專利名稱：一種人工抗菌肽及其基因與制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)與生物醫(yī)藥技術(shù)，特別涉及到一種人工抗菌肽及其基因與 制備方法。
背景技術(shù)：
抗菌肽(antibacterial ρ印tide)于1972年首次在昆蟲(chóng)體內(nèi)分離獲得，是由生 物體免疫系統(tǒng)在受到外界病原體侵襲時(shí)產(chǎn)生的一類非特異性免疫應(yīng)答產(chǎn)物，具有廣譜抗細(xì) 菌、真菌、病毒及抑殺腫瘤細(xì)胞等作用。分子質(zhì)量較小，富含疏水氨基酸和堿性氨基酸，多帶 正電荷，耐高溫、酸堿，穩(wěn)定性強(qiáng)。對(duì)比抗生素，抗菌肽的抗菌譜更廣(Miyasaki K T, Lofel R, Lehrer RI. Sensitivity of periodontal pathogens to the bacterial activity of synthetic protegrins, antibioticpeptides derived from porcine leukocytes[J]. J Dent Res,1997,76 1453-1459. Andreu D, RivasL. Animal antimicrobial peptides :an overview[J]. Biopolymers, 1998,47 :415_433.)；其殺菌機(jī)理獨(dú)特，不易產(chǎn)生耐藥菌；作用 專一，對(duì)正常細(xì)胞無(wú)明顯毒副作用，無(wú)致畸作用，不易產(chǎn)生蓄積中毒。是一類理想的新型“綠 色”抗菌藥物。Hepcidin是2000年被發(fā)現(xiàn)的一種在肝臟合成并富含半胱氨酸的抗菌肽，屬防御 素家族。Hepcidin的蛋白結(jié)構(gòu)在不同物種間高度保守，其蛋白結(jié)構(gòu)富含精氨酸、賴氨酸等 帶正電的氨基酸殘基，8個(gè)半胱氨酸形成4個(gè)二硫鍵，成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，第4和第5個(gè)半胱氨酸 在發(fā)夾的拐角處形成一個(gè)二硫鍵，在磷酸緩沖液中形成穩(wěn)定的β折迭結(jié)構(gòu)(王元忠，周建 新.H印cidin:具有抗茵活性的鐵調(diào)節(jié)激素[J],生理科學(xué)進(jìn)展，2005，36 (4) :372_375·)。 和許多富含半胱氨酸的抗菌肽類似，Hepcidin具有抑制細(xì)菌和真菌生長(zhǎng)的作用，在體外 抗菌試驗(yàn)中，具有抗大腸桿菌、B群鏈球菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、微球菌等細(xì) 菌活性以及抗白色念珠菌、曲霉菌等真菌活性，其在體內(nèi)和其它抗菌肽一樣參與宿主的 天然防御(Vyoral D, Petrak J. Hepcidin :a direct link between iron metabolism and immunity [J], Int J Biochem CellBiol，2005，37 (9) :1768_1773.周雷，張勇，王建 鋒，等.奶牛防御素5基因的克隆與原核表達(dá)[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，2(1) 7-10.)。同時(shí)，H印cidin還是維持鐵穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵激素(Nicolas G, Viatte L, Lou DQ, et al. Constitutive hepcidin expression prevents iron overload in a mouse model ofhemocromatosis[J]. Nat Genet, 2003，34 :97_101·)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所述一種具備高抑菌活性的新抗菌肽，是根據(jù)Genbank上h印cidin抗菌 肽的氨基酸序列(Genbank ID :NP_001161799. 1)，人工設(shè)計(jì)并合成一種h印cidin抗菌肽的 核苷酸序列，并構(gòu)建到表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化到酵母受體菌中誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物表現(xiàn)出高表達(dá) 量，高活力等特性。體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該抗菌肽生物活性強(qiáng)，對(duì)金黃色葡萄球菌、無(wú)乳 鏈球菌、枯草芽孢桿菌均有明顯的抑菌活性。
