專利名稱：N－酰氨基烷基肼亞氨酰胺的制作方法
背景技術：
本發(fā)明通常涉及由于蛋白質與葡萄糖和其它還原糖反應而導致的蛋白質老化，具體地說，涉及抑制非酶促糖基化蛋白的反應及通常綜合形成的高級糖基化作用(glycation)終產(chǎn)物和交聯(lián)物。
很久以來就已知葡萄糖與蛋白質之間的反應。最早的表現(xiàn)是由Maillard在1912年觀察到的在烹調(diào)食物時出現(xiàn)褐色素，他觀察到葡萄糖或其它還原糖與氨基酸反應，形成經(jīng)歷一系列脫水和重排而形成穩(wěn)定的褐色素的加合物。進一步研究表明，儲存和加熱的食物由于在葡萄糖和多肽鏈之間反應而導致發(fā)生非酶促棕黃反應，并且結果蛋白質產(chǎn)生交聯(lián)，相應地顯示出降低的生物利用率。
該還原糖和食物蛋白之間的反應被發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)具有其類似物。因此，已表明葡萄糖和蛋白質上的游離氨基之間形成被稱為Amadori產(chǎn)物的穩(wěn)定的1-脫氧ketosyl加合物的非酶促反應在血紅蛋白中發(fā)生，其中通過與葡萄糖的反應的血紅蛋白的β鏈的氨基末端的重排形成稱為血紅蛋白A1c的加合物。還在各種其它身體蛋白中發(fā)現(xiàn)發(fā)生該反應，例如晶狀體蛋白，膠原蛋白和神經(jīng)蛋白。參見Bucala等“高級糖基化作用；糖尿病和衰老的化學，生物和本質”藥物學進展，23卷，pp.1-34，Academic Press(1992)。
而且，光譜和熒光特性類似于后階段Maillard產(chǎn)物的褐色素也在體內(nèi)觀察到與一些長效蛋白相關，例如來自老年個體的晶狀體蛋白和膠原蛋白。在年齡20-90歲的人的硬腦膜中觀察到褐色素與年齡相關的線性增加。有趣的是，膠原蛋白的老化可在體外通過葡萄糖誘導的交聯(lián)來模擬；還注意到膠原蛋白對其它蛋白的捕獲和加合物的形成被認為通過交聯(lián)反應而發(fā)生，并被認為是觀察到的在腎基膜中的白蛋白和抗體積累的原因。
在美國專利4758583中，公開了通過與靶蛋白和葡萄糖之間的最初反應產(chǎn)生的早期糖基化產(chǎn)物反應來抑制高級糖基化終產(chǎn)物的形成的方法和相關制劑。相應地，當抑制劑和早期糖基化產(chǎn)物之間的反應出現(xiàn)阻斷糖基化蛋白與其它蛋白物質形成交聯(lián)的后階段產(chǎn)物的后續(xù)反應時，則認為產(chǎn)生了抑制作用。被確定作為抑制劑的一個活性劑為氨基胍，進一步試驗的結果已證明了它在這方面的功效。
雖然用氨基胍和類似化合物所取得的成功是有希望的，仍然存在鑒定和開發(fā)其它的拓寬可行性和可能的拓寬潛在活性范圍及其診斷和治療功效范圍的抑制劑的需要。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，公開了用于抑制蛋白高級糖基化(蛋白老化)的方法和組合物。具體地，該組合物包含用于抑制由于高級糖基化(glycation)終產(chǎn)物形成而產(chǎn)生的非酶促交聯(lián)的活性劑物質。該活性劑物可選自能與來自葡萄糖與蛋白反應的早期糖基化產(chǎn)物反應并防止進一步反應的那些物質。通過本發(fā)明的方法和組合物還可防止由存在于體內(nèi)或食物中的其它還原糖，包括核糖，半乳糖和果糖導致的交聯(lián)。
這些活性劑包括具有下面結構式的N-?；被榛聛啺滨０?
