專利名稱：對蝦的G蛋白pvGβ的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種從對蝦中G蛋白克隆的pvGβ1基因。
背景技術：
細胞與細胞之間的信息和物質之間的交流最主要的一種方式就是G蛋自信號途徑。該途徑普遍存在于各種生物體內，各種胞外信號，包括化學藥物、蛋白激素等都通過細胞膜上具有七重跨膜片斷結構特征的G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein-coupled receptors，GPCR)將信號傳給細胞內的G蛋白(GTP-binding protein)，再由各種G蛋白亞基(α、β和γ亞基)通過不同的組合激活下游不同的分子途徑，使細胞以至機體發(fā)生不同的生物學效應。
G蛋白是α、β和γ 3個不同的亞基結合而成的異源三聚體，可將七次跨膜受體接受的胞外信號傳給胞內的效應生物功能蛋白。β和γ亞基總是緊密結合在一起作為一個功能單位，而α亞基可以與二磷酸鳥苷GDP或三磷酸鳥苷(GTP)結合。α亞基在結合GDP狀態(tài)下比結合GTP更易與β/γ亞基復合體親和。當配體與膜受體結合后，可引起與α亞基結合的GDP被GTP取代，并導致GTP-α亞基與β/γ亞基復合體的分離，進而各自調控相應的效應功能蛋白。α亞基具有內在的GTP酶活性，可將GTP水解成GDP，使GDP-α亞基和功能蛋白分開，并再度與β/γ亞基復合體形成緊密結合，從而恢復到非激活狀態(tài)。
G蛋白β亞基是最主要的G蛋白成員之一。哺乳動物中已克隆的G蛋白β亞基有5種(β1、β2、β3、β4、β5)。相對Gα來說，β/γ亞基復合體也是一個獨立的功能單位，它們在細胞興奮、神經遞質信號傳導、脫敏作用、細胞生長、分化和感覺傳遞等活動中都有調節(jié)作用。β/γ可以提高Gα對GDP的親和力，至少可以部分阻斷Gα與效應分子結合的位點，使Gα保持在無活性的狀態(tài)。β/γ還能調節(jié)Gα的一些效應分子，如腺苷酸環(huán)化酶(Adenylyl cyclase，AC)、磷脂酶C(phospholipase C，PLC-β)、磷脂酶A2(phospholipase A2)和離子通道。β/γ激活PLC-β是不依賴Gα的，不同的β/γ亞基組合能激活或者抑制不同的AC異構體。同樣，β/γ對離子通道的調節(jié)也有正調控和負調控，例如β/γ通過直接結合在一種非L型的鈣離子通道來抑制該通道，但是同時它卻激活了鉀離子通道。β/γ還能通過G蛋白偶聯(lián)受體激活ras、MAPK和JNK。
β/γ在氣味刺激多種第二信史過程中的作用證明了β/γ在嗅覺系統(tǒng)中的重要性。已有報道，Gβ1在美國龍蝦(Homarus americanus)的腦神經元和嗅覺受體神經元中有非常豐富的表達。進一步說明Gβ在甲殼類嗅覺系統(tǒng)中的重要功能。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于利用生物工程技術從對蝦的感覺器官觸角和眼中克隆與其它Gβ1同源的新基因pvGβ1，為對蝦生長與發(fā)育提供理論基礎，為對蝦養(yǎng)殖、防病害以及新型配合飼料的研制奠定理論基礎。
本發(fā)明的基因名稱pvGβ1(Penaeus vannamei heterotrimeric G protein beta 1 subunit)Genbank序列號AY626793序列特征長度1272個堿基類型核酸鏈型單鏈幾何特征線性分子類型cDNA基因來源南美白對蝦Penaeus vannamei(Litopenaeus vannamei)蛋白編碼序列27-1049表達產物pvGβ1翻譯成蛋白的氨基酸序列340aaMNDLDSLRQEAERLKNTIRDARKNALDTTLVQATSGMDPIGRIQMRTRRILRGHLAKIYAMHWGSDSRNLVSASQDGKLIVWDSYTTNKVHAIPLRSSWVMTCAYAPSGSYVACGGLDNICSIYNLKTREGNVRVSRELPGHTGYLSCCRFLDDNQIVTSSGDMTCALWDIETGQQCTQFTGHTGDVMSLSLSPNMNTFTSGACDASAKLWDIRDGMCRQTFPGHESDINAVTFFPNGHAFATGSDDATCRLFDIRADQELAMYSHDNIICGITSVAFSKSGRLLLAGYDDFNCNVWDSMRTERAGVLAGHDNRVSCLGVTEDGMAVATGSWDSFLKIWNcDNA序列描述1 