專利名稱：合成的hiv gag基因的制作方法
有關(guān)申請的相互參照條目無關(guān)于聯(lián)邦資助的R&D的聲明無縮微膠片附錄的參考文獻(xiàn)無發(fā)明領(lǐng)域HIV疫苗發(fā)明背景人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)是獲得性人免疫缺陷綜合征(AIDS)和有關(guān)疾病的致病因子。HIV-1是逆轉(zhuǎn)錄病毒家族的RNA病毒，并呈現(xiàn)所有逆轉(zhuǎn)錄病毒具有的5’LTR-gag-pol-env-LTR3’結(jié)構(gòu)。另外，HIV-1包含少量具有調(diào)節(jié)或未知功能的基因，包括tat和rev基因。env基因編碼病毒包膜糖蛋白，該包膜糖蛋白先被翻譯成為160千道爾頓(kDa)的前體(gp160)，然后細(xì)胞蛋白酶將其切割，產(chǎn)生外部120kDa的包膜糖蛋白(gp120)和跨膜的41kDa包膜糖蛋白(gp41)。gp120和gp41仍然保持連接并出現(xiàn)在病毒顆粒和HIV感染的細(xì)胞表面上。gp120結(jié)合存在于輔助T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和其它靶細(xì)胞表面上的CD4受體。在gp120結(jié)合CD4后，gp41介導(dǎo)引起病毒進(jìn)入的融合過程。
當(dāng)病毒顆粒上的gp120結(jié)合T4淋巴細(xì)胞或其它靶細(xì)胞表面的CD4受體時，感染就開始了。已結(jié)合的病毒與靶細(xì)胞融合，并將其RNA基因組逆轉(zhuǎn)錄為細(xì)胞的雙鏈DNA。病毒DNA整合入該細(xì)胞核中的遺傳物質(zhì)中，在該細(xì)胞核中病毒DNA指導(dǎo)產(chǎn)生新的病毒RNA、病毒蛋白以及新的病毒顆粒。新的病毒顆粒從所述靶細(xì)胞膜芽生，并感染其它細(xì)胞。
T4淋巴細(xì)胞是免疫防御的關(guān)鍵，T4淋巴細(xì)胞破壞是進(jìn)行性免疫功能障礙的主要原因，進(jìn)行性免疫功能障礙是HIV感染的標(biāo)志。喪失靶細(xì)胞使機(jī)體抗大多數(shù)入侵者的能力嚴(yán)重受損，但是它特別嚴(yán)重影響對病毒、真菌、寄生蟲和某些細(xì)菌包括分枝桿菌的防御。
HIV-1通過復(fù)制、由其感染的細(xì)胞芽生并破壞細(xì)胞膜，從而殺傷其感染的細(xì)胞。HIV-1可以借助于出現(xiàn)在受感染細(xì)胞表面的病毒gp120，間接殺傷靶細(xì)胞。因為T細(xì)胞上的CD4受體與gp120的親和力強(qiáng)，所以表達(dá)CD4受體的健康細(xì)胞可以結(jié)合gp120，并與受感染的細(xì)胞融合形成合體細(xì)胞。
HIV-1也可以引發(fā)針對受感染細(xì)胞的正常細(xì)胞免疫防御。在有或無抗體的輔助下，細(xì)胞毒防御細(xì)胞可以破壞其表面出現(xiàn)病毒蛋白的受感染細(xì)胞。最后，游離的gag和gp120蛋白可以在HIV-1感染個體的血液中循環(huán)。游離的gp120蛋白可以結(jié)合未感染細(xì)胞的CD4受體，使其看來被感染似的并誘發(fā)免疫應(yīng)答。
HIV-1感染幾乎總是致死性的，而目前沒有HIV-1感染的治愈方法。仍然沒有可用的預(yù)防HIV-1感染的有效疫苗。因為活的減毒病毒存在逆轉(zhuǎn)錄或感染的危險，活的減毒病毒可能不能用作疫苗。大多數(shù)亞單位疫苗方法預(yù)防HIV感染還不成功。對HIV-1感染的治療在延長某些受感染患者生命的同時，具有嚴(yán)重的副作用。因此，迫切需要有效的治療方法和疫苗以克制這種致死性感染。
疫苗接種是疾病預(yù)防的有效形式，并已證明對抗幾種類型的病毒感染是成功的。確定提呈HIV-1抗原給人免疫系統(tǒng)以誘發(fā)保護(hù)性體液免疫和細(xì)胞免疫的途徑，是一項困難的任務(wù)。到此為止，試圖產(chǎn)生有效HIV疫苗的努力還未成功。在AIDS患者，僅存在低水平的游離病毒。通過融合和形成合體細(xì)胞的細(xì)胞與細(xì)胞的相互作用加強(qiáng)了HIV-1的傳播。因此，產(chǎn)生的抗游離病毒或病毒亞單位的抗體在消除病毒感染的細(xì)胞方面一般是無效的。
疫苗利用機(jī)體“記憶”抗原的能力。在免疫系統(tǒng)首次與某種抗原接觸后，產(chǎn)生終生保持該抗原免疫記憶的細(xì)胞。隨后再暴露于該抗原刺激免疫應(yīng)答，結(jié)果是消除病原體或使病原體滅活。
免疫系統(tǒng)以兩種方式處理病原體體液應(yīng)答和細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答。在體液應(yīng)答中，淋巴細(xì)胞產(chǎn)生結(jié)合該抗原并由此使該病原體滅活的特異性抗體。細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答涉及特異性攻擊以及破壞受感染細(xì)胞的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞和輔助T淋巴細(xì)胞。
用HIV-1病毒開發(fā)疫苗存在問題，因為HIV-1感染該疫苗需要在免疫系統(tǒng)中激活的某些相同細(xì)胞(即T4淋巴細(xì)胞)。開發(fā)在免疫系統(tǒng)損害發(fā)生之前使HIV-1滅活的疫苗是有利的。特別合適的HIV疫苗類型將產(chǎn)生抗HIV免疫應(yīng)答，該免疫應(yīng)答識別HIV變異體并在處于其感染初期的HIV陽性個體發(fā)揮作用。
開發(fā)抗病毒尤其是諸如人免疫缺陷病毒的具有高突變率的病毒的疫苗，希望該疫苗誘發(fā)針對該病毒的中和性以及保護(hù)性免疫應(yīng)答，開發(fā)這種疫苗的一個主要問題是，不同病毒分離物或病毒株的病毒包膜蛋白的多樣性。由于小鼠和人類的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)均能識別由保守的病毒內(nèi)蛋白產(chǎn)生的表位，并且人們認(rèn)為細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞在抗病毒免疫應(yīng)答中是重要的，因此努力的方向是開發(fā)能夠針對不同的病毒株提供異源保護(hù)的CTL疫苗。
已知當(dāng)CD8+CTL的T細(xì)胞受體識別與MHC I類分子結(jié)合的病毒肽時，殺傷病毒感染的細(xì)胞。所述病毒肽產(chǎn)生自內(nèi)源合成的病毒蛋白，不管該蛋白在病毒中的位置或功能。因此通過識別保守的病毒蛋白的表位，CTL可以提供交叉病毒株保護(hù)。能夠與MHC I類分子結(jié)合、用于CTL識別的肽源自存在于或透過胞質(zhì)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白。一般來說，進(jìn)入內(nèi)體加工途徑(諸如在由MHC II類分子提呈抗原的情況下)的外源蛋白在產(chǎn)生CD8+CTL應(yīng)答方面是無效的。
為產(chǎn)生CTL應(yīng)答的大多數(shù)努力已采用復(fù)制型載體，以在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生蛋白抗原，或集中在將肽導(dǎo)入細(xì)胞溶膠。這些方法的限制是可能降低其作為疫苗的效用。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在可以作為融合蛋白表達(dá)、同時保持重組病毒復(fù)制能力的多肽的大小和結(jié)構(gòu)方面有限制，而對載體本身的免疫應(yīng)答可能使諸如用于后續(xù)免疫接種的牛痘的載體效力受損。另外，病毒載體和修飾的病原體也有可能妨礙其用于人類的固有危險性。此外，選擇待提呈的肽表位取決于個體MHC抗原的結(jié)構(gòu)，因此由于雜交繁殖群體中的MHC單倍型多樣性，肽疫苗可能具有有限的效力。
Benvenisty，N.和Reshef，L.[PNAS 83，9551-9555，(1986)]表明，腹膜內(nèi)(i.p.)、靜脈內(nèi)(i.v.)或肌內(nèi)(i.m.)注射引入小鼠的CaCl2沉淀的DNA可以表達(dá)。在小鼠中，肌內(nèi)注射未用CaCl2處理的DNA表達(dá)載體使得肌肉細(xì)胞攝取DNA并表達(dá)該DNA編碼的蛋白。質(zhì)粒保持游離并且不復(fù)制。結(jié)果是，在肌肉注射入大鼠、魚和靈長類動物的骨骼肌和大鼠心肌后觀察到持續(xù)的表達(dá)。WO90/11092(1990年10月4日)中報道了用核酸作治療藥物的技術(shù)，其中裸露的多核苷酸用來給脊椎動物接種疫苗。
肌肉內(nèi)免疫不是上述方法成功所必需的。將包被編碼人生長激素(HGH)的DNA的金微粒引入小鼠皮膚，使得在小鼠中產(chǎn)生抗-HGH抗體。一種噴射注射器已經(jīng)用來轉(zhuǎn)染活動物的皮膚、肌肉、脂肪和乳房組織。已經(jīng)綜述了引入核酸的各種方法。Zhu等(Science 261209-211(1993年7月9日)]表明，在小鼠中靜脈注射DNA陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物導(dǎo)致系統(tǒng)表達(dá)克隆的轉(zhuǎn)基因。Ulmer等[Science2591745-1749，(1993)]報道，通過肌內(nèi)注射編碼流感病毒蛋白的DNA，達(dá)到針對不同的流感病毒感染提供異源保護(hù)。
本發(fā)明滿足了對特異性治療劑和預(yù)防劑的需要，所述治療劑和預(yù)防劑能夠誘發(fā)針對病原體和腫瘤抗原的所需免疫應(yīng)答。誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力在該治療方法中特別重要，所述T細(xì)胞免疫應(yīng)答可以預(yù)防感染或甚至由與獲得所述抗原基因的病毒株不同的病毒株引起的疾病。當(dāng)處理HIV時這種T細(xì)胞免疫應(yīng)答特別重要，因為已經(jīng)認(rèn)識到HIV病毒快速突變，并已鑒別了許多有毒分離物[參見例如，LaRosa等，Science 249932-935(1990)，鑒別245個獨立的HIV分離物]。根據(jù)這種識別的多樣性，研究人員已經(jīng)試圖產(chǎn)生基于肽免疫的CTL。因此，Takahashi等[Science 255333-336(1992)]報道，誘導(dǎo)識別HIV包膜(gp160)決定簇的廣泛交叉反應(yīng)性細(xì)胞毒T細(xì)胞。然而，這些研究者認(rèn)識到獲得真正交叉反應(yīng)性CTL應(yīng)答的困難，并提出在非常嚴(yán)格的引發(fā)或再刺激T細(xì)胞和由已被刺激的CTL引發(fā)效應(yīng)細(xì)胞功能(包括細(xì)胞毒性)之間存在二岐分枝(dichotomy)。