一種人工抗菌肽，其氨基酸序列如Seq ID No. 1所示。一種人工抗菌肽，是通過(guò)對(duì)Seq ID No. 1所示的氨基酸序列進(jìn)行取代、缺失、加入、 環(huán)化、L-型氨基酸變?yōu)镈-型氨基酸而得到的與Seq ID No. 1所示的氨基酸序列所示的多 肽相同抗菌活性的氨基酸序列。上述人工抗菌肽在抗金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌 (Bacillussubtilis)、無(wú)乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)中的應(yīng)用。編碼上述人工抗菌肽的基因。所述基因的核苷酸序列如Seq ID No. 2所示。含有上述基因的表達(dá)載體。所述表達(dá)載體指pPICZ α A-h印cidin。上述人工抗菌肽的制備方法，指將上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主菌中，培養(yǎng)宿主菌使 其表達(dá)所述人工抗菌肽。所述宿主菌指大腸桿菌或酵母菌。所述酵母菌指畢赤氏酵母菌(Pichia pastoris)。本發(fā)明對(duì)Genbank中記錄的h印cidin抗菌肽的氨基酸序列(Genbank ID NP_001161799. 1)進(jìn)行人工改造和設(shè)計(jì)，得到本發(fā)明Seq ID No. 1所示的氨基酸序列，并 根據(jù)畢赤氏酵母對(duì)氨基酸的密碼子偏好性設(shè)計(jì)其核苷酸序列，得到編碼本發(fā)明人工抗菌肽 的基因。通過(guò)構(gòu)建載體，轉(zhuǎn)化到宿主，誘導(dǎo)表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，與原多肽表達(dá)蛋白相比，本發(fā)明的 人工抗菌肽具有表達(dá)量高，抗菌譜寬的優(yōu)點(diǎn)。即原多肽的表達(dá)量約127.9mg/L，不能滿足 生產(chǎn)需要，生產(chǎn)成本過(guò)高；改造后的多肽的基因在畢赤氏酵母中的誘導(dǎo)表達(dá)量大大提高，約 214.2mg/L。原多肽僅對(duì)枯草芽孢桿菌有抑菌作用，且抑菌效果不理想。本發(fā)明的人工抗 菌肽不僅對(duì)枯草芽孢桿菌有抑菌效果，對(duì)金黃色葡萄球菌和無(wú)乳鏈球菌均有明顯的抑殺作 用。


圖 1.重組質(zhì)粒 pPICZ α A-h印cidin PCR 鑒定1 重組質(zhì)粒 pPICZ α A_h印cidin 2. DNA Marker圖2重組酵母菌PCR鑒定1.重組酵母菌；2.空載體；3. DNAMarker圖3!fepcidin表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析1.空載體對(duì)照；2.篩選高拷貝h印cidin表達(dá)產(chǎn)物；3.未經(jīng)篩選h印cidin表達(dá)產(chǎn) 物；4.蛋白Marker圖4本發(fā)明人工抗菌肽的抑菌對(duì)比試驗(yàn)A.金黃色葡萄球菌；B.枯草芽孢桿菌；C.無(wú)乳鏈球菌菌斑1.氨芐青霉素；2 5.本發(fā)明的多肽；6陰性對(duì)照?qǐng)D5原抗菌肽的抑制試驗(yàn)A.枯草芽孢桿菌；1.陰性對(duì)照；2.陽(yáng)性對(duì)照Amp ；3-5. 50 μ L原多肽表達(dá)上清液；B金黃色葡萄球菌；
1.AMP, 2.本發(fā)明的多肽，3-7.原多肽
具體實(shí)施例方式以下具體實(shí)驗(yàn)操作步驟對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，實(shí)驗(yàn)方法中如無(wú)特別說(shuō)明，均為 常規(guī)方法。實(shí)施例1.構(gòu)建重組酵母菌步驟1.根據(jù)Genebank上h印cidin抗菌肽的氨基酸序列(Genbank ID NP_001161799. 1)，設(shè)計(jì)出本發(fā)明抗菌肽的氨基酸序列Seq ID No. 1，再根據(jù)畢赤氏酵母對(duì) 密碼子的偏好性，在不改變氨基酸的條件下，設(shè)計(jì)編碼該多肽的核苷酸序列如Seq ID No. 2 所示，由北京Irwitrogen公司合成該核苷酸序列。并根據(jù)Seq ID No. 2設(shè)計(jì)一對(duì)引物H1/H2 Hl 5' GGCCTCGAGATGGCTCTGTCTTCCACAATC 3‘H2 5' CGCTCTAGATCAGGTCTTCCTGCAACAGCA 3‘在Seq ID No. 2的3’端引入終止密碼子，在Seq ID No. 2兩端分別引入Xho I和 Xba I酶切位點(diǎn)。合成原抗菌肽Genbank ID :NP_001161799. 1的氨基酸序列的基因如Seq ID No. 3 所示的核苷酸序列，并根據(jù)該序列設(shè)計(jì)合成引物如下H3 5' GGCCTCGAGATGGCTCTGAACACGAACATC 3‘H4 5' CGCTCTAGATCAGGTCTTGCAGCACCAGCC 3'，在 Seq ID No. 3 的 3，端引入終 止密碼子，在Seq ID No. 3兩端分別引入Xho I和Xba I酶切位點(diǎn)。步驟2.構(gòu)建表達(dá)載體pPICZa A-h印cidin材料表達(dá)載體pPICZ a A購(gòu)于Invitrogen公司。T4DNA連接酶、GoTaq酶、Xho I、 Xba I等限制性內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司，氨芐青霉素(AMP)、Zeocin購(gòu)于Invitrogen公司。方法PCR擴(kuò)增合成的h印cidin基因整合在載體PCR2. 1-T0P0(合成基因過(guò)程中 Invitrogen附贈(zèng)的)上，提質(zhì)粒后PCR擴(kuò)增PCR2. 1-TOPO中的h印cidin。反應(yīng)條件如下 94°C預(yù)變性 5min，94°C 30s, 58°C 30s, 72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 IOmin0