其中alk為具有2-8個碳原子的直鏈或支鏈亞烷基，R為含有1-6碳原子的低級烷基；和它們生物學或藥物學可接受的酸加成鹽；和其混合物，及其載體。
用于本發(fā)明的化合物和它們的組合物看來與早期糖基化產(chǎn)物反應，從而防止相同的導致蛋白交聯(lián)的來自后面形成的高級糖基化終產(chǎn)物的相同反應，從而防止蛋白老化。
本發(fā)明還涉及通過將早期糖基化產(chǎn)物階段的初始糖基化蛋白與一定量的一種或多種本發(fā)明的活性劑接觸來抑制蛋白老化的方法，或含有它們的組合物。在本方法用于工業(yè)應用的情況時，通過在為蛋白提取物時，則加入到它們的混合物中，或通過應用或加入到含有該蛋白或多種蛋白的食物中，可將一種或多種物質用于所討論的蛋白中，這些方法均能防止過早老化和特定食物的腐敗。
抑制高級糖基化終產(chǎn)物形成的能力使得它在蛋白老化是一個嚴重損害的所有應用中具有顯著的意義。因此，在食品技術領域，通過使一些有勉強穩(wěn)定性的食品不易腐敗而延緩食物腐敗將具有顯著的經(jīng)濟和社會效益，并從而更適宜于消費者。減少腐敗將降低試驗、去除、替代的費用，食物增加的利用率可有助于穩(wěn)定它們在市場中的價格。類似地，在蛋白的易腐敗性是一個問題時的其它工業(yè)應用中，本發(fā)明物質的混合物在包含這些蛋白的組合物中將有利于它們延長的可用期。目前使用的已知導致包括動物變態(tài)反應和氣喘的食物防腐劑和變色預防劑如二氧化硫，可被例如本文描述的那些化合物替代。
因為Maillard過程嚴重影響身體中的重要蛋白質物質，其中有膠原蛋白、彈性蛋白、晶狀體蛋白和腎小球基膜，因此本方法具有特殊的治療用途。這些蛋白隨著年齡(因此使用術語“蛋白老化”)和作為糖尿病后果而變質。因此，延緩或基本抑制高級糖基化終產(chǎn)物的能力具有治療糖尿病的希望，當然還改善動物的生活質量，也許還有壽命。
因為它們通過具有抗噬菌斑特性的陽離子抗菌劑、如洗必太防止牙齒著色，所以這些物質還可用于個人美容和衛(wèi)生學領域。
因此，本發(fā)明的一個主要目的是提供一種通過相應地抑制高級糖基化終產(chǎn)物的形成而抑制作為蛋白與葡萄糖和其它活性糖反應的最終結果產(chǎn)生的廣泛的蛋白交聯(lián)的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種如前所述的方法，其特征在于，與確定為早期糖基化產(chǎn)物的初始糖基化蛋白反應。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種如前所述的方法，該方法防止所述早期糖基化產(chǎn)物的重排和交聯(lián)形成所述高級糖基化終產(chǎn)物。
本發(fā)明的另一個目的是提供能在前述方法中參與與所述早期糖基化產(chǎn)物反應的活性劑。
本發(fā)明的另一個目的是通過利用前述方法和活性劑來提供治療蛋白老化的有害后果的治療方法。
本發(fā)明的另一個目的是通過利用前述方法和活性劑來提供一種抑制牙齒著色的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供包含藥物組合物的組合物，它們均包含本發(fā)明的活性劑。
本發(fā)明的另一個目的是提供新的化合物，以及它們的制備方法，在本發(fā)明方法和組合物中的應用。