Wang等報道，在小鼠中通過用克隆的基因組(未剪接的)HIV基因肌肉內(nèi)接種，誘發(fā)抗HIV的免疫應(yīng)答。然而，在這些研究中獲得的免疫應(yīng)答水平非常低。另外，上述Wang等的論文還報道，DNA構(gòu)建物采用編碼鄰接的Tat/rev-gp160-Tat/rev編碼序列的HIV必需基因組片段。如下祥述，對于獲得gp160的高水平表達(dá)這是一種次優(yōu)系統(tǒng)。因為表達(dá)Tat引起Kaposi肉瘤進(jìn)一步發(fā)展，所以該系統(tǒng)也具有潛在危險。
WO93/17706描述了抗病毒接種動物的方法，其中用基因構(gòu)建物包被載體顆粒，使包被的顆粒加速進(jìn)入動物細(xì)胞。關(guān)于HIV，推薦使用減去長末端重復(fù)序列的基本上完整的基因組。那種方法對接受者非常危險。一般認(rèn)為，HIV構(gòu)建物應(yīng)該含約50％以下的HIV基因組以確保所述疫苗的安全性，這就保證已去除酶部分和病毒調(diào)節(jié)蛋白，其中許多具有未知或甚少了解的功能。因此，假如由基因傳遞技術(shù)產(chǎn)生出有用的人HIV疫苗，則仍然存在很多問題。
本發(fā)明設(shè)想任何一種用于將多核苷酸導(dǎo)入活組織、以誘導(dǎo)表達(dá)蛋白的已知方法。然而，本發(fā)明提供一種新的免疫原，用于將HIV和其它蛋白引入抗原加工途徑，以有效產(chǎn)生HIV特異性的CTL和抗體。這種藥物作為疫苗有效誘導(dǎo)細(xì)胞和體液的抗HIV和中和HIV的免疫應(yīng)答。在本發(fā)明中，提出了上述問題，并通過提供多核苷酸免疫原解決了這些問題，所述多核苷酸免疫原當(dāng)導(dǎo)入動物時，指導(dǎo)HIV蛋白和表位的有效表達(dá)，而沒有與這些方法伴隨的附帶危險。由此產(chǎn)生的免疫應(yīng)答有效識別HIV、抑制HIV復(fù)制、鑒別并殺傷HIV感染的細(xì)胞，而且該免疫應(yīng)答對許多HIV病毒株是交叉反應(yīng)的。
生物體的密碼子配對是高度非隨機(jī)的，并且生物體之間互不相同。利用這種信息來構(gòu)建和表達(dá)具有需要水平翻譯效率的改變的或合成的基因，以便確定基因組中的哪些區(qū)域是蛋白編碼區(qū)，以便將翻譯終止位點導(dǎo)入異源基因以及確定核苷酸序列的關(guān)系或遺傳起源。
目前在轉(zhuǎn)化生物體中表達(dá)外源性異種基因是平常的。無數(shù)哺乳動物基因，包括例如鼠和人基因，已經(jīng)成功插入單細(xì)胞生物。在這方面的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包括將待表達(dá)的外源基因?qū)胫T如質(zhì)?；蚴删w的載體中，以及采用該載體將所述基因插入生物體。通常用與所述基因插入的宿主匹配的強(qiáng)啟動子取代這類基因的天然啟動子。蛋白測序儀可以測定甚至極微量天然蛋白的氨基酸序列。從這些氨基酸序列可以推導(dǎo)出編碼這些蛋白的DNA序列。DNA合成也是一個迅速發(fā)展的領(lǐng)域，可以容易地構(gòu)建相應(yīng)于那些推導(dǎo)的DNA序列的合成基因。
盡管對表達(dá)系統(tǒng)和重組DNA的認(rèn)識不斷發(fā)展，但當(dāng)人們試圖在生物體中表達(dá)一種外源或合成基因時，仍然存在嚴(yán)重的障礙。許多天然的活性蛋白進(jìn)行例如糖基化的方式與其在外源宿主中表達(dá)時發(fā)生的方式不同。為此，對于表達(dá)許多哺乳動物基因，諸如酵母的真核生物宿主可能優(yōu)于細(xì)菌宿主。糖基化問題是繼續(xù)研究的課題。
另一個問題更少了解。通常，即使合成基因與強(qiáng)啟動子偶聯(lián)時，其翻譯比預(yù)期的效率低得多。對表達(dá)生物體外源性的外源基因的情況通常也如此。即使當(dāng)該基因以產(chǎn)生可回收量翻譯產(chǎn)物的足夠有效的方式轉(zhuǎn)錄時，所述蛋白常常是無活性的或者其性質(zhì)與天然蛋白不同。
認(rèn)識到后一個問題常常是由于在不同生物中蛋白折疊不同引起的。解決該問題是困難的，而控制蛋白折疊的機(jī)制了解得非常少。
人們認(rèn)為有關(guān)翻譯效率的問題與密碼子前后效應(yīng)有關(guān)。在所有生物中基因的蛋白編碼區(qū)遭受各種各樣的功能限制，其中某些限制取決于編碼正常功能蛋白的條件以及合適的翻譯起始和終止信號。然而，已經(jīng)鑒別了幾種蛋白編碼區(qū)的特征，根據(jù)這些限制不容易理解所述特征。兩類重要的這類特征是涉及密碼子選擇和密碼子前后效應(yīng)(codon context)的特征。
已知密碼子使用是高度偏倚的，不同生物之間顯著不同。已經(jīng)表明密碼子選擇型與同工tRNA的相對豐度有關(guān)。編碼高豐度與低豐度蛋白的基因顯示其密碼子偏倚不同。已經(jīng)廣泛討論了密碼子選擇偏倚改變肽延伸率的可能性。盡管密碼子選擇的差異與翻譯率的差異有關(guān)，但難以證實密碼子選擇對翻譯的直接影響。提出的其它密碼子選擇型的限制因素包括最大化翻譯保真度和最適化蛋白合成動力學(xué)效率。
除了密碼子的非隨機(jī)選擇外，已經(jīng)積累的大量證據(jù)是，密碼子/反密碼子識別受密碼子本身以外的序列影響，該現(xiàn)象稱為“密碼子前后效應(yīng)”。鄰近核苷酸強(qiáng)烈影響無義密碼子以及錯義密碼子的抑制效率。清楚的是，天然細(xì)菌群體中抑制基因活性的豐度以及使用“終止”密碼子編碼硒代半胱氨酸和磷酸絲氨酸，需要終止為前后序列依賴性的。已經(jīng)表明類似的前后效應(yīng)影響翻譯保真度以及翻譯起始效率。
對大腸桿菌蛋白編碼區(qū)的統(tǒng)計學(xué)分析證實另一種表現(xiàn)的“密碼子前后效應(yīng)”。在一個位置存在的特定密碼子強(qiáng)烈影響鄰近密碼子中某些核苷酸的出現(xiàn)頻度，這些前后序列的限制對于高水平與低水平表達(dá)的基因顯著不同。雖然已經(jīng)認(rèn)識這種前后效應(yīng)，但是關(guān)于鄰近密碼子的優(yōu)選核苷酸的統(tǒng)計規(guī)律的預(yù)期值相當(dāng)?shù)汀＿@限制了這種核苷酸優(yōu)選數(shù)據(jù)用于選擇密碼子以達(dá)到需要水平的翻譯效率效用。
自動核苷酸測序儀的出現(xiàn)使得可利用各種生物的大量序列數(shù)據(jù)。理解這些數(shù)據(jù)存在巨大困難。例如，為了將遺傳序列數(shù)據(jù)與蛋白序列聯(lián)系起來，重要的是鑒定基因組的編碼區(qū)。另外，某些生物的基因組起源極其重要。已知某些生物的基因組具有混合祖先。某些來源于病毒的序列現(xiàn)在穩(wěn)定地?fù)饺胝婧松锏幕蚪M。所述病毒序列本身可能源自基本上無關(guān)的另一物種。在得出有關(guān)基因和它們在其它生物中翻譯產(chǎn)物之間恰當(dāng)?shù)南嗨菩苑矫妫私庖环N基因的祖先可能是重要的。
需要更好地了解密碼子前后效應(yīng)對翻譯的影響，以及需要確定任何所需翻譯效應(yīng)的合適密碼子的方法。也需要根據(jù)核苷酸序列數(shù)據(jù)鑒定基因組編碼區(qū)的方法。也需要控制蛋白折疊和確保外源基因在宿主表達(dá)時正確折疊的方法。根據(jù)所需翻譯效率改變或構(gòu)建的基因?qū)⒕哂兄匾獌r值。
用于微生物表達(dá)具有工業(yè)和藥用價值蛋白的重組DNA技術(shù)實踐的另一方面是“密碼子選擇”現(xiàn)象。盡管較早注意到，在遺傳轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中用于基因表達(dá)的現(xiàn)有機(jī)器將“發(fā)揮作用”以構(gòu)建給定的所需產(chǎn)物，但在微生物獲得的表達(dá)水平可能發(fā)生巨大變異，部分取決于在插入的外源基因中存在的氨基酸特化的遺傳密碼的具體可選擇形式。四種可能的核苷酸堿基的“三聯(lián)”密碼子可以有64種不同變化形式。這些形式提供僅20種不同氨基酸的信息(以及轉(zhuǎn)錄起始和終止信息)意味著某些氨基酸可以由一種以上的密碼子編碼。實際上，某些氨基酸有多達(dá)6種“豐余”可選擇的密碼子，而某些其它氨基酸具有單一的必需密碼子。由于不完全了解的原因，可選擇的密碼子并不均一地出現(xiàn)于不同類型細(xì)胞的內(nèi)源DNA中，似乎在某些類型細(xì)胞中存在部分密碼子的可變天然序位或“優(yōu)選”。
作為一個例子，氨基酸亮氨酸由6種DNA密碼子確定，包括CTA、CTC、CTG、CTT、TTA和TTG(分別相應(yīng)于mRNA密碼子CUA、CUC、CUG、CUU、UUA和UUG)。微生物基因組密碼子頻率的全面分析表明，大腸桿菌的內(nèi)源DNA最常見含有CTG亮氨酸確定密碼子，而酵母和粘菌DNA最常見含有TTA亮氨酸確定密碼子。根據(jù)該序位，一般人們認(rèn)為，用大腸桿菌宿主獲得高水平表達(dá)富含亮氨酸的多肽的可能性，某種程度上取決于密碼子選擇頻率。例如，富含TTA密碼子的基因極可能在大腸桿菌中表達(dá)差，而富含CTG的基因可能高表達(dá)該多肽。同樣，當(dāng)酵母是表達(dá)富含亮氨酸多肽的預(yù)定轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞時，用于插入的DNA中的優(yōu)選密碼子將是TTA。