attttttagt tttgtaattt ttagaaatga atgatttgga tagtttacga caagaagcag aaagactaaa gaacacaata81 cgagatgctc gcaaaaatgc acttgacacg accttggtcc aagccacatc cggcatggac cctattggcc gaattcagat161 gcgaaccagg agaacgctta gaggacactt agccaaaata tatgccatgc actgggggtc ggactctagg aatttggtat241 ctcatagtat gggacagtta cactacaaac aaggtgcatg cagcatctca agacggcaag ccattcccct tcggtccagc321 tgggtcatga cctgtgccta tgctccctcg ggcagttacg ttgcctgtgg tggccttgat aacatctgtt ctatatacaa401 cttaaagaca agagaaggca atgtgagagt gagtagggag ttgcctggtc acactggtta cctaagttgc tgtcggttcc
481 tagacgacaa ccaaatagtc acaagctcgg gagacatgac ctgtgccctc tgggatatag agacgggtca gcagtgcacg561 caattcacag gccatacagg ggatgtgatg tccctgtccc tgtcaccgaa catgaacaca ttcacatcag gtgcctgtga641 tgcgtctgct aagctatggg acattcgtga tgggatgtgc cgccagacct tcccaggaca cgaatctgac attaatgcag721 ttacattctt ccccaatggg catgcatttg ccacgggatc agatgatgcc acatgccgcc tatttgacat tcgtgcagac801 caggagcttg ccatgtactc tcatgacaac attatttgtg gcatcacctc agtggcattc agcaagtctg gcagactcct881 gctggcrggt tacgatgact ttaattgtaa cgtttgggac tccatgagga cagaaagagc tggtgttctg gcgggccatg961 acaaccgcgt cagttgcctg ggtgttacag aagatggcat ggcagtggcc acaggctcat gggatagctt cctcaagatc1041 tggaactaag cttgtcatgc caccaccact ccagtatcaa catcagtatc ttcccaagga accaaattcc ctccaccgtc1121 cctgggactt gcacactgtt atatgaggga tttttcaatt gattccgact ccggttgtag cttatgaagt ctcgtttgtg1201 aatttgtcat gtaagtaact atctgacttg tccaataaag ctatttgtct ttacaaaaaa aaaaaaaaaa aa//pvGβ1基因的提取過程如下1)從新鮮對蝦中取出腦、觸角和眼，用Trizol試劑(Invitrogen)分別提取其中的總RNA，經反轉錄酶SuperScriptTMII Reverse Transcriptase(Invitrogen)反轉錄成cDNA。
2)根據已知物種G蛋白β亞基的保守序列設計簡并引物，GβF，5’-TGGGT(AGCT)ATG(AG)C(AC)TGTGCITA-3’，GβR，5’-AACTTG(AG)(ACT)I(GC)(AT)(AG)GCATCACA-3’，進行簡并PCR。
3)簡并PCR得到330bp的片斷產物，將這些片段經Klenow和T4 DNA聚合酶處理后克隆到pBluescript經Sma I酶切，然后CIP去磷酸化后的載體上，測序分析發(fā)現，該片斷序列與其他物種Gβ1具有非常高的保守性。
4)將這段序列設計特異的引物，用SMART RACE cDNA Amplification Kit試劑盒(Clontech，USA)做5’-和3’-RACE，5’-RACE引物為Gβ5’，5’-CCTGATGTGAATGTGTTCATGTTCG-3’；3’-RACE引物為Gβ3’，5’-GTCACACTGGTTACCTAAGTTGCTGT-3’。5’-和3’-RACE的PCR擴增產物分別克隆到pBluescript載體并測序，得到5’-和3’-兩端序列，從而得到全長序列。