考慮后面的描述，其它目的和優(yōu)點對于本領域技術人員是顯而易見的。優(yōu)選實例的詳細說明根據(jù)本發(fā)明，已開發(fā)出物質和包括含有所述物質的藥物組合物的組合物及相關方法，它們被認為抑制存在于動物和植物材料中的許多靶蛋白中的高級糖基化終產(chǎn)物的形成。具體地說，本發(fā)明涉及一種組合物，它可含有一種或多種包含具有下面通式的N-?；被榛聛啺滨０返奈镔|
其中alk為含有2-8個碳原子的直鏈或支鏈亞烷基，R為含有1-6個碳原子的低級烷基；和其生物學或藥物上可接受的酸加成鹽；和其混合物，及其載體。
上面涉及的低級烷基優(yōu)選含有1-6個碳原子，包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基，和其相應的支鏈異構體。這些基團任選被一個或多個鹵素、羥基、氨基和低級烷基氨基取代。
本文涉及的亞烷基含有2-8個碳原子，同樣可為直鏈或支鏈鏈，具體為1，2-亞乙基、亞丙基、亞丁基、亞戊基、亞己基、亞庚基、亞辛基，和其相應的支鏈異構體。
上式中的鹵原子可為氟、氯、溴或碘。低級烷氧基含有1-6個，優(yōu)選1-3個碳原子，具體為甲氧基、乙氧基、正丁氧基、異丁氧基等。
對于本發(fā)明的目的而言，等同于式(I)化合物的還有生物學和藥物學可接受的酸加成鹽。這些酸加成鹽可來自各種有機和無機酸，例如硫酸、磷酸、鹽酸、氫溴酸、氨基磺酸、檸檬酸、乳酸、馬來酸、琥珀酸、酒石酸、肉桂酸、乙酸、苯甲酸、葡糖酸、抗壞血酸、甲磺酸和相關的酸。
在式I所包括的化合物中，一些取代基是優(yōu)選的。例如，其中alk為1，2-亞乙基，R為甲基的化合物是優(yōu)選的。具體地，為N-(2-乙酰氨基乙基)肼亞氨酰胺鹽酸鹽或氫溴酸鹽的新化合物顯示出尤其可用于治療哺乳動物(特別是人類)患者的活性的特性。
本發(fā)明的代表化合物包括N-(2-乙酰氨基乙基)肼亞氨酰氨氫溴酸鹽；N-(2-乙酰氨基乙基)肼亞氨酰氨鹽酸鹽；N-(3-乙酰氨基丙基)肼亞氨酰氨氫溴酸鹽；和N-(4-乙酰氨基丁基)肼亞氨酰氨氫溴酸鹽。
上述化合物能抑制靶蛋白上的高級糖基化終產(chǎn)物的形成。蛋白交聯(lián)形成高級糖基化終產(chǎn)物導致其它蛋白的捕獲，并導致在體內(nèi)產(chǎn)生如皮膚彈性降低和產(chǎn)生皺紋、某些腎疾病、動脈粥樣硬化、骨關節(jié)炎的病癥。類似地，經(jīng)歷非酶促褐變的植物材料產(chǎn)生變質，在為食物的情況下，變得腐敗或變硬，從而不適宜食用。因此，根據(jù)本發(fā)明采用的化合物抑制這個后階段的Maillard作用并參與上述有害的變化中。
本發(fā)明的原理是使用阻斷后糖基化步驟，即形成熒光發(fā)色團的活性劑，其中該發(fā)色團的存在與糖尿病和衰老的有害后果相關，并導致它們的產(chǎn)生。理想的活性劑將防止發(fā)色團的形成及蛋白與蛋白的相關交聯(lián)和在其它蛋白上捕獲蛋白，例如在動脈和腎中發(fā)生的。
本發(fā)明化合物被認為與其發(fā)生反應的早期糖基化產(chǎn)物的化學性質可能是變化的，相應地，本文采用的術語“早期糖基化產(chǎn)物”指包括在此范圍的任何和所有這些變化。例如，已推測了參與形成高級糖基化終產(chǎn)物的并可通過與本發(fā)明化合物反應被阻斷的帶羰基部分的早期糖基化產(chǎn)物。在一個實施方案中，預測早期糖基化產(chǎn)物可能包含可縮合形成高級糖基化終產(chǎn)物的Amadori產(chǎn)物或其其它縮合，脫水和/或重排產(chǎn)物的活性羰基部分。在另一個方案中，包含一個或多個羰基部分(例如乙醇醛，甘油醛或3-脫氧葡糖醛酮)的活性羰基化合物可從Amadori或其它早期糖基化終產(chǎn)物的裂解形成，并通過與胺或Amadori產(chǎn)物的后續(xù)反應可形成含羰基的高級糖基化產(chǎn)物，例如烷基甲?；腔量?。