關(guān)于重組DNA技術(shù)的密碼子優(yōu)選現(xiàn)象的意義是明顯的，該現(xiàn)象可以用來解釋先前為了在成功轉(zhuǎn)化的宿主生物中獲得高水平表達(dá)外源基因的許多失敗——較少“優(yōu)選的”密碼子可以重復(fù)存在于插入的基因中，用于表達(dá)的宿主細(xì)胞機(jī)器可能不能有效發(fā)揮作用。該現(xiàn)象提示，已經(jīng)設(shè)計包含預(yù)定宿主細(xì)胞優(yōu)選密碼子的合成基因，提供用于實踐重組DNA技術(shù)的一種優(yōu)選形式的外源遺傳物質(zhì)。
代表真核細(xì)胞特征的功能多樣性取決于其膜邊界的結(jié)構(gòu)分化。為了產(chǎn)生和保持這些結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)必需從其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的合成部位轉(zhuǎn)運到整個細(xì)胞中的預(yù)定位置。這需要運輸?shù)鞍装l(fā)出分選信號，由位于主要轉(zhuǎn)運途徑的入口點、負(fù)責(zé)途徑選擇的分子機(jī)器識別該信號。當(dāng)大多數(shù)蛋白通過其生物合成途徑時需要僅作出一次分選決定，因為其最終目的地——其行使功能的細(xì)胞位置是其永久仃留位置。
保持細(xì)胞內(nèi)的完整性部分取決于選擇性分選以及蛋白質(zhì)準(zhǔn)確轉(zhuǎn)運到其正確的目的地。在過去幾年中，已經(jīng)強(qiáng)有力地研究了尋靶分子機(jī)器的解剖和蛋白的定位。已經(jīng)鑒定了蛋白上確定的序列基元，所述基元可以用作“地址標(biāo)記”。諸如來自組織特異性血纖溶酶原激活蛋白tPA的前導(dǎo)肽或信號肽，用來通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基器將蛋白轉(zhuǎn)運到細(xì)胞分泌途徑。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多分選信號與諸如二亮氨酸基元或酪氨酸為基礎(chǔ)的序列的膜蛋白的胞質(zhì)域相關(guān)，所述胞質(zhì)域可以將蛋白質(zhì)導(dǎo)向溶酶體區(qū)室。對于HIV，從細(xì)胞轉(zhuǎn)運和擠出病毒顆粒，取決于gag氨基末端的第二個甘氨酸殘基的豆蔻酰化。發(fā)明概述提供編碼HIV gag和修飾的HIV gag的合成DNA分子。所述合成分子的密碼子包括預(yù)定宿主細(xì)胞的優(yōu)選密碼子。所述合成分子提供優(yōu)選形式的外源遺傳物質(zhì)。所述合成分子可以用作一種多核苷酸疫苗，該疫苗通過中和抗體和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫提供對HIV感染的有效免疫預(yù)防。本發(fā)明提供多核苷酸，當(dāng)所述多核苷酸直接導(dǎo)入脊椎動物(包括諸如靈長類和人類的哺乳動物)體內(nèi)時，在動物體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)所編碼的蛋白。附圖簡述

圖1顯示在用HIV gag DNA轉(zhuǎn)染后，293細(xì)胞系轉(zhuǎn)染體中的gag和tPA gag的相對表達(dá)。
圖2顯示優(yōu)化HIV gag和tPA-gag DNA疫苗在小鼠中介導(dǎo)的血清抗-gag應(yīng)答。
圖3顯示用優(yōu)化HIV gag或tPA-gag DNA接種后從小鼠獲得的脾細(xì)胞的抗-gag CTL應(yīng)答。
圖4顯示用優(yōu)化HIV gag或tPA-gag DNA接種后從小鼠獲得的脾細(xì)胞的gag抗原特異性細(xì)胞因子分泌。
圖5顯示從用HIV p55 gag DNA接種的小鼠獲得的抗HIV gagCTL。發(fā)明詳述提供編碼HIV gag的合成DNA分子和編碼修飾形式HIV gag的合成DNA分子。設(shè)計所述合成分子的密碼子以便使用預(yù)定宿主細(xì)胞優(yōu)選的密碼子。所述合成分子可以用作一種多核苷酸疫苗，該疫苗通過中和抗體和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫對HIV感染提供有效的免疫預(yù)防。所述合成分子可以用作免疫原性組分。本發(fā)明提供多核苷酸，當(dāng)所述多核苷酸直接導(dǎo)入脊椎動物體內(nèi)，包括諸如靈長類和人類的哺乳動物，在動物體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)所編碼的蛋白。
本文所用的多核苷酸是含有必需調(diào)節(jié)元件的核酸，使得在導(dǎo)入活的脊椎動物細(xì)胞時能夠指導(dǎo)細(xì)胞機(jī)器產(chǎn)生由包含該多核苷酸的基因編碼的翻譯產(chǎn)物。在本發(fā)明一個實施方案中，所述多核苷酸是包含至少一種操作性連接至轉(zhuǎn)錄啟動子的HIV基因的多脫氧核糖核酸。在本發(fā)明的另一實施方案中，該多核苷酸疫苗(PNV)包含編碼至少一種HIV基因的多核糖核酸，所述基因適合于由真核細(xì)胞的細(xì)胞機(jī)器(核糖體、tRNA和其它翻譯因子)翻譯。該多核苷酸編碼的蛋白是一種在動物正常情況下不會產(chǎn)生、只在病理情況下產(chǎn)生的蛋白(即異源蛋白)，諸如與人免疫缺陷病毒(HIV)——獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的病原體相關(guān)的蛋白，在這種情況下激活所述動物免疫系統(tǒng)以起動保護(hù)性免疫應(yīng)答。因為這些外源蛋白由所述動物的組織產(chǎn)生，所以表達(dá)的蛋白以類似于發(fā)生相關(guān)生物(HIV)實際感染的方式、由主要組織相容性系統(tǒng)(MHC)加工。正如本說明書所示，結(jié)果是誘導(dǎo)免疫應(yīng)答對抗有關(guān)病原體。
因此，本發(fā)明人已經(jīng)制備了核酸，當(dāng)其導(dǎo)入生物系統(tǒng)時誘導(dǎo)表達(dá)HIV蛋白和表位。所誘導(dǎo)的抗體應(yīng)答是所表達(dá)HIV蛋白特異性的，并中和HIV。此外，誘導(dǎo)特異性識別并破壞HIV感染的細(xì)胞的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞。
本發(fā)明提供使用多核苷酸的方法，該多核苷酸在導(dǎo)入哺乳動物組織時，在體內(nèi)單一細(xì)胞中誘導(dǎo)不連續(xù)基因產(chǎn)物的表達(dá)。本發(fā)明提供一個不同的解決方法，不需要多步操作rev依賴性HIV基因，以獲得rev非依賴性基因。本文所述rev非依賴性表達(dá)系統(tǒng)以其右向時是有用的，并是一種用于證實在活體單一細(xì)胞中表達(dá)所需單一基因產(chǎn)物的系統(tǒng)。
因為本發(fā)明的許多應(yīng)用應(yīng)用于抗病毒疫苗接種，所以所述多核苷酸常常被稱為多核苷酸疫苗或PNV。這并不是說，認(rèn)為這些多核苷酸在免疫刺激和抗腫瘤治療中的其它用途不在本發(fā)明范圍內(nèi)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，將編碼一種HIV基因產(chǎn)物的基因摻入表達(dá)載體中。該載體含有為真核RNA聚合酶識別的轉(zhuǎn)錄啟動子和HIV基因編碼序列末端的轉(zhuǎn)錄終止子。在優(yōu)選實施方案中，所述啟動子是具有內(nèi)含子A序列的巨細(xì)胞病毒啟動子(CMV-intA)，盡管本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到，可以使用無數(shù)諸如強(qiáng)免疫球蛋白的其它已知啟動子或其它真核生物基因啟動子中的任何一種。優(yōu)選的轉(zhuǎn)錄終止子是牛生長激素終止子。特別優(yōu)選聯(lián)合的CMVintA-BGH終止子。
為了便于在原核細(xì)胞中制備所述多核苷酸，一種抗生素抗性標(biāo)記也最好包含于該表達(dá)載體中，置于一種原核啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下，使得在真核細(xì)胞中不表達(dá)所述抗生素。可以使用氨芐青霉素抗性基因、新霉素抗性基因和其它藥學(xué)可接受的抗生素抗性標(biāo)記。為了有助于在原核生物中通過發(fā)酵高水平地生產(chǎn)所述多核苷酸，含有原核生物復(fù)制起點和具有高拷貝數(shù)的載體是有利的。許多市售的原核克隆載體具有這些優(yōu)勢。最好是去除非必需DNA序列。也希望該載體不能在真核細(xì)胞中復(fù)制。這使得多核苷酸疫苗序列整合入接受者基因組的風(fēng)險降到最小。無論什么時候希望將多核苷酸的表達(dá)限制于特定組織類型，都可以使用組織特異性啟動子或增強(qiáng)子。
在一個實施方案中，使用表達(dá)載體pnRSV，其中勞氏肉瘤病毒(RSV)的長末端重復(fù)序列(LTR)用作啟動子。在另一實施方案中，使用CMV啟動子和BGH轉(zhuǎn)錄終止子克隆入其中的突變型pBR322載體——V1。在另一實施方案中，已經(jīng)將V1和pUC19的元件結(jié)合，產(chǎn)生稱為V1J的表達(dá)載體。將一種HIV基因克隆入V1J或另一種需要的表達(dá)載體，所述HIV基因例如gp120、gp41、gp160、gag、pol、env或任何其它可以誘導(dǎo)抗HIV免疫應(yīng)答的HIV基因。在另一實施方案中，從V1J去除氨芐青霉素抗性基因并用新霉素抗性基因替代，產(chǎn)生V1J-neo，已經(jīng)將不同HIV基因克隆入V1J-neo中，用于按照本發(fā)明的使用。在另一實施方案中，所述載體是V1Jns，該載體與V1Jneo相同，例外的是唯一的Sfil限制性位點已經(jīng)在V1J-neo的第2114位點工程入單一的Kpn1位點。在人基因組DNA中Sfil位點的發(fā)生率非常低(大約每100,000個堿基有1個位點)。因此，該載體僅僅通過用Sfil消化提取的基因組DNA，對表達(dá)載體整合入宿主DNA提供仔細(xì)的監(jiān)測。在再一改進(jìn)實施方案中，所述載體是V1R。在該載體中，從該載體“剪去”盡可能多的非必需DNA，以產(chǎn)生高度壓縮的載體。該載體是V1Jns的衍生體。該載體允許使用較大插入片段，較少考慮編碼不需要的序列以及優(yōu)化細(xì)胞攝取。
