4-羥氨基嘧啶-2-酮、4-氨氧基嘧啶-2-酮、4-甲氧基嘧啶-2-酮、4-乙酰氧基嘧啶-2-酮、4-氟嘧啶-2-酮和5-氟嘧啶-2-酮。
嘌呤堿基的實(shí)例包括嘌呤、6-氨基嘌呤(腺嘌呤)、6-羥基嘌呤、6-氟嘌呤、6-氯嘌呤、6-甲氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、6-三氟甲基氨基嘌呤、6-苯甲?；被堰省?-乙?；被堰?、6-羥氨基嘌呤、6-氨氧基嘌呤、6-甲氧基嘌呤、6-乙酰氧基嘌呤、6-苯甲酰氧基嘌呤、6-甲基嘌呤、6-乙基嘌呤、6-三氟甲基嘌呤、6-苯基嘌呤、6-巰基嘌呤、6-甲巰基嘌呤、6-氨基嘌呤-1-氧化物、6-羥基嘌呤-1-氧化物、2-氨基-6-羥基嘌呤(鳥嘌呤)、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2-氨基-6-碘嘌呤、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-巰基嘌呤、2-氨基-6-甲巰基嘌呤、2-氨基-6-羥氨基嘌呤、2-氨基-6-甲氧基嘌呤、2-氨基-6-苯甲酰氧基嘌呤、2-氨基-6-乙酰氧基嘌呤、2-氨基-6-甲基嘌呤、2-氨基-6-環(huán)丙基氨基甲基嘌呤、2-氨基-6-苯基嘌呤、2-氨基-8-溴嘌呤、6-氰基嘌呤、6-氨基-2-氯嘌呤(2-氯腺嘌呤)和6-氨基-2-氟嘌呤(2-氟腺嘌呤)。
氮嘌呤和脫氮嘌呤堿基的實(shí)例包括6-氨基-3-脫氮嘌呤、6-氨基-8-氮嘌呤、2-氨基-6-羥基-8-氮嘌呤、6-氨基-7-脫氮嘌呤、6-氨基-1-脫氮嘌呤和6-氨基-氮嘌呤。
核苷磷酸化酶是能夠在磷酸存在下磷酸解核苷中的N-苷鍵的酶的通稱，本發(fā)明利用其逆反應(yīng)。用于反應(yīng)中的酶可以是任何類型或來源的，只要它具有由相應(yīng)的1-磷酸化糖衍生物和堿基形成所需的核苷的活性。酶一般歸為兩類，嘌呤和嘧啶型。嘌呤型酶的實(shí)例包括嘌呤核苷磷酸化酶(EC2.4.2.1)和鳥嘌呤核苷磷酸化酶(EC2.4.2.15)。嘧啶型酶的實(shí)例包括嘧啶核苷磷酸化酶(EC2.4.2.2)、尿苷磷酸化酶(EC2.4.2.3)、胸苷磷酸化酶(EC2.4.2.4)和脫氧尿苷磷酸化酶(EC2.4.2.23)。
在本發(fā)明中表達(dá)核苷磷酸化酶的微生物沒有限制，可以是任何表達(dá)至少一種選自下述的核苷磷酸化酶的微生物嘌呤核苷磷酸化酶(EC2.4.2.1)、鳥嘌呤核苷磷酸化酶(EC2.4.2.15)、嘧啶核苷磷酸化酶(EC2.4.2.2)、尿苷磷酸化酶(EC2.4.2.3)、胸苷磷酸化酶(EC2.4.2.4)和脫氧尿苷磷酸化酶(EC2.4.2.23)。
優(yōu)選的這樣的微生物的實(shí)例包括屬于諾卡氏菌屬、細(xì)桿菌屬、棒狀桿菌屬、短頸細(xì)菌屬、單胞菌族、Flabobacterium、Kluyvere、細(xì)桿菌屬、嗜血桿菌屬、Micoplana、精蛋白桿菌屬、念珠菌屬、酵母屬、桿菌屬、嗜熱桿菌、假單胞菌屬、微球菌、哈夫尼菌屬、變形桿菌屬、弧菌屬、葡萄球菌屬、丙酸菌屬、Sartina、游動球菌屬、埃希氏桿菌屬、庫爾特氏桿菌屬、紅球菌屬、不動桿菌屬、黃桿菌屬(Xanthobacter)、鏈霉菌屬、根瘤菌屬、沙門氏菌屬、克雷白氏桿菌屬、腸桿菌屬、歐文氏菌屬、氣單胞菌屬、檸檬桿菌屬、無色桿菌屬、土壤桿菌屬、節(jié)桿菌屬和假諾卡氏菌屬的菌株。
近年來的分子生物學(xué)和基因工程的進(jìn)步允許我們分析分子生物特性、氨基酸序列以及在為從菌株獲得蛋白質(zhì)的基因的上述菌株中的核苷磷酸化酶的上述特性，以便構(gòu)建重組質(zhì)粒，其中插入基因和其表達(dá)所需的控制區(qū)域以便將質(zhì)粒引入給定的宿主和產(chǎn)生表達(dá)蛋白質(zhì)的基因重組菌株，這些方法已變得相對較容易。根據(jù)最近的技術(shù)水平，將其中的核苷磷酸化酶的基因引入給定的宿主的該基因重組菌株也包括在本發(fā)明的表達(dá)核苷磷酸化酶的微生物中。