5)利用Genedoc軟件對pvGβ1與其它物種Gβ1序列進行alignment分析，比較pvGβ1與其它物種Gβ1的同源性。
6)利用DNAstar軟件對Gβ1做進化樹分析，確定對蝦在進化中的地位。
對蝦是我國主要的海水養(yǎng)殖產品之一，對蝦的感覺系統(tǒng)發(fā)達，而且感覺系統(tǒng)在其簡單的生命活動中起著非常關鍵的作用，我們發(fā)現pvGβ1蛋白在對蝦的神經系統(tǒng)(腦)、感覺器官(眼、觸角)、攝食器官(鰓)、消化器官(腸道)和運動器官(游泳足)中的有大量分布也證實了G蛋白在對蝦生命活動中的重要性。本發(fā)明發(fā)現pvGβ1蛋白的結構和功能在進化上有極強的保守性，為G蛋白功能分子在進化上的同源性研究提供了分子與結構基礎。所以對對蝦pvGβ1蛋白的研究可能為對蝦的生命活動規(guī)律、對蝦抗病害和養(yǎng)殖的研究打下理論基礎。


圖1為對蝦G蛋白pvGβ1與其它物種Gβ1的alignment分析。
圖2為對Gβ1的進化樹分析。
圖3為Western blot檢測對蝦各器官組織的膜蛋白中pvGβ1的表達。
圖4為免疫共沉淀實驗電泳圖。
圖5為細胞內三磷酸肌醇IP3濃度測定結果示意圖。
圖6為細胞內游離鈣離子濃度測定結果示意圖。
具體實施例方式
下面通過實施例對本發(fā)明做進一步說明。
實施例1基因pvGβ1的克隆1.1從市場買來新鮮對蝦，鑒定為南美白對蝦(Penaeus vannamei)。從新鮮對蝦中取出腦、觸角和眼，用Trizol試劑(Invitrogen)分別提取其中的總RNA，經反轉錄酶SuperScriptTMII Reverse Transcriptase(Invitrogen)反轉錄成cDNA。
1.2根據已知物種G蛋白β亞基的保守序列設計簡并引物，GβF，5’-TGGGT(AGCT)ATG(AG)C(AC)TGTGCITA-3’，GβR，5’-AACTTG(AG)(ACT)I(GC)(AT)(AG)GCATCACA-3’，進行簡并PCR，PCR在25μl體系中進行，其中單鏈cDNA 1.5μl，兩端引物各20pmol，dNTP0.24mM，Taq聚合酶(Promega，USA)1.25U和相應緩沖液2.5μl。運行程序如下94℃退火3分鐘，接著94℃，30秒，42℃60秒，72℃60秒40個循環(huán)，最后72℃延伸3分鐘。
1.3簡并PCR得到330bp的片斷產物，將這些片段經Klenow和T4 DNA聚合酶處理后克隆到pBluescript經Sma I酶切，然后CIP去磷酸化后的載體上，測序分析發(fā)現，該片斷序列與其他物種Gβ1具有非常高的保守性。
1.4將這段序列設計特異的引物，用SMART RACE cDNA Amplification Kit試劑盒(Clontech，USA)做5’-和3’-RACE，5’-RACE引物為Gβ5’，5’-CCTGATGTGAATGTGTTCATGTTCG-3’；3’-RACE引物為Gβ3’，5’-GTCACACTGGTTACCTAAGTTGCTGT-3’。5’-和3’-RACE的PCR擴增產物分別克隆到pBluescript載體并測序，得到5’-和3’-兩端序列，從而得到全長序列。
1.5利用Genedoc軟件對pvGβ1與其它物種Gβ1序列進行alignment分析，比較pvGβ1與其它物種Gβ1的同源性。利用DNAstar軟件對Gβ1做進化樹分析，確定對蝦在進化中的地位。通過該序列與其它物種Gβ1序列進行alignment分析和進化樹分析(如圖1，2)，發(fā)現該基因與其它物種(從無脊椎動物線蟲、甲殼類龍蝦到脊椎動物小鼠和人類)都具有很高的同源性，而且具有其他物種保守的功能位點。與龍蝦具有最近的親緣關系。確定了該基因就是Gβ1，我們給它命名pvGβ1。
實施例2pvGβ1的功能鑒定2.1按文獻Sternweis(Sternweis，P.C.，Robishaw，J.D.，1984.J.Biol.Chem.295，13806-13813.)公開的方法提取對蝦各器官中膜蛋白，取10μg膜蛋白進行Western blot分析。發(fā)現pvGβ1在對蝦的各組織中都有少量分布，尤其在腦、眼、腸道、游泳足和觸角上有豐富的表達(圖3)。