一些研究者研究了高級糖基化產(chǎn)物的形成的機理。Eble等的體外研究(1983)“非酶促糖基化和依賴葡萄糖的蛋白交聯(lián)”，生物化學雜志，2589406-9412，涉及在不存在葡萄糖時，糖基化蛋白與非糖基化蛋白的交聯(lián)。Eble等試圖闡明Maillard反應的機理，并相應地將RNA酶的初始糖基化作為模型系統(tǒng)，接著在變化的條件下進行測定。在一個方面，分離糖基化的蛋白物質，并放置在不含葡萄糖的環(huán)境中，從而觀察以確定交聯(lián)程度。
Eble等因此觀察到不僅與糖基化蛋白，而且與非糖基化蛋白繼續(xù)發(fā)生交聯(lián)。Eble等觀察到的一個現(xiàn)象是，糖基化蛋白與蛋白物質之間的反應看來發(fā)生在蛋白鏈的賴氨酸部位。在該文中由Eble等進行的證實試驗證明，游離的賴氨酸與RNA酶上的賴氨酸競爭與糖基化蛋白的結合。因此，從這些數(shù)據(jù)可推出賴氨酸可作為高級糖基化的抑制劑；然而，產(chǎn)生它的這一結論和導致它的應被考慮在由Eble等制備和考察的相對有限的模型系統(tǒng)的內(nèi)容中。顯然，Eble等沒有認識到對于體外和體內(nèi)的蛋白的高級糖基化的抑制，是否在作為本發(fā)明基礎的發(fā)現(xiàn)中存在這一假設。
Eble等的實驗沒有提出在始終存在葡萄糖時，體內(nèi)形成高級糖基化終產(chǎn)物中的活性裂解產(chǎn)物機理或任何其它機理。事實上，其它研究者支持用于解釋體內(nèi)形成高級糖基化終產(chǎn)物的這一機理(參見如Hayase等，生物化學雜志，263，pp.3758-3764(1989)；Sell和Monnier，生物化學雜志，264，pp.21597-21602(1989)Oimomi等農(nóng)業(yè)生物化學，53(6)1727-1728(1989)；和糖尿病研究和臨床實踐，6311-313(1989))。因此，在Eble模型系統(tǒng)中使用賴氨酸作為抑制劑對本發(fā)明化合物在體內(nèi)在存在葡萄糖時抑制高級糖基化產(chǎn)物形成和改善糖尿病的并發(fā)癥和衰老中的應用沒有影響。
可用于本發(fā)明的組合物包括或包含能與早期糖基化產(chǎn)物的活性羰基中間體反應的活性劑。適宜的活性劑為本發(fā)明的式I化合物。
本發(fā)明同樣涉及抑制高級糖基化終產(chǎn)物的形成的方法，該方法包括將靶蛋白與本發(fā)明的組合物接觸。在靶蛋白包含在植物或動物來源的食物中的情況下，可通過各種常規(guī)方法將包含這些活性劑的組合物應用到這些食物中。
在食品工業(yè)中，許多年前就已發(fā)現(xiàn)亞硫酸鹽抑制Maillard反應，并通常用于加工和儲存的食物中。然而，最近食物中的亞硫酸鹽參與氣喘中的嚴重、甚至致命的反應。因此，已禁止用亞硫酸鹽處理新鮮水果和蔬菜。變態(tài)反應的機理不清楚。因此，本發(fā)明的組合物和活性劑提供在用這種方法處理食物中的亞硫酸鹽的非毒性替代物。