在此表達(dá)所需的控制區(qū)域可以是啟動子序列(包括控制轉(zhuǎn)錄的操縱基因序列)，核糖體結(jié)合序列(SD序列)，轉(zhuǎn)錄終止序列等。啟動子序列的實(shí)例包括來源于大腸桿菌的色氨酸操縱子中的trp操縱基因；乳糖操縱子中的lac啟動子；來源于λ噬菌體的PL和PR啟動子；來源于枯草芽孢桿菌的葡糖酸合酶啟動子(gnt)；堿性蛋白酶啟動子(apr)；中性蛋白酶啟動子(npr)和α-淀粉酶啟動子(amy)。可以使用專門改性和設(shè)計(jì)的序列例如tac啟動子。核糖體鍵合序列可以例如是來源于大腸桿菌或枯草芽孢桿菌的序列，但也可以使用任何序列，只要它在所需的宿主例如大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中起作用。例如，人們可以使用由DNA合成形成的共有序列，即和16S核糖體RNA中的3′-末端區(qū)域互補(bǔ)的有超過4個連續(xù)堿基的序列。不總是需要轉(zhuǎn)錄終止序列，但是可以使用不依賴于ρ-因子的終止子如脂蛋白終止子和trp操縱子終止子。希望在重組質(zhì)粒上的這些控制區(qū)域可以順序地排列如下從5′-末端上游、啟動子序列、核糖體鍵合序列、核苷磷酸化酶編碼基因和轉(zhuǎn)錄終止序列。
本文中的質(zhì)粒的實(shí)例可以使用在大腸桿菌中具有自主復(fù)制區(qū)域的pBR322、pUC18、Bluescript II SK(+)、pKK223-3和pSC101；在枯草芽孢桿菌中具有自主復(fù)制區(qū)域的pUB110、pTZ4、pC194、ρ11、φ1和φ105，作為載體。在兩個或更多的宿主中可自主復(fù)制的質(zhì)粒的實(shí)例中，可以使用pHV14、TRp7、Yep7和pBS7，作為載體。
本文中給定的宿主典型地是，但不限于如后面實(shí)施例描述的大腸桿菌，但也可以使用其它菌株如包括枯草芽孢桿菌的枯草菌屬屬、酵母和放線菌屬。
本發(fā)明的核苷磷酸化酶活性除了從上述具有酶活性的菌株獲得外，還可以從顯示酶活性的菌株的經(jīng)加工的材料和其固定化產(chǎn)物獲得。菌株經(jīng)加工的材料可以是，例如丙酮干燥的菌株或通過適當(dāng)?shù)牟襟E如機(jī)械破壞、超聲分裂、冷凍和解凍、加壓和減壓、滲透壓方法、自溶、細(xì)胞壁分解和表面活性劑處理制備的細(xì)菌碎片。如果需要，可通過硫酸銨沉淀、丙酮沉淀或柱色譜法進(jìn)一步純化菌株。
本發(fā)明中，能夠和磷酸根離子形成水不溶性鹽的金屬陽離子沒有限制，可以是任何在反應(yīng)中和磷酸根離子形成作為副產(chǎn)物的水不溶性鹽的并可沉淀的金屬陽離子，例如鈣、鎂、鋇、鐵、鈷、鎳、銅、銀、鉬、鉛、鋅和鋰離子。其中，特別優(yōu)選工業(yè)上通用的且安全的對反應(yīng)沒有副作用的金屬離子，如鈣、鋇、鋁和鎂離子。
本發(fā)明中能夠和磷酸根離子形成水不溶性鹽的金屬陽離子可以通過將帶有至少一種陰離子的能夠和磷酸根離子形成水不溶性鹽的金屬陽離子的鹽加進(jìn)反應(yīng)溶液中而獲得，所述陰離子選自氯離子、氮化物離子、碳酸根離子、硫酸根離子、醋酸根離子和氫氧根離子。這樣的鹽的實(shí)例包括氯化鈣、氮化鈣、碳酸鈣、硫酸鈣、醋酸鈣、氯化鋇、氮化鋇、碳酸鋇、硫酸鋇、醋酸鋇、氯化鋁、氮化鋁、碳酸鋁、硫酸鋁、醋酸鋁、氫氧化鈣、氫氧化鋇、氫氧化鋁、氫氧化鎂、氯化鎂、氮化鎂、碳酸鎂、硫酸鎂和醋酸鎂。
這樣的金屬陽離子可以在反應(yīng)溶液中作為帶有戊糖-1-磷酸的鹽存在，例如核糖-1-磷酸鈣鹽、2-脫氧核糖-1-磷酸鈣鹽、2，3-二脫氧核糖-1-磷酸鈣鹽、阿拉伯糖-1-磷酸鈣鹽、核糖-1-磷酸鋇鹽、2-脫氧核糖-1-磷酸鋇鹽、2，3-二脫氧核糖-1-磷酸鋇鹽、阿拉伯糖-1-磷酸鋇鹽、核糖-1-磷酸鋁鹽、2-脫氧核糖-1-磷酸鋁鹽、2，3-二脫氧核糖-1-磷酸鋁鹽和阿拉伯糖-1-磷酸鋁鹽。
本發(fā)明中制備核苷化合物的反應(yīng)可以在諸如適當(dāng)?shù)膒H和溫度以及在其控制范圍內(nèi)的條件下進(jìn)行，這取決于目標(biāo)核苷、1-磷酸化糖衍生物和作為底物的堿基、核苷磷酸化酶或表達(dá)作為反應(yīng)催化劑的酶的活性的微生物以及為從反應(yīng)系統(tǒng)除去磷酸而添加的金屬鹽的類型和特性，一般是在pH5-10，溫度10-60℃下進(jìn)行。如果pH不在控制范圍內(nèi)，由于例如目標(biāo)產(chǎn)物或底物差的穩(wěn)定性，酶活性降低和不能和磷酸形成水不溶性鹽，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率可能降低。如果pH在反應(yīng)過程中變化，當(dāng)需要時(shí)，可以在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間添加酸如鹽酸和硫酸或堿如氫氧化鈉和氫氧化鉀。1-磷酸化糖衍生物和堿基的濃度適合的是約0.1-1000mM。根據(jù)它們之間的摩爾比，堿基與1-磷酸化糖衍生物或其鹽的摩爾比是1-10，根據(jù)反應(yīng)轉(zhuǎn)化率，優(yōu)選0.95或更小。