_^_體積 L)
ddH2012.7~
1 OxPCR Buffer5
dNTP4
Γ , Primer 1 (HI)1
ν
Primer 2 (Η2)1
GoTaq 酶0.3
模板1
總體積25 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，采用Xho I, Xba I雙酶切PCR產(chǎn) 物和pPICZ α A，通過(guò)T4DNA連接酶將人工合成基因h印cidin整合到pPICZ α A(購(gòu)于Invitrogen)中，PCR鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒，見(jiàn)圖1，命名為pPICZ α Α-h印cidin，PCR鑒定的陽(yáng) 性質(zhì)粒送檢DNA測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與Seq ID No. 2 一致。相同方法構(gòu)建原抗菌肽的基因Seq ID No. 3的表達(dá)載體pPICZ α Α-h印cidin，，PCR 引物為H3/H4，雙酶切酶為Xho I、Xba I。步驟3轉(zhuǎn)化酵母菌及鑒定材料宿主菌畢赤氏酵母菌X-33 (Pichiapastoris)，由發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室有保存，自 申請(qǐng)日起20年可向公眾發(fā)放用于驗(yàn)證試驗(yàn)。方法陽(yáng)性重組質(zhì)粒pPICZ α A_h印cidin及pPICZ α A_h印cidin，經(jīng)Sac I線性化 后，分別電轉(zhuǎn)化畢赤氏酵母菌X-33。電擊條件電壓1800V，電阻200 Ω，電容25 μ F，電擊時(shí) 間5ms。在25 μ g/mLZeocin的YPDs固體培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)YPD液體培養(yǎng)基增菌 后，提取YPD液體培養(yǎng)基中的重組酵母DNA，進(jìn)行PCR鑒定，鑒定引物5' AOX 5' -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3 ‘3' AOX 5' -GGCAAATGGCATTCTGACAT-3 ‘PCR 反應(yīng)程序?yàn)? 940C Imin;② 94°C lmin，59°C lmin，72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)； 72°C IOmin電泳結(jié)束后取5 μ L樣用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2。轉(zhuǎn)化了 pPICZ α A-h印cidin，的重組酵母菌的PCR鑒定，引物同為5' A0X/3' AOX 程序同上。步驟4.篩選高拷貝重組酵母菌用無(wú)菌96孔板篩選pPICZ α A_h印cidin，、pPICZ α A-hepcidin轉(zhuǎn)化的高拷貝陽(yáng)性 重組酵母菌，Zeocin (購(gòu)于Invitrogen, Cat. No. :R250_0)抗性濃度為2、4、6mg/ml梯度上 升，篩選多拷貝整合轉(zhuǎn)化子。步驟5.誘導(dǎo)表達(dá)將篩選到重組酵母菌的YPD液體培養(yǎng)基培養(yǎng)物按1 50的比例轉(zhuǎn)接于IOOmL BMGY培養(yǎng)基，在30°C 250rpm培養(yǎng)至0D600達(dá)到3 6，離心收集菌體，并重懸于500mL BMMY 培養(yǎng)基，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)28°C，250rpm培養(yǎng)96h，每24h補(bǔ)加甲醇至終濃度為1%。96h后 IOOOOrpm, 20min離心收集培養(yǎng)上清。測(cè)濃度，pPICZ α A-h印cidin轉(zhuǎn)化的重組酵母菌的抗菌肽表達(dá)量約214. 2mg/L, pPICZ α A-hepcidin'轉(zhuǎn)化的重組酵母菌的抗菌肽表達(dá)量為約127. 9mg/L。步驟6.步驟5所獲得的上清經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定，結(jié)果如圖3所示。實(shí)施例2.