因為從對本發(fā)明情況的討論中很清楚，所以本方法和組合物具有抑制動物和植物中的關鍵蛋白的老化的希望，作為其結果伴隨著具有經(jīng)濟和醫(yī)學效益。在為食物的情況下，施用本發(fā)明的組合物具有延緩食物腐敗，從而增加食物的存儲壽命和對于消費者的更大的利用率的希望。用非毒性、生物相容的化合物替代目前使用的防腐劑，例如已知導致人變態(tài)反應和氣喘的二氧化硫是本發(fā)明的另一個優(yōu)點。
本發(fā)明的治療實質涉及抑制如前所述的在由高級糖基化和交聯(lián)導致的關鍵蛋白的老化中證實的老化過程。因此，通過本發(fā)明的實驗，在壽命和機能方面對身體蛋白，尤其是結構性身體蛋白，例如膠原蛋白，彈性蛋白，晶狀體蛋白，神經(jīng)蛋白，腎小球基膜均有利。因此，本發(fā)明降低涉及通過交聯(lián)靶蛋白捕獲蛋白的疾病的發(fā)病率，例如視網(wǎng)膜病，白內(nèi)障，糖尿病性腎疾病，腎小球硬化病，外周血管疾病，閉塞性動脈硬化，外周神經(jīng)病，中風，高血壓，動脈粥樣硬化，骨關節(jié)炎，心房周強直，皮膚彈性喪失和產(chǎn)生皺紋，關節(jié)僵硬，腎小球性腎炎等。同樣，所有這些疾病在受糖尿病糖尿癥折磨的病人中得到證實。因此，本治療方法涉及治療老年病人或患有一種上述疾病的患者中的所提到的疾病。
通過形成高級糖基化產(chǎn)物的蛋白交聯(lián)可降低結構性蛋白，例如，血管壁中的膠原蛋白的穩(wěn)定性，還可捕獲血清蛋白，例如將脂蛋白捕獲至膠原蛋白。而且，這可導致內(nèi)皮增加的滲透性，從而共價捕獲內(nèi)皮下基質中外滲的血漿蛋白，降低血漿和基質蛋白對酶的生理性降解的敏感性。由于這些原因，由慢性高血糖誘導的糖尿病性血管的進行性閉塞被假設來自葡萄糖來源的交聯(lián)的過量形成而產(chǎn)生。這些糖尿病性微血管的變化和微血管的閉塞可使用本發(fā)明的組合物和方法通過化學抑制高級糖基化產(chǎn)物的形成而被有效地防止。
研究表明，靶器官中的慢性糖尿病損傷的產(chǎn)生主要與高血糖相關，這樣嚴密的代謝控制將延遲或甚至防止末端器官的損傷。參見Nicholls等，實驗室研究，60，No.4，p.486(1989)，它討論了胰島同系移植物和氨基胍在大鼠糖尿病性腎病中的作用。這些研究進一步證明了在糖尿病大鼠中，氨基胍減少主動脈壁蛋白的交聯(lián)，并證實了Brownlee等對這個糖尿病并發(fā)癥的另外的靶器官的早期研究，科學，232，pp.1629-1632(1986)。而且，另外的研究表明了在腎中由氨基胍捕獲免疫球蛋白的減少(Brownlee等，糖尿病，35，增刊，1，p.42A(1986))。
Brownlee等，1988，同前，提供了關于在具糖尿病腎病標志的腎的形態(tài)學變化方面，在鏈脲霉素-糖尿病大鼠模型中使用氨基胍干擾糖尿病腎病的發(fā)展的進一步的證據(jù)。這些研究者報道氨基胍防止作為糖尿病腎病的主要結構異常特征的腎小球基膜厚度的增加。
這些數(shù)據(jù)一起有力地證明，通過本發(fā)明的教導，對高級糖基化終產(chǎn)物(AGEs)形成的抑制可在晚期及早期防止由于糖尿病造成的結構損傷以及在由AGEs形成而導致的衰老過程中的變化。
導致更加僵硬的細胞膜的糖尿病誘導的紅細胞變形的變化是交聯(lián)的另一個證明，并且在體內(nèi)氨基胍已表明能防止它。在這些研究中，使用誘導患長期糖尿病的新西蘭白兔來研究試驗化合物對紅細胞(RBC)變形(df)的影響。通過管飼法以100mg/kg的比例對糖尿病白兔施用試驗化合物。