添加的可以和磷酸形成水不溶性鹽的金屬鹽可以和用于反應(yīng)的1-磷酸化糖衍生物以0.1-10，更優(yōu)選0.5-5的摩爾比添加。對鹽的添加步驟沒有限定，它可以在反應(yīng)過程中一部分添加或分批添加。本發(fā)明主要用水作為溶劑，如果需要，也可以添加適當(dāng)量的一般用于常用酶反應(yīng)中的有機(jī)溶劑如醇和二甲亞砜。在較高濃度的反應(yīng)中，作為底物的堿基或作為產(chǎn)物的核苷在反應(yīng)溶液中可能不是完全溶解。本發(fā)明也適用于這樣的情況。
通過常規(guī)步驟分離可以上述生產(chǎn)的核苷化合物，例如濃縮、結(jié)晶、溶解、電滲析以及使用離子交換樹脂或木炭的附吸和解吸。
為了制備分析樣品，將這些化合物轉(zhuǎn)化為環(huán)乙胺鹽，然后通過硅膠柱色譜純化，從用甲醇-乙酸乙酯(1∶10)洗脫部分得到標(biāo)題化合物(19)的兩種端基異構(gòu)體(19a)和(19b)。(19a)較小極性部分1H NMR(CDCl3，270MHz)d；8.0-7.8(m，8H)，7.4-7.2(m，8H)，6.06(m，1.2H)，5.98(m，0.8H)，5.56(m，1.2H)，5.41(m，0.8H)，4.7-4.3(m，6H)，2.6-2.4(m，1H)，2.75-2.6(m，2H)，2.5-2.3(m，2H)，2.2-1.9(m，2H)，1.8-1.6(m，2H)，1.6-0.9(m，8H)；MS(APCI)m/z 883(M-H).(19b)較大極性部分1H NMR(CDCl3，270MHz)d8.0-7.8(m，8H)，7.4-7.2(m，8H)，6.1-5.9(m，2H)，5.55(m，0.67H)，5.39(m，1.33H)，4.7-4.3(m，6H)，3.1-2.85(m，1H)，2.75-2.4(m，2H)，2.32(m，2H)，2.2-1.9(m，2H)，1.8-1.6(m，2H)，1.6-0.9(m，8H)；MS(APCI)m/z 883(M-H).
往49mL2-丁酮中的1.11g正磷酸的混合物中添加2.11g三-正丁胺和4.9g分子篩4A，在攪拌下冷卻混合物至5℃。往混合物中添加4.9g3，5-O-雙(4-氯苯甲?；?-2-脫氧-α-D-核糖基氯(純度85％)，攪拌該混合物10分鐘，得到在2-丁酮中的標(biāo)題化合物(18)和(19)的混合物的溶液[(18)∶(19)＝1∶4，α-型/β型的化合物(18)＝7/10]。
1H NMR(DMSO-d6，270MHz)d8.00(d，J＝8.6Hz，2H)，7.96(d，J＝8.6Hz，2H)，7.58(d，J＝8.6Hz，2H)，7.58(d，J＝8.6Hz，2H)，5.82(dd，J＝5.3，5.3Hz，1H)，5.36(d，J＝8.6Hz，1H)，4.6-4.3(m，3H)，4.7-3.5(br，6H)，2.7-2.6(m，2H)，2.55-2.4(m，1H)，2.25(d，J＝4.2Hz，1H)，1.85-1.75(m，4H)，1.7-1.6(m，4H)，1.55-1.45(m，2H)，1.25-0.9(m，10H)；MS(APCI)m/z 590(M+C6H14N).
1H NMR(D2O，270MHz)d5.56(s，1H)4.03(m，2H)，3.52(dd，J＝3.3，12.2Hz，1H)，3.41(dd，J＝5.3，12.2Hz，1H)，2.17(m，1H)，1.87(d，J＝13.9Hz，1H)；MS(APCI)m/z213(M-H)。
1H NMR(DMSO-d6，270MHz)d8.2-7.8(m，6H)，7.6-7.4(m，6H)，5.9-5.7(m，1H)，5.6-5.4(m，3H)，4.6-4.3(m，1H)，4.7-3.5(br，6H)，2.7-2.6(m，2H)，1.9-1.7(m，4H)，1.7-1.6(m，4H)，1.55-1.4(m，2H)，1.3-0.9(m，10H)；MS(APCI)m/z 745(M+C6H14N).
1H NMR(D2O，270MHz)d5.6(m，1H)4.2(m，1H)，4.1-4.0(m，2H)，3.75(m，1H)，3.7(m，1H)；MS(APCI)m/z229(M-H)。
1H NMR(DMSO-d6，270MHz)d8.2-7.8(m，2H)，7.6-7.4(m，2H)，5.9-5.7(m，1H)，5.6-5.4(m，1H)，4.6-4.3(m，1H)，4.7-3.5(br，6H)，2.7-2.6(m，2H)，1.9-1.7(m，8H)，1.7-1.6(m，4H)，1.55-1.4(m，2H)，1.3-0.9(m，10H)；MS(APCI)m/z 374(M+C6H14N).