本發(fā)明的一個實施方案摻入編碼得自HIV實驗室適應(yīng)型病毒株的HIV gag的基因，所述病毒株例如IIIB或CAM-1病毒株。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，使用得自其它HIV-1病毒株或功能類似HIV-1基因的HIV-2病毒株的基因，應(yīng)該預(yù)期產(chǎn)生類似于本文關(guān)于HIV-1構(gòu)建物所述的免疫應(yīng)答。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知獲得這些基因的克隆以及操作方法。
目前許多HIV病毒株的許多基因序列是可以在GENBANK上公開獲得，而這類原始的HIV現(xiàn)場分離物可從與Quality Biological，Inc.[7581 Lindbergh Drive，Gaithersburg，Maryland 20879]簽定合同制備這些可用病毒株的National Institute of Allergy and Infectious Diseases(NIAID)獲得。這類病毒株也可以從世界衛(wèi)生組織(WHO)[Network forHIV Isolation and Characterization，Vaccine Development Unit，Office ofResearch，Global Programme on AIDS，CH-1211 Geneva 27，Switzerland]獲得。本領(lǐng)域技術(shù)人員從這些工作將認(rèn)識到，本發(fā)明用途之一是提供體內(nèi)以及體外測試和分析系統(tǒng)，以便了解HIV序列多樣性與HIV中和血清學(xué)的關(guān)系以及其它數(shù)據(jù)。HIV病毒株原始分離物的基因摻入提供了免疫原，該免疫原誘導(dǎo)抗所述病毒臨床分離物的免疫應(yīng)答，并由此滿足該領(lǐng)域仍未獲得解決的需要。此外，隨著該有毒分離物的改變，可以修飾該免疫原以反映必需的新序列。
為了保持術(shù)語一致性，本文描述多核苷酸免疫原構(gòu)建物遵循以下常規(guī)“載體名-HIV病毒株—基因—其它元件”。加入所述構(gòu)建物的其它元件下面再詳細(xì)描述。隨著所述病毒致病株的改變，可以改變最適摻入藥物的明確基因。然而，如下證實，因為誘導(dǎo)了能夠保護(hù)抵抗異種病毒株的CTL應(yīng)答，所以與基于整個病毒或亞單位多肽的疫苗相比，該病毒株的變異性在本發(fā)明的免疫原和疫苗中不那么重要。另外，因為容易操作該藥物以插入新基因，所以這是通過分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)容易實施的調(diào)整。
本文所用的術(shù)語“啟動子”是指RNA聚合酶連接其上的DNA鏈上的識別位點。該啟動子與RNA聚合酶形成起始復(fù)合物，以啟動和驅(qū)動轉(zhuǎn)錄活動?？梢杂梅Q為“增強(qiáng)子”的激活序列或稱為“沉默子”的抑制序列修飾該復(fù)合物。
本文所用的術(shù)語“前導(dǎo)序列”是指結(jié)構(gòu)基因的5’端、與該基因一起轉(zhuǎn)錄的DNA序列。該前導(dǎo)序列通常產(chǎn)生具有有時稱為前序列(pro-sequence)的N末端肽延伸的蛋白。對于預(yù)定分泌到細(xì)胞外基質(zhì)或者膜的蛋白，一般為疏水性的該信號序列指引該蛋白進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放到合適目的地。
本文所用的術(shù)語“內(nèi)含子”是指出現(xiàn)于基因中間、不編碼基因產(chǎn)物氨基酸的DNA部分。切出該內(nèi)含子的前體RNA，因此使其不能轉(zhuǎn)錄成為mRNA，也不能翻譯成為蛋白質(zhì)。
術(shù)語“盒”是指含有待表達(dá)核酸序列的本發(fā)明序列。該盒概念上類似于盒式磁帶。每個盒具有其自身的序列。因此通過交換該盒，載體將表達(dá)不同序列。因為在5’末端和3’末端有限制性位點，該盒可以容易地插入、去除或用另一種盒替代。
術(shù)語“3’非翻譯區(qū)”或“3’UTR”是指在結(jié)構(gòu)基因3’末端、通常與該基因一起轉(zhuǎn)錄的序列。該3’UTR區(qū)通常含有多聚A序列。盡管該3’UTR從DNA轉(zhuǎn)錄，但是在翻譯成為蛋白質(zhì)之前被切除。
術(shù)語“非編碼區(qū)”或“NCR”是指與結(jié)構(gòu)基因3’UTR區(qū)鄰接的區(qū)。該NCR區(qū)含有轉(zhuǎn)錄終止信號。
術(shù)語“限制性位點”是指限制性內(nèi)切核酸酶的序列特異性切割位點。
術(shù)語“載體”是指通過它將DNA片段導(dǎo)入宿主生物或宿主組織的某些工具。有不同類型的載體，包括質(zhì)粒、噬菌體和粘粒。
術(shù)語“有效量”是指注射足夠量PNV以產(chǎn)生足夠水平的多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道該水平可以是變化的。
為了說明本發(fā)明，以下提供HIV的背景。人免疫缺陷病毒具有核糖核酸(RNA)基因組。為了產(chǎn)生按照本文所述方法克隆和操作的cDNA拷貝，必須按照本領(lǐng)域已知方法逆轉(zhuǎn)錄該RNA基因組。該基因組的每個末端是用作啟動子的長末端重復(fù)序列。這些末端之間的基因組以不同可讀框編碼主要的基因產(chǎn)物gag-pol-envgag是群特異性抗原；pol是逆轉(zhuǎn)錄酶或聚合酶；該區(qū)也以不同的可讀框編碼負(fù)責(zé)翻譯后加工的病毒蛋白酶，例如將gp160加工成為gp120和gp41；env是包膜蛋白；vif是病毒體傳染因子；rev是病毒體蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)物；nef是負(fù)調(diào)節(jié)因子；vpu是病毒體增殖因子“u”；tat是轉(zhuǎn)錄的反式激活蛋白；vpr是病毒蛋白r。已經(jīng)描述了這些元件中每一種的功能。
在本發(fā)明一個實施方案中，編碼HIV gag蛋白的基因直接連接到轉(zhuǎn)錄啟動子。然而，在缺乏rev的情況下，由于沒有從核輸出未剪接的基因，gag的表達(dá)被抑制。為了了解該系統(tǒng)，必須進(jìn)一步祥細(xì)描述HIV的生命周期。
在HIV的生命周期中，在感染宿主細(xì)胞后HIV RNA基因組反轉(zhuǎn)錄為前病毒DNA，該前病毒DNA作為單個轉(zhuǎn)錄單位整合到宿主基因組DNA中。所述LTR提供從5’至3’方向(gag，pol，env)轉(zhuǎn)錄HIV基因的啟動子，以形成整個基因組的未剪接轉(zhuǎn)錄物。該未剪接轉(zhuǎn)錄物作為由其翻譯gag和pol的mRNA發(fā)揮作用，同時必須進(jìn)行有限的剪接以翻譯env編碼基因。對于待表達(dá)的調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物rev，必需剪接一次以上，因為在基因組環(huán)境中，如圖1所示，rev和env相互重疊。為了轉(zhuǎn)錄env，必需終止轉(zhuǎn)錄rev，反之亦然。另外，從核轉(zhuǎn)運出未剪接的RNA需要存在rev。然而，為了使rev以這種方式發(fā)揮作用，在轉(zhuǎn)錄物上必需存在rev效應(yīng)元件(RRE)[Malim等，Nature338254-257(1989)]。
在本發(fā)明多核苷酸疫苗中，通過提供完全剪接的基因消除某些HIV基因的專性剪接(即，提供完整的可讀框用于需要的基因產(chǎn)物，而不需要開關(guān)可讀框或去除非編碼區(qū)；本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，當(dāng)剪接特定基因時，在產(chǎn)生的精確序列中存在一定的自由度；然而，只要獲得有功能的編碼序列，這是可接受的)。因此，在一個實施方案中，剪接gag完整的編碼序列，使得不需要間歇性表達(dá)每個基因產(chǎn)物。
已知HIV在群體以及感染個體中的突變傾向，根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答雙重應(yīng)答對抑制HIV感染特別重要。為了配制HIV有效保護(hù)性疫苗，最好產(chǎn)生例如對HIV的主要中和靶g(shù)p160(env在各種HIV-1、分化體B病毒株中大約80％保守，所述病毒株為美國人群中的主要病毒株)的多價抗體應(yīng)答，以及產(chǎn)生與gp160保守部分和gag編碼的內(nèi)病毒蛋白反應(yīng)的細(xì)胞毒T細(xì)胞。我們已制備了包含選自以下病毒株和基因的gp160基因的HIV疫苗常見的實驗室病毒株；在受感染人群中發(fā)現(xiàn)的主要的原始病毒分離物；突變的gp160，設(shè)計來使交叉病毒株解掩蔽，中和抗體表位；以及諸如gag和pol基因(在HIV分離物中95％保守)的其它典型的HIV基因。
實際上，還未發(fā)展到免疫缺陷狀態(tài)的所有HIV血清學(xué)陽性病人均帶有抗gag CTL，而這些病人中大約60％顯示交叉病毒株、gp160特異性CTL。然而，在發(fā)展到疾病狀態(tài)(稱為AIDS)的感染個體中的HIV特異性CTL的量低得多，從而證實了我們可以誘導(dǎo)交叉病毒株的CTL應(yīng)答的發(fā)現(xiàn)的重要性。