糖尿病的另一個后果是導致通常與慢性糖尿病相關的減少的骨的形成的高血糖誘導的基質骨分化。在動物模型中，糖尿病降低基質誘導的骨分化70％。
雖然為一種有希望的治療劑，但氨基胍顯示出在某些情況下，在一些病人群體中可能抑制其治療有用性的其它一些藥物學活性。因此，繼續(xù)研究一種高級糖基化終產(chǎn)物形成的抑制劑，它對該活性具有選擇性，而對二氨基氧化酶(DAO)和可誘導形式的氧化氮合成酶沒有影響。本發(fā)明鑒定出新化合物N-(2-乙酰氨基乙基)肼亞氨酰胺和其各種鹽，尤其是作為唯一的高級糖基化終產(chǎn)物形成的選擇性抑制劑的鹽酸鹽，而對二氨基氧化酶或氧化氮的形成沒有明顯影響。因此，本發(fā)明提供抑制高級糖基化終產(chǎn)物的形成，而不伴隨性抑制二氨基氧化酶和氧化氮形成的方法和組合物，該組合物包含N-(2-乙酰氨基乙基)肼亞氨酰氨和其各種鹽形式。
在本發(fā)明組合物用于體內(nèi)或治療目的的情況下，可注意到本文使用的化合物或制劑為生物相容的?？捎弥委熡行Я康谋景l(fā)明的制劑或化合物制備藥物組合物，該組合物可包括選自已知用于此目的為已知物質的藥物學可接受的載體。取決于施用方法，可將該組合物制備成各種形式。而且，可使用式I化合物的各種藥物學可接受加成鹽。
在通過靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)或腹膜內(nèi)注射給藥的情況下，使用液體形式。適宜時，可制備固體劑型，例如片劑，膠囊劑，或液體劑型，例如溶液劑和懸浮劑等用于口服給藥。對于皮膚或眼睛的表面或皮膚施用，可用制劑在適宜賦形劑，例如水，乙醇，丙二醇中配制溶液劑，洗劑或軟膏劑，它們可能包含一種載體以有助于滲透到皮膚或眼睛中。例如表面制劑可包含高達約10％的式I化合物。也考慮對其它身體組織給藥的其它適宜形式。
在本發(fā)明具有治療用途的情況下，對打算治療的動物宿主可給藥適宜藥物形式的一定量的一種或多種活性劑?？赏ㄟ^已知方法完成給藥，例如口服，局部和胃腸外方法，例如真皮內(nèi)，皮下，靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)注射，以及通過其它常規(guī)方法?？梢匝娱L的時間期限以例如多達約30mg/kg的劑量進行制劑的給藥。
如前面所提到的，本發(fā)明還涉及一種抑制由于口腔中的非酶促褐變導致的牙齒著色的方法，包括對需要這種治療的個體給藥抑制高級糖基化終產(chǎn)物形成的有效量的包含結構式I活性劑的組合物。
在口腔中發(fā)生的非酶促褐變反應導致牙齒的著色。目前使用的抗斑劑加速該非酶促褐變反應和進一步的牙齒的著色。最近，一類具有明顯抗噬菌斑特性的陽離子抗菌劑被配制成用于日常用來殺死口腔細菌的漱口液。這些陽離子制劑包含如雙胍啶、氯化十六烷基吡啶、葡萄糖酸洗必太、雙辛氫啶和潔爾滅。
由洗必太和其它抗斑劑造成的牙齒染色顯然來自Maillard反應的增強。Nordbo，牙齒研究雜志，58，p.1429(1979)報道在體外洗必太和潔爾滅催化褐變反應。加入到患有糖衍生物和氨基源的混合物中的洗必太由于Maillard反應導致增加的顏色形成。還已知使用洗必太導致增加的牙齒表面。Nordbo提出洗必太以兩種方式導致牙齒染色第一，通過增加包含多個氨基的表面的形成，第二，通過催化導致著色產(chǎn)物的Maillard反應。
根據(jù)本方法，將式I混合物配制成適宜于用于口腔的組合物。特別適宜的制劑為摻入了活性劑的漱口液和牙膏。