1H NMR(D2O，270MHz) d5.2(m，1H)4.1-3.9(m，1H)，3.6-3.3(m，2H)，2.1-2.3(m，2H)，1.9-1.7(m，2H)；MS(APCI)m/z197(M-H)。
MS(APCI)m/z 745(M+C6H14N)。
1H NMR(D2O，270MHz)d5.3(m，1H)，3.95-3.3(m，5H)；MS(APCI)m/z229(M-H)。
1H-NMR(D2O)δ0.98-1.10(2H，m)，1.14-1.23(6H，m)，1.47-1.51(2H，m)，1.61-1.64(4H，m)，1.78-1.83(4H，m)，2.94-3.00(2H，m)，3.46-3.60(2H，m)，3.72-3.79(1H，m)，3.92-4.00(1H，m)，4.41-4.51(2H，m)，5.01-5.03 and5.22-5.24(total 1H，m)，5.64-5.72(total 1H，m)，7.24-7.30(5H，m)；MS(APCI)m/z390(M+C6H14N)+.
1H-NMR(D2O)δ0.99-1.06(2H，m)，1.10-1.24(6H，m)，1.47-1.50(2H，m)，1.62-1.66(4H，m)，1.80-1.85(4H，m)，1.96-3.02(2H，m)，3.51-3.57(2H，m)，3.72-3.79(1H，m)，3.93-4.00(1H，m)，4.99-5.01 and 5.13-5.15(全部1H，m)，5.64-5.67和5.70-5.73(全部1H，m)；MS(APCI)m/z199(M-H)-.實(shí)施例17制備2，3-二脫氧-3-氟-5-O-(4-苯基苯甲?；?-α-D-赤蘚呋喃戊糖(erythropentofuranose)-1-磷酸酯(29)在室溫下將70mg分子篩4A加到62mg正磷酸、52μL三-正丁胺和0.7mL乙腈的經(jīng)攪拌的混合物中，在冰浴中攪拌該混合物。往該混合物中添加70mg 2，3-二脫氧-3-氟-5-O-(4-苯基苯甲?；?-D-赤蘚呋喃戊糖基氯，使該混合物在相同的溫度下反應(yīng)1天。然后，往該混合物中添加156μL三-正丁胺，然后添加去離子水。使該混合物和甲苯反應(yīng)三次。往該有機(jī)層添加48μl環(huán)己胺，攪拌該混合物30分鐘。在真空下濃縮該混合物，添加丙酮以形成通過過濾收集的沉淀。用氯仿洗滌殘余物并在室溫下真空干燥，得到化合物(29)的二環(huán)己胺，為白色固體。
1H-NMR(CD3OD)δ1.1-1.4(10H，m)，1.65(2H，m)，1.89(4H，m)，1.96(4H，m)，2.3-2.5(2H，m)，2.91(2H，m)，4.5(2H，m)，4.6-4.8(1H，m)，5.1-5.3(1H，m)，5.97(1H，m)，7.41(1H，m)，7.47(2H，m)，7.68(2H，m)，7.75(2H，m)，8.08(2H，m)；MS(APCI)m/z496(M+C6H14N)+.
1H-NMR(CD3OD)δ1.1-1.4(10H，m)，1.66(2H，m)，1.79(4H，m)，1.94(4H，m)，2.3-2.4(2H，m)，2.88(2H，m)，3.59(2H，m)，4.3-4.4(1H，m)，5.11(0.5H，m；其它0.5H是不能區(qū)分的，因?yàn)樗谒姆宓暮竺?，5.89(1H，m)；MS(APCI)m/z215(M-H)-。
1H-NMR(CD3OD)δ1.1-1.4ppm(10H，m)，1.66(2H，m)，1.78(4H，m)，1.98(4H，m)，2.3-2.6(2H，m)，2.89(2H，m)，4.44 & 4.46(α&β，2H)，4.6-4.8(1H，m)，5.1-5.3 &5.3-5.4(α&β，1H，m)，5.97 & 6.00(α&β，1H，m)，7.40(1H，m)，7.47(2H，m)，7.68(2H，m)，7.75(2H，m)，8.07(1H，m)，8.13(1H，m).
1H-NMR(CD3OD)δ1.1-1.4ppm(10H，m)，1.67(2H，m)，1.79(4H，m)，2.2-2.4(2H，m)，2.94(2H，m)，3.59和3.62(α和β，2H，m)，3.3-3.4(2H，m)，5.10和5.1-5.24(α和β，0.5H和1H，m，α-型的0.5H不能區(qū)分，因?yàn)樾盘栐谒宓暮竺?，5.88和5.93(α和β，1H，m)。
MS(APCI)m/z451(M-H)-；IR(KBr)cm-13448，2963，1721，1453，1278，1111，976，711，558。
1H-NMR(D2O)δ3.37(s，3H)，3.49(dd，1H，J＝4.9Hz，12.7Hz)，3.62(d，1H，J＝4.9Hz)，3.69(dd，1H，J＝2.7Hz，12.7Hz)，3.74-3.78(m，1H)，4.28(dd，1H，J＝4.6Hz，7.8Hz)，5.39(d，1H，J＝5.9Hz)；MS(APCI)m/z243(M-H)-.
1H NMR(D2O)d5.57(dd，J＝5.1，6.1Hz，1H)，4.03(m，2H)，3.54(ddd，J＝1.2，2.2，12.2 Hz，1H)，3.42(ddd，J＝1.2，5.1，12.2Hz，1H)，3.18-2.94(m，2H)，2.17(m，1H)，1.90(d，J＝1.2，12.8Hz，1H)，1.8-1.45(m，10H)，1.25-0.9(m，12H).