在小鼠和靈長類中證實用我們的env和gag多核苷酸疫苗構(gòu)建物誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。在小鼠中監(jiān)測對env的抗體產(chǎn)生證實，給定構(gòu)建物是適合的免疫原，即大部分接種的動物顯示抗體應(yīng)答。小鼠也提供了適合測試用我們的構(gòu)建物誘導(dǎo)CTL、最易獲得的動物模型，因此用來評價特定構(gòu)建物是否能夠產(chǎn)生這種活性。猴子(非洲綠猴、獼猴、黑猩猩)提供了用于在較大的非嚙齒動物中抗體評價的其它物種，包括靈長類。由于在小鼠血清中觀察到抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的高水平內(nèi)源性中和活性，所以最好用這些物種而不用小鼠進(jìn)行抗血清中和檢測。這些資料證實，我們的疫苗產(chǎn)生足夠的免疫原性，以在黑猩猩/HIVIIIB攻擊模型的實驗中獲得保護(hù)，所述模型基于該系統(tǒng)已知保護(hù)水平的中和抗體。然而，目前在學(xué)術(shù)界中出現(xiàn)并越來越被接受的保護(hù)定義越來越遠(yuǎn)離所謂的“消除性免疫”，表明完全保護(hù)避免HIV感染以預(yù)防疾病。該目標(biāo)的許多相關(guān)數(shù)包括降低的血液病毒滴度，這通過PCR、通過血清樣品的感染性、通過ELISA測定血液中p24或其它HIV抗原的濃度檢測的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶活性、升高的CD4+T細(xì)胞濃度、以及提高的生存率檢測[參見例如，Cohen，J.，Science 2621820-1821，1993，關(guān)于抗HIV疫苗效能定義演變的討論]。本發(fā)明的免疫原也產(chǎn)生抗HIV感染性(臨床、原始現(xiàn)場)分離物的中和免疫應(yīng)答。
ELISA檢測用來確定表達(dá)分泌型tPA-gag或天然gag的優(yōu)化gag疫苗載體是否有效產(chǎn)生gag特異性抗體。通過免疫印跡分析優(yōu)化gag轉(zhuǎn)染的細(xì)胞裂解液，提供我們的疫苗載體的gag表達(dá)的原始體外特征。這些資料證實gag表達(dá)，并用抗HIV抗血清顯現(xiàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞gag表達(dá)對其定量。
產(chǎn)生CTL應(yīng)答。在細(xì)胞內(nèi)合成的病毒蛋白產(chǎn)生MHC I限制性CTL應(yīng)答。每一種這些蛋白在血清學(xué)陽性病人中引出CTL。我們的疫苗也能夠在小鼠和獼猴中引出CTL。小鼠病毒株的免疫遺傳學(xué)有益于這類研究，如用流感NP證實的一樣，[參見Ulmer等，Science2591745-1749，1993]。已經(jīng)在Balb/c小鼠中確定了HIV蛋白env、rev、ref和gag的幾種表位(Frankel，F(xiàn).R.等，J.Immunol.155，4775-82(1995))，因此有助于體外CTL培養(yǎng)和細(xì)胞毒性檢測。另一方面，可以使用編碼gp160、gp120、pol或gag的完整基因。關(guān)于該問題的其它綜述，參見例如，(HIV分子免疫學(xué)數(shù)據(jù)庫1995，Korber等編輯，Los AlamosNational Laboratory，Los Alamos，NM，USA)。本文所用的T細(xì)胞效應(yīng)子功能與成熟T細(xì)胞表型相關(guān)，例如，細(xì)胞毒性、激活B細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌、和/或巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的募集或刺激。
TH活性測定。通過加入重組蛋白或肽表位，測試取自疫苗接種動物的脾細(xì)胞培養(yǎng)物對特定抗原的回憶。通過這些培養(yǎng)物的增殖或細(xì)胞因子的產(chǎn)生，監(jiān)測由伴隨的脾抗原提呈細(xì)胞(APC)提呈的這類抗原對T細(xì)胞的激活。細(xì)胞因子產(chǎn)生型也允許將TH應(yīng)答分為1型或2型。由于在無免疫應(yīng)答的血清學(xué)陽性病人中的顯著TH2應(yīng)答似乎與細(xì)胞免疫排斥有關(guān)，所以，確定病人由特定PNV產(chǎn)生的應(yīng)答類型允許操所作產(chǎn)生的免疫應(yīng)答是可能的。
基于上述免疫學(xué)研究，可預(yù)計我們的疫苗在脊椎動物對抗有毒HIV攻擊是有效的。在HIVIIIB/黑猩猩攻擊模型中用PNV構(gòu)建物或PNV構(gòu)建物的混合物充分接種這些動物之后完成這些研究，所述PNV構(gòu)建物包括gp160IIIB、gagIIIB、nefIIIB和REVIIIB°IIIB病毒株在這方面是有用的，因為已經(jīng)確立該病毒株黑猩猩致死劑量的滴度。然而，采用任何HIV病毒株和對特定病毒株特異性的表位或與特定病毒株異源的表位，設(shè)計相同的研究。除了黑猩猩外，第二種接種/攻擊模型是scid-hu PBL小鼠。用后續(xù)HIV攻擊小鼠宿主，該模型可以測試人淋巴細(xì)胞免疫統(tǒng)與我們的疫苗。該系統(tǒng)是有利的，因為該系統(tǒng)容易用于采用任何HIV病毒株的使用，并提供了對抗HIV原始現(xiàn)場分離物的多種病毒株的保護(hù)證據(jù)。第三種攻擊模型采用HIV/SIV病毒雜交體(SHIV)，已經(jīng)表明其中某些雜交體感染獼猴并導(dǎo)致引起死亡的免疫缺陷病[參見Li，J.等，J.AIDS 5639-646，1992]。用我們的多核苷酸疫苗構(gòu)建物接種獼猴，對用致死劑量SHIV的后續(xù)攻擊是有保護(hù)作用的。
有無數(shù)病毒和細(xì)菌衍生的基因不采用在哺乳動物優(yōu)化表達(dá)的密碼子。其原因包括這樣的事實這些微生物提供其自身聚合酶或特定蛋白或因子，以促進(jìn)轉(zhuǎn)錄/翻譯其基因產(chǎn)物。就細(xì)菌而言，細(xì)菌的特定tRNA的相對豐度可以各不相同。清楚的是，在DNA疫苗情況下的這類基因的體內(nèi)表達(dá)是顯著不同的。
典型構(gòu)建物組分包括(但不限于)HIV env、HIV gag、HIV pol、HIV rev、HIV vpr和HIV nef。編碼由病原體而不是HIV表達(dá)的抗原的基因，例如但不限于流感病毒核蛋白、血凝素、基質(zhì)、神經(jīng)氨酸酶和其它抗原蛋白；單純皰疹病毒基因；人乳頭瘤病毒基因；結(jié)核抗原；A、B或C型肝炎病毒抗原。
通過用本發(fā)明非復(fù)制型質(zhì)粒DNA進(jìn)行免疫，證實多核苷酸HIV免疫原對后續(xù)病毒攻擊的保護(hù)效用。這是有利的，因為不涉及感染因子，不需要裝配病毒顆粒，并允許選擇決定簇。而且，因為gag和蛋白酶以及幾種其它病毒基因產(chǎn)物的序列在各種HIV病毒株中是保守的，所以使得能夠?qū)εc獲得克隆基因的病毒株同源的有毒HIV株以及異源的HIV株的后續(xù)攻擊產(chǎn)生保護(hù)。
本發(fā)明提供誘導(dǎo)交叉病毒株保護(hù)性免疫的方法，而不需要自我復(fù)制因子或佐劑。另外，用本發(fā)明多核苷酸免疫具有許多其它益處。該疫苗接種的方法應(yīng)該可應(yīng)用于腫瘤以及傳染性因子，因為CD8+CTL應(yīng)答對病理生理過程都是重要的[K.Tanaka等，Annu.Rev.Immunol.6，359(1988)]。因此，引發(fā)對轉(zhuǎn)化過程關(guān)鍵性蛋白的免疫應(yīng)答，可能是癌保護(hù)或免疫治療的有效手段。在注射病毒蛋白和人生長激素DNA后針對所表達(dá)蛋白產(chǎn)生高效價抗體提示，這是制備基于抗體的疫苗的容易而高效的方法，所述疫苗或者與針對保守抗原的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞疫苗分開或者與其聯(lián)合。
產(chǎn)生和純化DNA構(gòu)建物的簡便性超過傳統(tǒng)的蛋白純化方法，由此有助于產(chǎn)生聯(lián)合疫苗。因此，可以制備、混合并同時給予的多種構(gòu)建物，例如編碼gp160、gp120、gp41、gag或任何其它HIV基因的構(gòu)建物。由于在注射DNA后保持蛋白表達(dá)，可以提高B細(xì)胞和T細(xì)胞記憶的持久性，由此產(chǎn)生長期存在的體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。
制備和純化DNA構(gòu)建物的分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)使得能夠制備本發(fā)明的DNA免疫原。因此，盡管分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)足以生產(chǎn)本發(fā)明制品，但本文公開的特定構(gòu)建物提供新的多核苷酸免疫原，所述免疫原令人驚奇地產(chǎn)生交叉病毒株和原始HIV分離物的中和，用標(biāo)準(zhǔn)滅活的完整病毒或亞單位蛋白疫苗迄今沒能獲得這樣的結(jié)果。
導(dǎo)入疫苗接受者的可表達(dá)DNA量或轉(zhuǎn)錄的RNA量取決于所用轉(zhuǎn)錄和翻譯啟動子的強(qiáng)度以及取決于所表達(dá)基因產(chǎn)物的免疫原性。一般而言，直接注入肌肉組織的免疫或預(yù)防有效量大約為1ng-100mg，優(yōu)選大約10μg-300μg。也設(shè)想皮下注射、皮內(nèi)導(dǎo)入、皮膚壓跡(impression through the skin)以及其它諸如腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或吸入傳遞的給藥模式。也設(shè)想提供加強(qiáng)接種。也設(shè)想在用HIV多核苷酸免疫原接種后，用諸如gp160、gp120和gag基因產(chǎn)物的HIV蛋白加強(qiáng)接種。同時或在胃腸外導(dǎo)入本發(fā)明PNV后，胃腸外給予白介素-12蛋白也是有利的，所述胃腸外白介素-12給予法諸如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或其它方式。
所述多核苷酸可以是裸露多核苷酸，即不與任何蛋白、佐劑或其它影響接受者免疫系統(tǒng)的因子結(jié)合。在這種情況下，希望該多核苷酸是生理可接受溶液，諸如但不限于無菌鹽水或無菌緩沖鹽溶液。另一方面，該DNA可以與諸如卵磷脂脂質(zhì)體或本領(lǐng)域已知的其它脂質(zhì)體的脂質(zhì)體結(jié)合成為DNA-脂質(zhì)體混合物，或者該DNA可以與諸如一種蛋白或其它載體的本領(lǐng)域已知佐劑結(jié)合，以加強(qiáng)免疫應(yīng)答。也可以有利地使用促進(jìn)細(xì)胞攝取DNA的因子，諸如但不限于鈣離子。這些因子在本文一般稱為轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑和藥用可接受載體。用多核苷酸包被的微粒包被技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，也可以結(jié)合本發(fā)明使用。