在本發(fā)明的實踐中，以漱口液和牙膏制造中熟知的量和組合使用的非毒性、藥學上可接受的載體來完成常規(guī)的制造方法。
式I的活性劑以抑制高級糖基化終產(chǎn)物形成的有效量配制在組合物中。當然，它的量隨使用的特定活性劑及特定的劑量形式而變化，但通常為特定制劑重量的0.01％-1.0％的范圍。
式I包含的一些化合物為可通過本領域熟知的化學合成的改進來制備的新的化合物?？筛鶕?jù)Nakashima等歐洲醫(yī)學化學雜志，22，553-558(1987)中描述的方法來自制備式I化合物。該參考文獻在第554頁描述了下面兩個式I化合物的鹽酸鹽的制備N-(3-乙酰氨基丙基)肼亞氨酰胺(也稱為1-氨基-3-乙酰氨基丙基胍；)和N-(4-乙酰氨基丁基)肼亞氨酰胺(也稱為1-氨基-3-乙酰氨基丁基胍)。
本發(fā)明化合物的一種合成方法示于下路線圖中。
路線I
在該反應路線圖中，將溶解在甲醇或其它適宜極性溶劑中的氨基硫脲與乙基溴反應，加熱至回流溫度約2-12小時。冷卻至室溫，向甲醇溶液中加入叔丁基甲基醚，產(chǎn)生S-乙基氨基硫脲氫溴酸鹽。
接著，向S-乙基氨基硫脲氫溴酸鹽中加入適當?shù)氖絀I的N-?；鶃喭榛?。在加熱至回流溫度約2-12小時后，冷卻，分離所需的式I的N-?；被榛聛啺滨０罚绻枰?，從例如異丙醇和叔丁基甲基醚的混合物的適宜的溶劑中通過重結晶純化。
通常從相應的氫溴酸鹽通過用強堿，如氫氧化鈉中和氫溴酸鹽，接著用強酸處理以產(chǎn)生相應的鹽來制備式I混合物的各種酸加成鹽。另外，可將氫溴酸鹽溶于甲醇中，并用氣態(tài)氯化氫處理以產(chǎn)生相應的鹽酸鹽。
制備本發(fā)明化合物的另一個方法包括如下面路線圖II所示的它們的制備路線II
在該反應路線圖中，將氯化氰與適當?shù)氖絀I的N-?；鶃喭榛贩磻援a(chǎn)生未分離的中間體的混合物。接著將示于上面反應路線圖II方括號中的這些未分離的中間體在極性溶劑中與無水肼一起回流約1-約15小時。
適宜的極性溶劑包括醇，例如2-丙醇和乙醇。肼加入步驟的反應溫度當然取決于選擇的特定的溶劑的性質并隨之而改變。
下面實施例為對本發(fā)明的說明。實施例1A. S-乙基氨基硫脲溴化氫將氨基硫脲(218.4g，2.4mol)溶解在乙醇(1L)中。向混合物中加入乙基溴(306.6g，2.8mol)，將混合物緩慢加熱回流。在反應進行過程中，在7小時內(nèi)將所有固體溶解在溶液中。將溶液回流兩個多小時，冷卻至環(huán)境溫度。將叔丁基甲基醚(700ml)加入到乙醇溶液中，放置在冰箱中過夜。在兩次收獲中收集白色晶體(418g，87％)；mp 123-5℃.。1H-NMR(D2O)3.18(2H，dd)，1.39(3H，t)。13C-NMR(D2O)169.6，25.7，13.8ppm。B. N-(2-乙酰氨基乙基)肼亞氨酰胺溴化氫向S-乙基氨基硫脲溴化氫(100g，0.5mol)的750ml乙醇溶液中加入N-乙酰-亞乙基二胺(51g，0.5mol)。在與四個漂白捕獲器相連的系統(tǒng)中將混合物回流8小時。在冷卻混合物時，形成白色晶體并過濾。在與漂白捕獲器相連的真空系統(tǒng)下，將溶液蒸發(fā)至紅色油狀物。在2-丙醇/tBuOMe中油狀物緩慢結晶，在三次收獲中產(chǎn)生白色結晶的標題化合物(39.5g，33％)；mp 127-8℃.。1H-NMR(D2O)3.36(4H，t)，2.00(3H，s)。