元素分析計(jì)算值C5H9O7P·C12H28N2，C49.50％；H9.04％；N6.79％；P7.51％，實(shí)測值C49.26％；H8.81％；N6.64％；P7.29％.
使用基于在大腸桿菌中的已知的deoD基因的序列而設(shè)計(jì)的SEQID Nos.1和2的低聚核苷酸(帶有堿基號碼11531-12250的編碼區(qū)域的基因庫序號AE000508)作為PCR的引物。這些引物分別具有靠近5′-和3′-末端的EcoRI和Hind III的限制酶識別序列。
SEQ ID No.1GTGAATTCAC AAAAAGGATA AAACAATGGCSEQ ID No.2TCGAAGCTTG CGAAACACAA TTACTCTTT使用0.1mL含有完全被限制酶Hind III和引物(每個為3μM)消化的6ng/μL上述大腸桿菌染色體DNA的PCR反應(yīng)溶液，在變性條件下進(jìn)行30次PCR循環(huán)每此循環(huán)96℃，1分鐘；退火55℃，1分鐘；延伸74℃，1分鐘每個循環(huán)。
通過EcoRI和Hind III消化上述反應(yīng)產(chǎn)物和質(zhì)粒pUC18(TakaraShuzo有限公司)和使用Ligation-High(Toyobo有限公司)進(jìn)行連接。使用獲得的重組質(zhì)粒以轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。在含有50μg/mL氨芐青霉素和X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-半乳糖甙)的LB瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)移的菌株以提供作為白色菌落的抗Am的轉(zhuǎn)化體。從由此獲得的轉(zhuǎn)化體萃取質(zhì)粒，其中已插入所需DNA片段的質(zhì)粒稱為pUC-PNP73。由此獲得的轉(zhuǎn)化體稱為大腸桿菌MT-10905。
通過在含有50μg/mLAm的100mLLB培養(yǎng)基中，在37℃下?lián)u動過夜，培養(yǎng)大腸桿菌MT-10905。在13000rpm下離心培養(yǎng)基10分鐘以收集細(xì)菌。將細(xì)菌懸浮在10mL10mM的Tris-hydrochloride緩沖劑(pH8.0)中，進(jìn)行超聲處理，得到以后用作酶源的勻漿。
通過往實(shí)施例8制備的2.5mM2-脫氧-α-D-核糖-1-磷酸二銨鹽、2.5mM腺嘌呤(Wako Pure Chemicals，超純級)、0.1mL來自產(chǎn)嘌呤核苷-磷酸化酶的菌株的超聲酶勻漿和10mM Tris-hydrochloride緩沖劑(pH7.4)的混合物中添加不同濃度的氯化鈣(Waco Pure Chemicals，超純級)來制備反應(yīng)溶液。使1mL反應(yīng)溶果。(實(shí)施例10)

圖19A至19D為示意的剖面圖，所示的是這個實(shí)施例的閃爍器面板。在這個實(shí)施例中，通過浸漬的方法為無定形碳130基體元件形成一個聚酰亞胺樹脂131作為絕緣層。通過浸漬的方法形成聚酰亞胺樹脂131作為絕緣層的好處在于，無定形碳130的整個外周可以被聚酰亞胺樹脂131涂層，作為一個具有耐熱性的絕緣層。
因此，無定形碳130的整個外周被聚酰亞胺樹脂131涂覆，在基體元件側(cè)部形成絕緣。所以，如圖19B所示，當(dāng)一個鋁制成的反射層132被形成時(shí)，由于在遮蓋時(shí)并不需要噴鍍，所以，可以更進(jìn)一步增加熒光物質(zhì)層的有效面積。
在圖19C中，一種用于反射層保護(hù)層的聚酰亞胺樹脂133形成在鋁制反射層132上，如圖19D中所示，一個熒光層(CsI)134形成在基體元件的大體整個表面上。然后，形成一個聚對苯二甲基(parylene)保護(hù)層135。從而，閃爍器面板136被制成。在這個實(shí)施例中，絕緣層131和用于反射層保護(hù)膜133都設(shè)置在基體元件的整個表面上。然而，即使當(dāng)其中之一被設(shè)置時(shí)，也能起到足夠的效果。當(dāng)兩者都設(shè)置時(shí)，效果會得到進(jìn)一步提高。
表2所示的是對實(shí)施例6、實(shí)施例7以及圖10A所示結(jié)構(gòu)(具有基體元件、絕緣層、反射層、熒光層和保護(hù)層的結(jié)構(gòu)，并且反射層延伸到絕緣層的端表面上)的單個閃爍器面板同時(shí)進(jìn)行溫度和濕度耐久性試驗(yàn)時(shí)獲得的結(jié)果。
表2

從表2可以看出，根據(jù)實(shí)施例6和7的結(jié)構(gòu)，與反射層的端部與絕緣層的端部對齊的結(jié)構(gòu)相比，能進(jìn)一步提高耐久性。此外，很明顯，在實(shí)施例7中獲得高的耐久性。
條件溫度70℃、濕度90％。評價(jià)是在鋁的電化學(xué)腐蝕產(chǎn)生時(shí)(確定花紋出現(xiàn)或者不出現(xiàn))根據(jù)視覺作出的。