2.2免疫共沉淀取適當濃度的HEK293T細胞鋪于60mm細胞培養(yǎng)板，在含10％小牛血清的DMEM(Gibco)培養(yǎng)液中培養(yǎng)，24小時后，用聚醚酰亞胺PEI(Polyethylenimine)將pCMV5-HA-pvGβ1分別與pCMV5，pCMV5-Flag-pvGαq和pCMV5-Flag-pvGαs各2ug，共轉染到細胞中。36小時后收細胞，按照Sternweis等人的方法提取細胞膜蛋白。將膜蛋白重懸于緩沖液(Hepes 30mM，MgCl21mM，EDTA 10mM，DTT 0.1mM，NaCl 150mM，GDP 0.1mM，Lubrol-PX 0.1％)中，取800μl濃度為4mg/ml的膜蛋白，冰上放置30分鐘，然后離心20分鐘后去掉不溶物，在上清溶液中加入抗Flag的抗體(Santa Cruz)1μg，Protein-A/G beads5μl，于4℃混和器上轉過夜，1000rpm 4℃離心收集沉淀產物，同上緩沖液洗三次，然后SDS-PAGE電泳，用抗HA的一抗進行western blot分析。發(fā)現在GDP存在的情況下pvGβ1能結合對蝦G蛋白pvGαs，也能結合對蝦pvGαq(圖4)，2.3細胞內游離鈣離子濃度的測定同上方法將pCMV5-HA-pvGβ12μg轉染到HEK293細胞，同時轉染空載體為對照。36小時后分散細胞，取6×104個細胞于Eppendorf管，500g離心3分鐘，用Hanks平衡鹽溶液HBSS洗細胞3次，于10μM的FLUO-3/AM(CalBiochem)中37℃孵育30分鐘，加HBSS(含1％FBS)400μl，繼續(xù)孵育30分鐘，再用HEPES緩沖液(HEPES 10mM，Na2HPO41mM，NaCl 137mM，KCl 5mM，CaCl21mM，MgCl20.5mM，glucose 5mM，BSA 0.1％，pH7.4)洗兩次，加180μl HEPES緩沖液，將細胞轉移到黑色96孔板，加入10mM的LiCl 20μl，30uM AlCl3與10mM NaF的混合物30μl，分別孵育5min、10min、20min后加入高氯酸終止反應。最后酶標儀分析，485nm激發(fā)，526nm吸收波長檢測。結果顯示在哺乳類細胞中過量表達pvGβ1，能使細胞內游離鈣離子和IP3濃度上升(圖5)。
2.4細胞內三磷酸肌醇濃度的測定細胞轉染、G蛋白激活同鈣離子濃度測定方法，測定IP3具體過程見Amersham公司產品號90-0037-01說明書。
權利要求
1.對蝦的G蛋白pvGβ1基因，其特征在于其基因名稱為pvGβ1(Penaeus vannameiheterotrimeric G protein beta 1 subunit)，Genbank序列號AY626793序列特征長度1272個堿基類型核酸鏈型單鏈幾何特征線性分子類型cDNA基因來源南美白對蝦Penaeus vannamei(Litopenaeus vannamei)蛋白編碼序列27-1049表達產物pVGβ1翻譯成蛋白的氨基酸序列340aaMNDLDSLRQEAERLKNTIRDARKNALDTTLVQATSGMDPIGRIQMRTRRTLRGHLAKIYAMHWGSDSRNLVSASQDGKLIVWDSYTTNKVHAIPLRSSWVMTCAYAPSGSYVACGGLDNICSIYNLKTREGNVRVSRELPGHTGYLSCCRFLDDNQIVTSSGDMTCALWDIETGQQCTQFTGHTGDVMSLSLSPNMNTFTSGACDASAKLWDIRDGMCRQTFPGHESDINAVTFFPNGHAFATGSDDATCRLFDIRADQELAMYSHDNIICGITSVAFSKSGRLLLAGYDDFNCNVWDSMRTERAGVLAGHDNRVSCLGVTEDGMAVATGSWDSFLKIWNcDNA序列描述1 attttttagt tttgtaattt ttagaaatga atgatttgga tagtttacga caagaagcag aaagactaaa gaacacaata81 cgagatgctc gcaaaaatgc acttgacacg accttggtcc aagccacatc cggcatggac cctattggcc gaattcagat161 gcgaaccagg agaacgctta gaggacactt agccaaaata tatgccatgc actgggggtc ggactctagg aatttggtat241 ctcatagtat gggacagtta cactacaaac aaggtgcatg