提供以下實施例以說明本發(fā)明，而不希望以任何方式限制本發(fā)明。
實施例1異源性表達(dá)HIV晚期基因產(chǎn)物諸如env和gag的HIV結(jié)構(gòu)基因需要表達(dá)HIV調(diào)節(jié)基因rev，以便有效地產(chǎn)生全長蛋白。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，gag的rev依賴性表達(dá)產(chǎn)生低水平蛋白，并且rev本身對細(xì)胞可能具有毒性。盡管我們體外獲得相對高水平的rev依賴性表達(dá)gp160，但是該疫苗在用rev/gp160DNA在體內(nèi)免疫后，引發(fā)抗gp160的低水平抗體。這可能是由于已知的rev細(xì)胞毒作用以及在含有數(shù)以百計核的肌管中發(fā)揮rev功能的困難增加所致(當(dāng)gag或env蛋白表達(dá)的rev依賴性轉(zhuǎn)錄發(fā)生時，需要rev蛋白在相同核中)。然而，用選擇性修飾的env基因獲得rev非依賴性表達(dá)已是可能的。
一般來說，我們的疫苗采用原始HIV(IIIB、MN或CAM-1)env和gag基因，以在我們的一般化接種載體V1Jns中優(yōu)化表達(dá)，V1Jns包括一個CMV立即早期(IE)啟動子、BGH聚腺苷酸化位點和pUC骨架。通過用來自組織特異性血漿纖溶酶原激活蛋白(tPA)基因的前導(dǎo)肽取代其天然的分泌前導(dǎo)肽、并表達(dá)產(chǎn)生的在CMVIE啟動子和CMV內(nèi)含子A之后的嵌合基因，根據(jù)使用多大的基因區(qū)段(例如gp120與gp160)，可以獲得env的不同效率的rev非依賴性表達(dá)。
如上所述，我們認(rèn)為用該方案實現(xiàn)以下目的是使我們成功機(jī)會最大所必需的(1)能夠在靈長類動物中產(chǎn)生較強(qiáng)的中和抗體應(yīng)答的基于env的載體；(2)用靈長類動物的CTL和輔助效應(yīng)子功能特征鑒定，引發(fā)強(qiáng)T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的gag和env載體；(3)在我們的疫苗中使用得自臨床有關(guān)的HIV-1病毒株的env和gag基因，并特征鑒定它們引發(fā)的免疫應(yīng)答，特別是對原始分離物的中和；(4)采用合適的優(yōu)化疫苗在諸如黑猩猩/HIV(IIIB)或獼猴/SHIV的動物攻擊模型中證實保護(hù)作用；以及(5)確定適合臨床應(yīng)用的免疫應(yīng)答的持續(xù)時間。關(guān)于這些目的的前三個已經(jīng)取得顯著進(jìn)展，并且實驗正在進(jìn)行中，以確定我們最近的gp160和gag接種構(gòu)建物對這些初步結(jié)果是否還能改進(jìn)。
實施例2疫苗生產(chǎn)載體A.V1Jneo表達(dá)載體必需去除用于抗生素選擇帶有V1J的細(xì)菌的ampr基因，因為氨芐青霉素不能用于大規(guī)模發(fā)酵罐。通過用SspI和Eam1105I限制性酶消化，從V1J的pUC骨架去除ampr基因。通過瓊脂糖凝膠電泳純化余下的質(zhì)粒，用T4 DNA聚合酶使末端平端化，然后用牛小腸堿性磷酸酶處理。用PstI限制酶切下衍生自轉(zhuǎn)座子903并包含在pUC4K質(zhì)粒中的市售kanr基因，再用瓊脂糖凝膠電泳純化，用T4 DNA聚合酶使其末端平端化。將該片段與V1J骨架連接，產(chǎn)生具有任一方向kanr基因的質(zhì)粒，所述質(zhì)粒稱作V1Jneo#’1和3。這些質(zhì)粒中的每一種通過限制酶消化分析、DNA測序接頭區(qū)證實，并表明產(chǎn)生相似量V1J質(zhì)粒。異源基因產(chǎn)物的表達(dá)也類似于用于這些V1Jneo載體的V1J。我們隨意地選擇以下稱為V1Jneo的V1Jneo#3，它含有與V1J中的ampr基因相同方向的kanr基因，作為表達(dá)構(gòu)建物。B.V1Jns表達(dá)載體將一個Sfi I位點加入V1Jneo以有助于整合研究。在該載體BGH序列中的Kpn I位點加入市售的13個堿基對的Sfi I接頭(New EnglandBioLabs)。用Kpn I使V1Jneo線性化，凝膠純化，用T4 DNA聚合酶平端化，并連接至平端的Sfi I接頭。通過限制性作圖選擇克隆分離物，并通過該接頭的測序鑒定證實。該新載體叫做V1Jns。V1Jns(含有Sfi I)中的異源基因表達(dá)類似于V1Jneo(含有Kpn I)中的相同基因表達(dá)。C.V1Jns-tPA為了對分泌蛋白和/或膜蛋白提供異源前導(dǎo)肽序列，修飾V1Jn以包括人組織特異性血漿纖溶酶原激活蛋白(tPA)的前導(dǎo)序列。使兩種合成的互補(bǔ)寡聚體退火，然后連接到已經(jīng)用BgII消化的V1Jn中。這些寡聚體具有適合連接至BgIII切割的序列的突出堿基。連接后破壞上游BgIII位點，保留下游BgIII位點用于隨后的連接。通過DNA測序，證實所述連接位點以及完整的tPA前導(dǎo)序列。此外，為了與我們的共有優(yōu)化載體V1Jns(＝具有SfiI位點的V1Jneo)一致，通過用T4 DNA聚合酶平端化KpnI位點，之后與SfiI接頭(商品目錄1138號，New England Biolabs)連接，將一個SfiI限制性位點置于V1Jn-tPA的BGH終止子區(qū)的KpnI位點。通過限制性消化和瓊脂糖凝膠電泳證實該修飾。D.載體V1R制劑在繼續(xù)努力優(yōu)化我們的基本接種載體中，我們制備了稱為V1R的V1Jns的衍生物。構(gòu)建該載體的目的是獲得最小化的疫苗載體，即沒有非必需DNA序列，所述載體仍然保有整個優(yōu)化異源基因表達(dá)的特征以及V1J和V1Jns提供的高質(zhì)粒產(chǎn)率。我們由文獻(xiàn)以及通過實驗確定(1)可以去除包含大腸桿菌復(fù)制起點的pUC骨架中的多個區(qū)，而不影響細(xì)菌質(zhì)粒的產(chǎn)率；(2)假如插入細(xì)菌終止子以進(jìn)行替代，可以去除卡那霉素可讀框之后的kanr基因3’區(qū)；以及(3)可以從BGH終止子的3’一半去除約300個堿基，而不影響其調(diào)節(jié)功能(在BGH元件的原始KpnI限制性酶切位點之后)。
通過采用PCR由V1Jns合成三種DNA區(qū)段(分別代表CMVintA啟動子/BGH終止子、復(fù)制起點和卡那霉素抗性元件)，構(gòu)建V1R。用PCR寡聚物將每種區(qū)段的獨特限制性酶加入到各個區(qū)段末端SspI和XhoI用于CMVintA/BGH；EcoRV和BamHI用于kanr基因；而BcII和SalI用于orir。選擇這些酶位點，是因為它們允許定向連接各個PCR衍生DNA區(qū)段，隨后喪失每個位點EcoRV和SspI留下適合連接的平端DNA，而BamHI和BcII留下互補(bǔ)突出端，SalI和XhoI同樣留下互補(bǔ)突出端。在通過PCR獲得這些區(qū)段之后，用上述合適的限制酶消化各個區(qū)段，然后在含有所有三種DNA區(qū)段的單一反應(yīng)混合物中連接在一起。設(shè)計orir的5’端包含T2 rho非依賴性終止子序列，該終止子序列通常見于該區(qū)，因此它可以提供卡那霉素抗性基因的終止信息。通過限制酶消化(8個酶以上)以及對連接接點的DNA測序證實該連接產(chǎn)物。DNA質(zhì)粒產(chǎn)率和用V1R中的病毒基因的異源表達(dá)似乎類似于V1Jns。所獲得的載體的大小凈減少1346個堿基(V1Jns＝4.86kb；V1R＝3.52kb)。
實施例3設(shè)計提高gag基因表達(dá)的合成基因區(qū)段將基因區(qū)段轉(zhuǎn)換成擁有相同翻譯序列的序列，但是具有R.Lathe在研究文章中所定義的可選密碼子選擇，所述文章載于J.Molec.Biol.第183卷，第1-12頁(1985)，題為“由氨基酸序列的數(shù)據(jù)推導(dǎo)的合成寡核苷酸探針理論和實踐的考慮”。提高HIV gag基因區(qū)段表達(dá)的下述方法學(xué)基于我們的假說，即已知不能有效地在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)該基因是整個轉(zhuǎn)錄組合物的結(jié)果。因此，采用編碼相同蛋白序列的可選密碼子，可以去除對gag表達(dá)的抑制。所用的特定密碼子取代方法描述如下1.鑒定合適可讀框的密碼子取代。
2.比較野生型密碼子觀察到的人基因的使用頻率。
3.假如密碼子不是最常使用的，則用在人細(xì)胞中高表達(dá)的最適密碼子取代它。
4.重復(fù)該過程，直至全部基因區(qū)段被取代為止。
5.檢查新基因序列是否有由這些密碼子取代產(chǎn)生的不需要序列(例如“ATTTA”序列、偶然產(chǎn)生的內(nèi)含子剪接識別位點、不需要的限制切酶位點等)，以及檢查消除這些序列的取代密碼子。
6.裝配合成的基因區(qū)段并測試所提高的表達(dá)。
用這些方法產(chǎn)生以下合成基因片段，用于HIV gag產(chǎn)生全部包含用于表達(dá)的合適密碼子選擇的基因。盡管上述流程概述我們用于設(shè)計DNA疫苗的密碼子優(yōu)化基因，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，類似的疫苗效能或基因表達(dá)增加可以通過最少改變所述方法或序列最少變異而獲得。