(實(shí)施例11)圖20為一個方框圖，示出實(shí)施例11的X光診斷系統(tǒng)的示意結(jié)構(gòu)。由一個X制備2′-脫氧腺苷(3)如實(shí)施例25所述的進(jìn)行反應(yīng)，除了用10mM氯化鋇代替氯化鈣。反應(yīng)結(jié)束時(shí)，形成白色沉淀物。如實(shí)施例25所述的反應(yīng)后溶液的HPLC分析表明了在所有反應(yīng)后溶液中的一個和2′-脫氧腺苷(Wako PureChemicals，超純級)的峰完全相同的峰。計(jì)算在確定反應(yīng)后溶液中的2′-脫氧腺苷的濃度后的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為92.4％。
柱溫40℃泵流速1.0mL/min檢測UV254nm洗脫劑25mM磷酸二氫鉀∶甲醇＝875∶125(V/V)
柱溫40℃泵流速1.0mL/min檢測UV254nm洗脫劑25mM磷酸二氫鉀∶甲醇＝75∶25(V/V)
如實(shí)施例34所述進(jìn)行反應(yīng)，所不同的是添加2-氨基-6-環(huán)丙基氨基嘌呤來代替2-氨基-6-氯嘌呤。如實(shí)施例38所述的反應(yīng)后溶液的HPLC分析表明了一個2-氨基-6-環(huán)丙基氨基嘌呤-2′-脫氧-β-D-核苷的峰。確定反應(yīng)后溶液中的2-氨基-6-環(huán)丙基氨基嘌呤-2′-脫氧-β-D-核苷的濃度后，計(jì)算反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為87.6％。
柱溫40℃泵流速1.0mL/min檢測UV254nm洗脫劑25mM磷酸二氫鉀∶甲醇＝75∶25(V/V)
柱溫40℃泵流速1.0mL/min檢測UV254nm洗脫劑25mM磷酸二氫鉀∶甲醇＝50∶50(V/V)LC-MS分析數(shù)據(jù)MS(APCI)m/z236(MH)+
柱溫40℃泵流速1.0mL/min檢測UV254nm洗脫劑25mM磷酸二氫鉀∶甲醇＝875∶125(V/V)LC-MS分析數(shù)據(jù)MS(APCI)m/z253(MH)+
柱溫40℃泵流速1.0mL/min檢測UV254nm洗脫劑25mM磷酸二氫鉀∶甲醇＝875∶125(V/V)
柱溫40℃泵流速1.0mL/min檢測UV210nm洗脫劑25mM磷酸二氫鉀柱溫40℃泵流速1.0mL/min檢測UV254nm洗脫劑25mM磷酸二氫鉀∶甲醇＝93∶7(V/V)
工業(yè)實(shí)用性如上所述，本發(fā)明作為生產(chǎn)1-磷酸化糖衍生物或核苷的端基異構(gòu)體選擇性的方法是相當(dāng)有用的，并且可以預(yù)期可用于各種應(yīng)用領(lǐng)域。
序列表<110>MITSUI CHEMICALS，INC.<120>糖-1-磷酸酯的端基異構(gòu)體選擇性合成及其核苷的合成<130>MCI01P018-jn<160>2<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>作為用于克隆大腸桿菌K-12的嘌呤核苷磷酸化酶的PCR引物的低聚核苷酸<400>1gtgaattcac aaaaaggata aaacaatggc 30<210>2<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>作為用于克隆大腸桿菌K-12的嘌呤核苷磷酸化酶的PCR引物的低聚核苷酸<400>2tcgaagcttg cgaaacacaa ttactcttt 29
權(quán)利要求
1.一種選擇性制備1-磷酸化糖衍生物單體的α或β異構(gòu)體的方法，該方法包含磷酸解和異構(gòu)化1-磷酸化糖衍生物的端基異構(gòu)體混合物，得到1-磷酸化糖衍生物單體的α和β異構(gòu)體，和選擇性結(jié)晶這些異構(gòu)體之一以取代這些端基異構(gòu)體之間的平衡的步驟。
2.一種選擇性制備1-磷酸化糖衍生物單體的α或β異構(gòu)體的方法，該方法包含磷酸解和異構(gòu)化由式(1)表示的1-磷酸化糖衍生物的端基異構(gòu)體混合物的步驟 其中，R1和R2獨(dú)立地表示氫，甲基，被保護(hù)的羥甲基或被保護(hù)的羧基；R3表示?；?；R4表示羥基的保護(hù)基；X表示鹵素，烷氧基或烷硫基；W表示氧或硫；Z表示氧，硫或任選取代的碳；m表示1-3的整數(shù)；n表示0或1；p和q表示0-4的整數(shù)；和r表示0或1；條件是，當(dāng)z是氧或硫時(shí)，p、q、r和n滿足p+r≤n+1和q≤2×(n+1)-2×(p+r)和當(dāng)z是碳時(shí)，p+r≤n+2和q≤2×(n+2)-2×(p+r)的條件，得到1-磷酸化糖衍生物單體的α和β異構(gòu)體，和選擇性結(jié)晶這些異構(gòu)體的一種以取代這些端基異構(gòu)體之間的平衡。