cagcatctca agacggcaag ccattcccct tcggtccagc321 tgggtcatga cctgtgccta tgctccctcg ggcagttacg ttgcctgtgg tggccttgat aacatctgtt ctatatacaa401 cttaaagaca agagaaggca atgtgagagt gagtagggag ttgcctggtc acactggtta cctaagttgc tgtcggttcc481 tagacgacaa ccaaatagtc acaagctcgg gagacatgac ctgtgccctc tgggatatag agacgggtca gcagtgcacg561 caattcacag gccatacagg ggatgtgatg tccctgtccc tgtcaccgaa catgaacaca ttcacatcag gtgcctgtga641 tgcgtctgct aagctatggg acattcgtga tgggatgtgc cgccagacct tcccaggaca cgaatctgac attaatgcag721 ttacattctt ccccaatggg catgcatttg ccacgggatc agatgatgcc acatgccgcc tatttgacat tcgtgcagac801 caggagcttg ccatgtactc tcatgacaac attatttgtg gcatcacctc agtggcattc agcaagtctg gcagactcct881 gctggctggt tacgatgact ttaattgtaa cgtttgggac tccatgagga cagaaagagc tggtgttctg gcgggccatg961 acaaccgcgt cagttgcctg ggtgttacag aagatggcat ggcagtggcc acaggctcat gggatagctt cctcaagatc1041 tggaactaag cttgtcatgc caccaccact ccagtatcaa catcagtatc ttcccaagga accaaattcc ctccaccgtc1121 cctgggactt gcacactgtt atatgaggga tttttcaatt gattccgact ccggttgtag cttatgaagt ctcgtttgtg1201 aatttgtcat gtaagtaact atctgacttg tccaataaag ctatttgtct ttacaaaaaa aaaaaaaaaa aa//
2.對蝦的G蛋白pvGβ1基因的提取方法，其特征在于其步驟為1)從新鮮對蝦中取出腦、觸角和眼，用Trizol試劑(Invitrogen)分別提取其中的總RNA，經反轉錄酶SuperScriptTMIIReverse Transcriptase(Invitrogen)反轉錄成cDNA；2)根據已知物種G蛋白β亞基的保守序列設計簡并引物，GβF，5’-TGGGT(AGCT)ATG(AG)C(AC)TGTGCITA-3’，GβR，5’-AACTTG(AG)(ACT)I(GC)(AT)(AG)GCATCACA-3’，進行簡并PCR；3)簡并PCR得到330bp的片斷產物，將這些片段經Klenow和T4 DNA聚合酶處理后克隆到pBluescript經Sma I酶切，然后CIP去磷酸化后的載體上，測序；4)將這段序列設計特異的引物，用SMART RACE cDNA Amplification Kit試劑盒(Clontech，USA)做5’-和3’-RACE，5’-RACE引物為Gβ5’，5’-CCTGATGTGAATGTGTTCATGTTCG-3’；3’-RACE引物為Gβ3’，5’-GTCACACTGGTTACCTAAGTTGCTGT-3’，5’-和3’-RACE的PCR擴增產物分別克隆到pBluescript載體并測序，得到5’-和3’-兩端序列，從而得到全長序列；5)利用Genedoc軟件對pvGβ1與其它物種Gβ1序列進行alignment分析，比較pvGβ1與其它物種Gβ1的同源性；6)利用DNAstar軟件對Gβ1做進化樹分析，確定對蝦在進化中的地位。
全文摘要
對蝦的G蛋白pvGβ
文檔編號C12N15/10GK1769451SQ20041009201
公開日2006年5月10日 申請日期2004年11月3日 優(yōu)先權日2004年11月3日
發(fā)明者金利華, 林圣彩 申請人:廈門大學