實施例4I.HIV gag疫苗構(gòu)建物這是包含最適密碼子的完整的HIV-1(CAM1)gag。1 AGATCTACCA TGGGTGCTAG GGCTTCTGTG CTGTCTGGTG GTGAGCTGGA51 CAAGTGGGAG AAGATCAGGC TGAGGCCTGG TGGCAAGAAG AAGTACAAGC101 TAAAGCACAT TGTGTGGGCC TCCAGGGAGC TGGAGAGGTT TGCTGTGAAC151 CCTGGCCTGC TGGAGACCTC TGAGGGGTGC AGGCAGATCC TGGGCCAGCT201 CCAGCCCTCC CTGCAAACAG GCTCTGAGGA GCTGAGGTCC CTGTACAACA251 CAGTGGCTAC CCTGTACTGT GTGCACCAGA AGATTGATGT GAAGGACACC301 AAGGAGGCCC TGGAGAAGAT TGAGGAGGAG CAGAACAAGT CCAAGAAGAA351 GGCCCAGCAG GCTGCTGCTG GCACAGGCAA CTCCAGCCAG GTGTCCCAGA401 ACTACCCCAT TGTGCAGAAC CTCCAGGGCC AGATGGTGCA CCAGGCCATC451 TCCCCCCGGA CCCTGAATGC CTGGGTGAAG GTGGTGGAGG AGAAGGCCTT501 CTCCCCTGAG GTGATCCCCA TGTTCTCTGC CCTGTCTGAG GGTGCCACCC551 CCCAGGACCT GAACACCATG CTGAACACAG TGGGGGGCCA TCAGGCTGCC601 ATGCAGATGC TGAAGGAGAC CATCAATGAG GAGGCTGCTG AGTGGGACAG651 GCTGCATCCT GTGCACGCTG GCCCCATTGC CCCCGGCCAG ATGAGGGAGC701 CCAGGGGCTC TGACATTGCT GGCACCACCT CCACCCTCCA GGAGCAGATT751 GGCTGGATGA CCAACAACCC CCCCATCCCT GTGGGGGAAA TCTACAAGAG801 GTGGATCATC CTGGGCCTGA ACAAGATTGT GAGGATGTAC TCCCCCACCT851 CCATCCTGGA CATCAGGCAG GGCCCCAAGG AGCCCTTCAG GGACTATGTG901 GACAGGTTCT ACAAGACCCT GAGGGCTGAG CAGGCCTCCC AGGAGGTGAA951 GAACTGGATG ACAGAGACCC TGCTGGTGCA GAATGCCAAC CCTGACTGCA1001 AGACCATCCT GAAGGCCCTG GGCCCTGCTG CCACCCTGGA GGAGATGATG1051 ACAGCCTGCC AGGGGGTGGG GGGCCCTGGT CACAAGGCCA GGGTGCTGGC1101 TGAGGCCATG TCCCAGGTGA CCAACTCCGC CACCATCATG ATGCAGAGGG1151 GCAACTTCAG GAACCAGAGG AAGACAGTGA AGTGCTTCAA CTGTGGCAAG1201 GTGGGCCACA TTGCCAAGAA CTGTAGGGCC CCCAGGAAGA AGGGCTGCTG1251 GAAGTGTGGC AAGGAGGGCC ACCAGATGAA GGACTGCAAT GAGAGGCAGG1301 CCAACTTCCT GGGCAAAATC TGGCCCTCCC ACAAGGGCAG GCCTGGCAAC1351 TTCCTCCAGT CCAGGCCTGA GCCCACAGCC CCTCCCGAGG AGTCCTTCAG1401 GTTTGGGGAG GAGAAGACCA CCCCCAGCCA GAAGCAGGAG CCCATTGACA1451 AGGAGCTGTA CCCCCTGGCC TCCCTGAGGT CCCTGTTTGG CAACGACCCC1501 TCCTCCCAGT AAAATAAAGC CCGGGCAGAT CT(SEQ ID NO1)實施例5體外gag疫苗的表達(dá)在轉(zhuǎn)染的人橫紋肌肉瘤(RD)或293細(xì)胞中測試這些構(gòu)建物的體外表達(dá)。由轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞定量gag顯示，V1Jns-opt-gag和V1Jns-tPA-opt gag載體產(chǎn)生分泌型gag。
實施例6檢測HIV-gag細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞在本節(jié)中描述的方法說明用于疫苗接種小鼠的分析檢測。一種基本類似的檢測可以用于靈長類動物，只是必須建立自體B細(xì)胞系以用作每種動物的靶細(xì)胞。對于人類，采用Epstein-Barr病毒可以實現(xiàn)自體B細(xì)胞系的建立，對于獼猴，采用B型皰疹病毒建立。
采用Ficoll-Hypaque離心分離紅細(xì)胞和白細(xì)胞，從或者新鮮取的血或者脾獲得外周血單核細(xì)胞(PBMC)。對于小鼠，也可以使用淋巴結(jié)?；蛘咄ㄟ^在IL-2(20U/ml)和伴刀豆凝集素A(2μg/ml)中體外培養(yǎng)6-12天，或者通過采用等量輻射的抗原提呈細(xì)胞的特定抗原，從PBMC制備效應(yīng)CTL。特定抗原可以包括或者為CTL識別所用動物的MHC單倍型的已知表位，或者工程改造來表達(dá)合適抗原的疫苗病毒構(gòu)建物。靶細(xì)胞可以是同源或MHC單倍型匹配的細(xì)胞系，所述細(xì)胞系已經(jīng)處理以提呈所述合適抗原用于體外刺激CTL。對于Balb/c小鼠，以10μM濃度使用Paterson的gag肽(J.Immunol.，1995)，以用輻射的同源脾細(xì)胞體外再刺激CTL，Paterson的gag肽可以用來在細(xì)胞毒檢測期間，以1-10μM在檢測前于37℃溫育大約2小時，使靶細(xì)胞致敏。對于這些H-2dMHC單倍型小鼠，鼠肥大細(xì)胞瘤細(xì)胞系P815提供優(yōu)良的靶細(xì)胞。通過于37℃溫育靶細(xì)胞大約1-2小時(每～5×106細(xì)胞加入0.2mCi)、然后洗滌幾次靶細(xì)胞，使抗原致敏的靶細(xì)胞加載Na51CrO4，在被CTL殺傷時從所述靶細(xì)胞內(nèi)釋放出Na51CrO4。以諸如100∶1、50∶1、25∶1等的不同效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞比率，將CTL細(xì)胞群與靶細(xì)胞混合，然后一起沉淀，在收獲上清液之前于37℃溫育大約4-6小時，然后用γ計數(shù)儀檢測上清液中靶細(xì)胞釋放出的放射性活性。以靶細(xì)胞可釋放的總計數(shù)(用0.2％Triton X-100處理后獲得)的百分率計算細(xì)胞毒性，所述總計數(shù)已經(jīng)從中減去靶細(xì)胞自發(fā)釋放的計數(shù)。
實施例7檢測HIV gag特異性抗體設(shè)計ELISA檢測針對HIV產(chǎn)生的抗體，用兩者中的一種特定重組p24 gag蛋白作底物抗原。96孔微量滴定板每孔加50μl重組抗原(2ug/ml)的PBS(磷酸緩沖鹽溶液)溶液于4℃、震蕩平臺上包被過夜?？乖ㄖ亟Mp24 gag(Intracell)。平板用洗滌緩沖液(PBS/0.05％Tween 20)沖洗4次，然后每孔加入200ul封閉緩沖液(1％康乃馨乳(Carnation milk)的PBS/0.05％Tween-20溶液)在室溫下震蕩1小時。免疫前血清和免疫血清用封閉緩沖液按需要稀釋范圍稀釋，每孔加入100μl。平板在室溫下震蕩溫育1小時，然后用洗滌緩沖液洗滌4次。然后，將用封閉緩沖液稀釋為1∶2000的、與辣根過氧化酶綴合的第二抗體(抗獼猴Ig，Southern Biotechnology Associates；抗小鼠Ig和抗兔Ig，Jackson Immuno Research)，以100μl/孔加入每個樣品中，于室溫下震蕩溫育1小時。平板用洗滌緩沖液洗滌4次，然后每孔加入100μl含1mg/ml鄰苯二胺(o-PD，Calbiochem)的100mM檸檬酸緩沖液(pH4.5)顯色。將平板于450nm動態(tài)地(反應(yīng)的第一個10分鐘)以及在10分鐘和30分鐘終點時讀取吸光度(Thermo-max microplatereader，Molecular Devices)。
實施例8T細(xì)胞增殖檢測獲得并測試PBMC對特定抗原記憶應(yīng)答，通過PBMC細(xì)胞群內(nèi)的增殖測定。用3H-胸苷監(jiān)測增殖情況，將3H-胸苷在收獲細(xì)胞前加入細(xì)胞培養(yǎng)物溫育18-24小時。假如細(xì)胞發(fā)生了增殖，則細(xì)胞收獲儀將含同位素的DNA阻留于濾膜上，而靜止細(xì)胞未摻入同位素，游離形式的同位素不被濾膜阻留。對于嚙齒類動物或靈長類動物物種，將總體積為200μl的完全培養(yǎng)基(RPMI/10％胎牛血清)中的4×105細(xì)胞接種于96孔微量滴定板。單獨用PBMC和培養(yǎng)基測定本底增殖應(yīng)答，采用諸如濃度為1-5μg/ml的植物凝集素(PHA)或伴刀豆凝集素A(ConA)的凝集素產(chǎn)生非特異性應(yīng)答用作陽性對照。具體抗原包括或者已知的肽表位、純化蛋白或者滅活的病毒。肽抗原的濃度范圍為1-10μM，蛋白抗原的濃度范圍為1-10μg/ml。凝集素誘導(dǎo)的增殖高峰在細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)的第3-5天，而抗原特異性應(yīng)答高峰在第5-7天。特異性增殖發(fā)生時，所獲得的輻射計數(shù)至少高于培養(yǎng)基本底3倍，并且輻射計數(shù)通常以相對于本底的比率或刺激指數(shù)(SI)表示。