3.一種制備由式(3)表示的1-磷酸化糖衍生物單體的方法 其中R1和R2獨(dú)立地表示氫，甲基，羥甲基或羧基；R3表示氫或?；?；和X、W、Z、n、p、q和r是如上所定義的，該方法包含磷酸解和異構(gòu)化由式(1)表示的1-磷酸化糖衍生物的端基異構(gòu)體混合物的步驟 其中R1、R2、R3、R4、X、W、Z、m、n、p、q和r是如 2所定義的，得到1-磷酸化糖衍生物單體的α和β異構(gòu)體；選擇性結(jié)晶這些異構(gòu)體的一種以取代這些端基異構(gòu)體之間的平衡；然后除去由R4表示的保護(hù)基團(tuán)。
4.由式(4)表示的1-磷酸化糖衍生物的三聚物、二聚物或單體或其鹽 其中R1和R2獨(dú)立地表示氫，甲基，用取代的苯甲?；Ｗo(hù)的羥甲基或被保護(hù)的羧基；R4表示氫或羥基的保護(hù)基；和R3、X、W、Z、m、n、p、q和r是如權(quán)利要求2所定義。
5.由式(5)表示的1-磷酸化糖衍生物單體或其鹽 其中p和q表示0-3的整數(shù)；r表示0或1；和R1、R2、R3、R4、X、W和Z是如權(quán)利要求2所定義的；條件是當(dāng)Z是氧或硫時(shí)，p、q和r滿足p+q+r≤3和當(dāng)Z是碳時(shí)，p+q+r≤5的條件。
6.由式(6)表示的1-磷酸化糖衍生物單體或其鹽 其中R1和R2獨(dú)立地表示氫，甲基，羥甲基或羧基；R3、X、W、Z、n、p、q和r是如權(quán)利要求2所定義的，除天然產(chǎn)物之外。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的1-磷酸化糖衍生物單體，其中式(6)中n＝1，或其鹽。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的1-磷酸化糖衍生物單體，其中R1是羥甲基；R2是氫；p和r是0；和X是氟，或其鹽。
9.一種制備由式(20)表示的1-磷酸化糖的方法 其中R11表示被保護(hù)的羥甲基和R14表示羥基的保護(hù)基，該方法包含在堿的存在下，用磷酸處理由式(18)表示的化合物的步驟 其中其中R11和R14如上定義，得到由式(19)表示的1-磷酸化糖衍生物的端基異構(gòu)體混合物 其中R11和R14如上定義，m是如權(quán)利要求2定義的；磷酸解和異構(gòu)化該混合物；和通過選擇性結(jié)晶形成的α-異構(gòu)體，取代端基異構(gòu)體間的平衡。
10.一種制備2-脫氧-α-D-核糖-1-磷酸酯的方法，該方法包含在堿存在下，用磷酸處理式(18)表示的化合物的步驟 其中R11表示被保護(hù)的羥甲基和R14表示羥基的保護(hù)基，得到式(19)表示的1-磷酸化糖衍生物的端基異構(gòu)體混合物 其中R11和R14是如上定義的，m是如權(quán)利要求2定義的；磷酸解和異構(gòu)化該混合物；通過選擇性結(jié)晶形成的α-異構(gòu)體，取代端基異構(gòu)體間的平衡得到α-異構(gòu)體；然后除去保護(hù)基。
11.一種制備式(8)表示的核苷的方法 其中B是堿基(base)，獨(dú)立地選自任選地被鹵素、烷基、鹵代烷基、鏈烯基、鹵代鏈烯基、炔基、氨基、烷基氨基、羥基、羥基氨基、氨氧基、烷氧基、巰基、烷基巰基、芳基、芳氧基或氰基取代的嘧啶、嘌呤、氮嘌呤和去氮嘌呤；R1、R2、R3、X、W、Z、n、p、q和r是如權(quán)利要求3中的式(3)定義的，該方法包含第一步，如權(quán)利要求3所要求的制備1-磷酸化糖衍生物單體的步驟；和第二步，在核苷磷酸化酶的作用下，第一步獲得的1-磷酸化糖衍生物的磷酸根基團(tuán)和堿基進(jìn)行交換反應(yīng)。
12.一種制備式(8)表示的核苷的方法 其中B是如權(quán)利要求11中的式(8)所定義的；和R1、R2、R3、R4、X、W、Z、n、p、q和r是如權(quán)利要求6中的式(6)定義的，該方法包含在核苷磷酸化酶的作用下，如權(quán)利要求6所要求的1-磷酸化糖衍生物單體的磷酸根基團(tuán)和堿基進(jìn)行交換反應(yīng)。
13.一種制備式(10)表示的核苷的方法 其中B如權(quán)利要求11中的式(8)所定義的；和R1、R2、R3、R4、X、W、Z、n、p、q和r是如權(quán)利要求7中的式(7)定義的，該方法包含在核苷磷酸化酶的作用下，如權(quán)利要求7所要求的1-磷酸化糖衍生物單體的磷酸根基團(tuán)和堿基進(jìn)行交換反應(yīng)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的制備核苷的方法，其中R1是羥甲基；R2是氫；p和r是0；和X是氟。
15.一種制備式(21)表示的核苷的方法 其中B是如權(quán)利要求11中的式(8)所定義的，該方法包含第一步，如權(quán)利要求14所要求的制備2-脫氧-α-D-核糖-1-磷酸酯的步驟；和第二步，在核苷磷酸化酶的作用下，第一步獲得的1-磷酸化糖衍生物的磷酸根基團(tuán)和堿基進(jìn)行交換反應(yīng)。
16.根據(jù)權(quán)利要求11-15任一權(quán)利要求的制備核苷的方法，其中核苷磷酸化酶是至少一種選自嘌呤核苷磷酸化酶(EC2.4.2.1)、鳥嘌呤核苷磷酸化酶(EC2.4.2.15)、嘧啶核苷磷酸化酶(EC2.4.2.2)、尿苷磷酸化酶(EC2.4.2.3)、胸苷磷酸化酶(EC2.4.2.4)和脫氧尿苷磷酸化酶(EC2.4.2.23)的酶。