抑菌試驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)菌菌株金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CVCC1882、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)CVCC717、無(wú)乳鏈球菌 CVCC586(Str印tococcus agalactiae)，第一發(fā)明人所在實(shí) 驗(yàn)室有保存，保證自申請(qǐng)日起二十年內(nèi)，可向公眾發(fā)放用于驗(yàn)證試驗(yàn)。方法用無(wú)菌棉拭子蘸取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的金黃色葡萄球、枯草芽孢桿菌、無(wú)乳鏈球菌 懸浮液，均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基，室溫放置3min。無(wú)菌操作將無(wú)菌紙片貼在涂好菌的平 板上，滴加50 μ L待測(cè)的實(shí)施例1制備得到的上清樣品，37°C培養(yǎng)16h，以同體積pPICZ α A 空載體轉(zhuǎn)化X-33酵母的表達(dá)蛋白為陰性對(duì)照，5 μ L氨芐青霉素(AMP 50 μ g/mL)為陽(yáng)性對(duì)照。測(cè)量抑菌直徑(抑菌直徑=抑菌圈直徑-無(wú)菌紙片直徑)。結(jié)果抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示，2#和3#菌株對(duì)金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌、枯草芽孢桿菌 有較好的抑菌活性，而對(duì)大腸桿菌均無(wú)明顯作用。4#菌株對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌 有抑菌活性，對(duì)無(wú)乳鏈球菌無(wú)抑菌活性。5#菌株僅對(duì)金黃色葡萄球菌有抑菌活性，對(duì)枯草芽 孢桿菌、無(wú)乳鏈球菌無(wú)抑菌活性。(見(jiàn)表1、圖4)。表1重組hepcidin不同酵母菌株抑菌試驗(yàn)的抑菌環(huán)直徑結(jié)果(直徑cm)
權(quán)利要求
一種人工抗菌肽，其氨基酸序列如Seq ID No.1所示。
2.—種人工抗菌肽，是通過(guò)對(duì)Seq ID No. 1所示的氨基酸序列進(jìn)行取代、缺失、加入、環(huán) 化、L-型氨基酸變?yōu)镈-型氨基酸而得到的與Seq ID No. 1所示的氨基酸序列所示的多肽 相同抗菌活性的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1或2所述人工抗菌肽在抗金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、無(wú)乳鏈球菌(Str印tococcus agalactiae)中的應(yīng)用。
4.編碼權(quán)利要求1或2所述人工抗菌肽的基因。
5.權(quán)利要求4所述的基因，其核苷酸序列如SeqID No. 2所示。
6.含有權(quán)利要求4或5所述基因的表達(dá)載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體，指pPICZα A-h印cidin。
8.權(quán)利要求1或2所述人工抗菌肽的制備方法，指將權(quán)利要求6或7所述的表達(dá)載體 轉(zhuǎn)化到宿主菌中，培養(yǎng)宿主菌使其表達(dá)所述人工抗菌肽。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，所述宿主菌指大腸桿菌或酵母菌。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，所述酵母菌指畢赤氏酵母菌(Pichia pastoris)。全文摘要
本發(fā)明“一種人工抗菌肽及其基因與制備方法”，屬于生物制藥領(lǐng)域。本發(fā)明的人工抗菌肽通過(guò)對(duì)Genbank中的hepcidin抗菌肽的氨基酸序列(Genbank IDNP_001161799.1)進(jìn)行了改造，獲得了活性高、抗菌譜更寬的新抗菌肽。本發(fā)明還根據(jù)畢赤氏酵母菌對(duì)氨基酸密碼子的偏好性，對(duì)編碼該多肽的核苷酸序列進(jìn)行了優(yōu)化，該核苷酸序列轉(zhuǎn)入畢赤氏酵母菌中，表達(dá)量、抗菌譜明顯高于原h(huán)epcidin抗菌肽的基因。
文檔編號(hào)A61P31/04GK101955525SQ201010224980
公開(kāi)日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2010年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月13日
發(fā)明者吳培星, 孫茜勝, 宋楠, 張繼瑜, 徐玲, 李純玲 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所;北京養(yǎng)元獸藥有限公司;北京天之泰生物科技有限公司