實施例9設(shè)計我們用的策略，以誘導(dǎo)針對HIV的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)和中和抗體應(yīng)答，主要是針對HIV gag(約95％保守)和env(gp160或gp120；70-80％保守)基因產(chǎn)物。gp160含有HIV顆粒上僅有的已知中和抗體表位，而由于已知這些細(xì)胞免疫的發(fā)生與消除感染后的原發(fā)性病毒血癥有關(guān)，以及CTL在保持無病狀態(tài)中的作用，強(qiáng)調(diào)了抗-env和抗-gag CTL應(yīng)答的重要性，所述細(xì)胞免疫發(fā)生于中和抗體出現(xiàn)之前(Koup等，J.Virol.684650(1994))。盡管HIV的遺傳多樣性是眾所周知的，我們還是希望獲得更廣泛的中和抗體，所述中和抗體由包括幾種得自臨床分離物的典型env基因和gp41(約90％是保守的；并含有更保守的2F5中和表位)誘導(dǎo)產(chǎn)生，同時高度保守的gag基因應(yīng)該產(chǎn)生廣泛的交叉病毒株CTL應(yīng)答。因為該疫苗策略產(chǎn)生針對HIV的強(qiáng)體液免疫和細(xì)胞免疫(在非人的靈長類動物，與其它可用的HIV疫苗策略相比，該方法具有獨特的優(yōu)勢)。A.HIV-1gag多核苷酸疫苗的開發(fā)基于我們例如由用于人類表達(dá)的最適密碼子組成的基因進(jìn)行的HIV env基因表達(dá)實驗，設(shè)計并合成一種合成的p55 gag基因(optgag)，并將其克隆入V1R，所述基因含有整個過程中產(chǎn)生的350個沉默突變(共計1500個核苷酸)的合適密碼子選擇。也構(gòu)建第二種形式的opt gag載體，該載體在NH2末端含有類似于上述HIV env信號肽序列、編碼tPA信號肽的序列，也去除位于野生型基因的該位置的核定位序列基元。設(shè)計這種修飾以測試，改變gag進(jìn)入ER/golgi分泌途徑的正常細(xì)胞內(nèi)運輸類型是否會改變gag DNA疫苗的免疫原性。將tPA前導(dǎo)肽加入gag引起水平高得多的待分泌gag，該分泌蛋白與gag重量相比，是作為更高分子量的形式遷移的。這表明，因為用tPA前導(dǎo)肽修飾發(fā)生翻譯后修飾——可能是糖基化。
測試了已經(jīng)用或者兩種優(yōu)化p55 gag構(gòu)建物(V1R-opt gag±tPA前導(dǎo)序列)中的一種或者V1R-gag(野生型)免疫的小鼠在注射一次后(接種劑量＝10、3.3或1μg/小鼠)的抗-gag肽的CTL應(yīng)答。所有劑量的兩種V1R-opt gag DNA均產(chǎn)生高水平的抗-gag CTL，V1R-tPA-optgag產(chǎn)生最高水平的特異性殺傷(1μg劑量，于E/T＝3下約85％)。比較每個DNA劑量的細(xì)胞毒性曲線證實，V1R-tPA-opt gag接種產(chǎn)生較V1R-gag (野生型)強(qiáng)約100倍的CTL應(yīng)答?？傮w來說，三種疫苗組的免疫應(yīng)答顯示相同的CTL、T輔助細(xì)胞和抗體應(yīng)答的相對潛能(從高到低依次為)V1R-tPA-opt gag＞V1R-opt gag＞V1R-gag(野生型)?？傊?，opt gag構(gòu)建物的CTL、體液免疫應(yīng)答和輔助T細(xì)胞應(yīng)答高得多，尤其是具有tPA前導(dǎo)序列的opt gag構(gòu)建物。
實施例10治療方法給需要抗人免疫缺陷病毒感染的治療性或預(yù)防性免疫的人注射接種編碼所有或部分env、gag或pol基因或其組合物的HIV DNA。所述注射可以是腹膜內(nèi)、皮下、肌內(nèi)或皮內(nèi)注射。所述HIV DNA可以用作免疫應(yīng)答的引物，或者可以用作免疫應(yīng)答的增強(qiáng)劑?？梢栽诮o所述人員注射包含滅活HIV、減毒HIV的藥用組合物、包含HIV衍生蛋白的組合物、或它們的組合物之前、同時或之后，進(jìn)行該DNA注射。
實施例11治療方法用抗-HIV抗病毒劑或其組合物治療需要治療性治療人免疫缺陷病毒感染的人。用本發(fā)明公開的HIV DNA藥用組合物注射接種所述受治療的個體。
權(quán)利要求
1.合成的多核苷酸，它包含編碼非哺乳動物蛋白或其片段的DNA序列，所述DNA序列包含在哺乳動物宿主優(yōu)化表達(dá)的密碼子。
2.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述蛋白選自HIV蛋白、HSV蛋白、HAV蛋白、HBV蛋白、HCV蛋白、HPV蛋白、HSV蛋白、瘧原蟲蛋白、分枝桿菌蛋白、疏螺旋體蛋白和輪狀病毒蛋白。
3.權(quán)利要求2的多核苷酸，其中所述蛋白是一種HIV蛋白。
4.權(quán)利要求3的多核苷酸，它具有以下DNA序列1 AGATCTACCA TGGGTGCTAG GGCTTCTGTG CTGTCTGGTG GTGAGCTGGA51 CAAGTGGGAG AAGATCAGGC TGAGGCCTGG TGGCAAGAAG AAGTACAAGC101 TAAAGCACAT TGTGTGGGCC TCCAGGGAGC TGGAGAGGTT TGCTGTGAAC151 CCTGGCCTGC TGGAGACCTC TGAGGGGTGC AGGCAGATCC TGGGCCAGCT201 CCAGCCCTCC CTGCAAACAG GCTCTGAGGA GCTGAGGTCC CTGTACAACA251 CAGTGGCTAC CCTGTACTGT GTGCACCAGA AGATTGATGT GAAGGACACC301 AAGGAGGCCC TGGAGAAGAT TGAGGAGGAG CAGAACAAGT CCAAGAAGAA351 GGCCCAGCAG GCTGCTGCTG GCACAGGCAA CTCCAGCCAG GTGTCCCAGA401 ACTACCCCAT TGTGCAGAAC CTCCAGGGCC AGATGGTGCA CCAGGCCATC451 TCCCCCCGGA CCCTGAATGC CTGGGTGAAG GTGGTGGAGG AGAAGGCCTT501 CTCCCCTGAG GTGATCCCCA TGTTCTCTGC CCTGTCTGAG GGTGCCACCC551 CCCAGGACCT GAACACCATG CTGAACACAG TGGGGGGCCA TCAGGCTGCC601 ATGCAGATGC TGAAGGAGAC CATCAATGAG GAGGCTGCTG AGTGGGACAG651 GCTGCATCCT GTGCACGCTG GCCCCATTGC CCCCGGCCAG ATGAGGGAGC701 CCAGGGGCTC TGACATTGCT GGCACCACCT CCACCCTCCA GGAGCAGATT751 GGCTGGATGA CCAACAACCC CCCCATCCCT GTGGGGGAAA TCTACAAGAG801 GTGGATCATC CTGGGCCTGA ACAAGATTGT GAGGATGTAC TCCCCCACCT851 CCATCCTGGA CATCAGGCAG GGCCCCAAGG AGCCCTTCAG GGACTATGTG901 GACAGGTTCT ACAAGACCCT GAGGGCTGAG CAGGCCTCCC AGGAGGTGAA951 GAACTGGATG ACAGAGACCC TGCTGGTGCA GAATGCCAAC CCTGACTGCA1001 AGACCATCCT GAAGGCCCTG GGCCCTGCTG CCACCCTGGA GGAGATGATG1051 ACAGCCTGCC AGGGGGTGGG GGGCCCTGGT CACAAGGCCA GGGTGCTGGC1101 TGAGGCCATG TCCCAGGTGA CCAACTCCGC CACCATCATG ATGCAGAGGG1151 GCAACTTCAG GAACCAGAGG AAGACAGTGA AGTGCTTCAA CTGTGGCAAG1201 GTGGGCCACA TTGCCAAGAA CTGTAGGGCC CCCAGGAAGA AGGGCTGCTG1251 GAAGTGTGGC AAGGAGGGCC ACCAGATGAA GGACTGCAAT GAGAGGCAGG1301 CCAACTTCCT GGGCAAAATC TGGCCCTCCC ACAAGGGCAG GCCTGGCAAC1351 TTCCTCCAGT CCAGGCCTGA GCCCACAGCC CCTCCCGAGG AGTCCTTCAG1401 GTTTGGGGAG GAGAAGACCA CCCCCAGCCA GAAGCAGGAG CCCATTGACA1451 AGGAGCTGTA CCCCCTGGCC TCCCTGAGGT CCCTGTTTGG CAACGACCCC1501 TCCTCCCAGT AAAATAAAGC CCGGGCAGAT CT(SEQ ID NO1).
5.權(quán)利要求3的多核苷酸，它在導(dǎo)入脊椎動物組織包括人體內(nèi)組織時，在體內(nèi)誘導(dǎo)抗-HIV中和抗體、HIV特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答或保護(hù)性免疫應(yīng)答，其中所述多核苷酸包含編碼HIV gag、gag蛋白酶或env基因產(chǎn)物的基因。
6.在脊椎動物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括將lng-100mg權(quán)利要求1的多核苷酸導(dǎo)入所述脊椎動物組織。
7.權(quán)利要求6的方法，所述方法還包括給予減毒的病原體、殺傷的病原體、亞單位疫苗、蛋白疫苗和它們的組合物。
8.誘導(dǎo)抗HIV感染的免疫應(yīng)答的免疫原性組合物，所述組合物包括權(quán)利要求3的多核苷酸和一種藥用可接受載體以及一種可任選的佐劑。
9.在靈長類動物中誘導(dǎo)抗-HIV免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括將權(quán)利要求3的多核苷酸導(dǎo)入所述靈長類動物組織，并同時胃腸外給予一種細(xì)胞因子。
10.一種方法，所述方法誘導(dǎo)抗原提呈細(xì)胞以刺激細(xì)胞毒T細(xì)胞增殖以及輔助T細(xì)胞增殖——一種包括HIV抗原特異性的淋巴因子分泌的效應(yīng)子功能，所述方法包括使脊椎動物在體內(nèi)暴露于權(quán)利要求3的多核苷酸。
11.治療需要這種治療的患者的方法，所述方法包括給予所述患者權(quán)利要求3的多核苷酸和一種抗HIV抗病毒劑。
12.藥用組合物，所述組合物包含權(quán)利要求1的多核苷酸。
全文摘要
提供編碼HIV gag和修飾的HIV gag的合成DNA分子。所述合成分子的密碼子是預(yù)定宿主細(xì)胞優(yōu)選的密碼子。所述合成分子可以用作一種多核苷酸疫苗,該疫苗通過刺激中和抗體和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫,提供抗HIV感染的有效免疫預(yù)防。
文檔編號A61K38/00GK1252075SQ9880397
公開日2000年5月3日 申請日期1998年2月3日 優(yōu)先權(quán)日1997年2月7日
發(fā)明者小J·W·希弗, M·E·M·達(dá)維斯, D·C·弗雷德, M·A·劉, H·C·佩里 申請人:麥克公司