17.根據(jù)權(quán)利要求11-15任一權(quán)利要求的制備核苷的方法，其中核苷磷酸化酶的活性被表達(dá)至少一種核苷磷酸化酶的微生物所取代，所述的酶選自嘌呤核苷磷酸化酶(EC2.4.2.1)、鳥嘌呤核苷磷酸化酶(EC2.4.2.15)、嘧啶核苷磷酸化酶(EC2.4.2.2)、尿苷磷酸化酶(EC2.4.2.3)、胸苷磷酸化酶(EC2.4.2.4)和脫氧尿苷磷酸化酶(EC2.4.2.23)。
18.根據(jù)權(quán)利要求11-15任一權(quán)利要求的制備核苷的方法，其中在通過核苷磷酸化酶的作用下1-磷酸化糖衍生物單體中的磷酸根基團(tuán)和堿基進(jìn)行交換反應(yīng)的過程中，能夠和磷酸根離子形成水不溶性鹽的金屬陽離子存在于反應(yīng)溶液中。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的制備核苷的方法，其中能夠和磷酸根離子形成水不溶性鹽的金屬陽離子是至少一種選自鈣、鋇、鋁和鎂離子的金屬陽離子。
20.根據(jù)權(quán)利要求8的制備核苷的方法，其中核苷是天然核苷。
21.由式(11)表示的合成核苷或其鹽 其中B、R1、R2、R3、R4、X、W、Z、n、p、q和r是如 11中的式(8)定義的，不包括三氟胸苷、利巴韋林、乳清酸核苷、尿嘧啶阿拉伯糖苷、腺嘌呤阿拉伯糖苷、2-甲基腺嘌呤阿拉伯糖苷、2-氯-次黃嘌呤阿拉伯糖苷、硫代鳥嘌呤阿拉伯糖苷、2，6-二氨基嘌呤阿拉伯糖苷、阿糖胞苷、鳥嘌呤阿拉伯糖苷、阿糖胸苷、依諾他濱、吉西他濱、疊氮胸苷、碘苷、雙脫氧腺苷、雙脫氧肌苷、雙脫氧胞苷、雙脫氫脫氧胸苷、硫雜雙脫氧胞苷、sorivudine、5-甲基尿苷、三氮唑核苷、硫代肌苷、呋氟尿嘧啶、doxifluridine、布雷青霉素、水松蕈素、別嘌醇尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、2′-氨基尿苷、2′-氨基腺苷、2′-氨基胍、2-氯-2′-氨基肌苷、DMDC和FMDC。
22.由式(12)表示的合成核苷或其鹽 其中B、R1、R2、R3、R4、X、W、Z、n、p、q和r是如 11中的式(8)定義的，不包括三氟胸苷、利巴韋林、乳清酸核苷、尿嘧啶阿拉伯糖苷、腺嘌呤阿拉伯糖苷、2-甲基腺嘌呤阿拉伯糖苷、2-氯-次黃嘌呤阿拉伯糖苷、硫代鳥嘌呤阿拉伯糖苷、2，6-二氨基嘌呤阿拉伯糖苷、阿糖胞苷、鳥嘌呤阿拉伯糖苷、阿糖胸苷、依諾他濱、吉西他濱、疊氮胸苷、碘苷、雙脫氧腺苷、雙脫氧肌苷、雙脫氧胞苷、雙脫氫脫氧胸苷、硫雜雙脫氧胞苷、sorivudine、5-甲基尿苷、三氮唑核苷、硫代肌苷、呋氟尿嘧啶、doxifluridine、布雷青霉素、水松蕈素、別嘌醇尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、2′-氨基尿苷、2′-氨基腺苷、2′-氨基胍、2-氯-2′-氨基肌苷、DMDC和FMDC。
23.式(13)表示的核苷及其鹽 其中B、R1、R2、R3、R4、X、W、Z、n、p、q和r是如 11中的式(8)定義的，不包括三氟胸苷、利巴韋林、乳清酸核苷、尿嘧啶阿拉伯糖苷、腺嘌呤阿拉伯糖苷、2-甲基腺嘌呤阿拉伯糖苷、2-氯-次黃嘌呤阿拉伯糖苷、硫代鳥嘌呤阿拉伯糖苷、2，6-二氨基嘌呤阿拉伯糖苷、阿糖胞苷、鳥嘌呤阿拉伯糖苷、阿糖胸苷、依諾他濱、吉西他濱、疊氮胸苷、碘苷、雙脫氧腺苷、雙脫氧肌苷、雙脫氧胞苷、雙脫氫脫氧胸苷、硫雜雙脫氧胞苷、sorivudine、5-甲基尿苷、三氮唑核苷、硫代肌苷、呋氟尿嘧啶、doxifluridine、布雷青霉素、水松蕈素、別嘌醇尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、2′-氨基尿苷、2′-氨基腺苷、2′-氨基胍、2-氯-2′-氨基肌苷、DMDC和FMDC。
24.式(20)表示的1-磷酸化糖或其鹽 其中R11表示被保護(hù)的羥甲基；和R14表示羥基的保護(hù)基。
全文摘要
磷酸解和異構(gòu)化1－磷酸化糖衍生物端基異構(gòu)體的混合物,由此結(jié)晶端基異構(gòu)體之一。由此平衡轉(zhuǎn)移,只選擇性產(chǎn)生所需的異構(gòu)體。從由此獲得的1－磷酸化糖衍生物和堿基,在核苷磷酸化酶的作用下,可以高立體選擇性和高產(chǎn)率制備核苷。由此,提供了一種端基異構(gòu)體選擇性制備1－磷酸化糖衍生物的方法和制備核苷的方法。
文檔編號C07H19/10GK1372564SQ01800874
公開日2002年10月2日 申請日期2001年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月10日
發(fā)明者小松弘典, 粟野博一, 深澤信幸, 伊藤潔, 池田一郎, 安樂城正, 中村武史, 淺野保, 藤原純也, 安藤知行, 土屋克敏, 丸山恭子, 梅谷豪毅, 山內(nèi)孝弘, 三宅仁基 申請人:三井化學(xué)株式會社