13C-NMR(D2O)175.0，158.4，40.6，38.5，22.3ppm。實施例2N-(2-乙酰氨基乙基)肼亞氨酰胺鹽酸鹽將N-(2-乙酰氨基乙基)肼亞氨酰胺鹽酸鹽(5g，20.8mmol)溶解在50ml水中。將AmberliteIRA-400(OH)(50g，來自Aldrich)上樣至具有多孔玻璃的柱上(2.5cm直徑×45cm)。將樹脂用200ml1NNaOH洗脫，接著用蒸餾水洗脫直至pH7。將溴化氫水溶液上樣至樹脂上并一滴滴洗脫。洗脫掉更多的水直至洗脫液為中性。混合茚三酮試驗為陽性的所有含水級分，加入10ml6NHCl。真空除去水，產(chǎn)生無色油狀物，接著從2-丙醇重結晶，產(chǎn)生3.82g(94％)；mp 127-8℃。1H-NMR(D2O)3.36(4H，dt)，1.99(3H，s)。13C-NMR(D2O)174.9，158.2，40.5，38.4，22.0ppm。實施例3N-(2-乙酰氨基乙基)肼亞氨酰胺鹽酸鹽將氫溴酸鹽N-(2-乙酰氨基乙基)肼亞氨酰胺氫溴酸鹽(5g，20.8mmol)溶解在100ml甲醇中。冰浴中向攪拌的溶液中通入HCl氣15分鐘。通入HCl氣后，室溫下，將溶液攪拌2小時，加入200mltBuOMe。24小時后，在燒瓶的底部分離出油狀物。從油狀物中傾析出液體。從2-丙醇/tBuOMe中結晶出油狀物，產(chǎn)生3.3g(82％)的白色晶體，該晶體與來自方法A的晶體具有相同的物理性質。實施例4在基本上如實施例1的段落A和B描述的反應過程中，采用適宜的起始物質來制備下面的式I化合物N-(3-乙酰氨基丙基)肼亞氨酰胺氫溴酸鹽；和N-(4-乙酰氨基丁基)肼亞氨酰胺氫溴酸鹽。實施例5N-(2-乙酰氨基乙基)肼亞氨酰胺鹽酸鹽下面過程必須在通風良好的通風櫥中進行。將早已稱重的2L三頸燒瓶的出口與6NKOH阱相連，通過浸沒在干冰丙酮浴中將整個燒瓶冷卻至-70℃。從其重量變化在天平上監(jiān)測的演示瓶對燒瓶吹掃氯化氰氣。收集62g氯化氰(1mol)。向液化的氣體中加入冷的2-丙醇(500ml)和機械攪拌裝置。劇烈攪拌下，滴加N-乙酰亞乙基二胺(102g，1mol)的2-丙醇(500ml)溶液，使內(nèi)部溫度不超過5℃。加入完成后，5℃下，將化合物攪拌1小時，緩慢加入無水肼(28.2ml，0.9mol)。5℃下，將混合物攪拌1小時，室溫下，再攪拌1小時，接著進一步回流15小時。在回流的最后1小時中，通過蒸餾除去溶劑將反應混合物的體積減少一半。冷卻時，緩慢形成白色立方體晶體。接著收集晶體，干燥產(chǎn)生標題化合物。實施例6下面方法用來評價本發(fā)明化合物抑制糖基化牛血清白蛋白(AGE-BSA)與大鼠尾腱膠原蛋白覆蓋的96孔平板交聯(lián)的能力。
通過37℃下，將200mg/ml濃度的BSA與200mM葡萄糖的0.4M磷酸鈉緩沖液，pH7.4一起保溫12周制備AGE-BSA。接著將糖基化的BSA用磷酸鹽緩沖液(PAS)充分透析48小時，其中另外更換5次緩沖液。首先用300ulsuperbloc封閉緩沖液(Pierce#37515X)將大鼠尾腱膠原蛋白覆蓋的平板封閉1小時。通過使用NUNC-多探針或DynatechELISA-平板洗滌機，用PAS-Tween20溶液(0.05％Tween 20)就平板洗滌兩次，從孔中除去封閉溶液。通過37℃下，加入50ul各種稀釋在PAS或試驗化合物中的AGE-BSA 4小時，使用或不使用所需濃度的溶解在PAS緩沖液，pH7.4中的試驗化合物來進行AGE-BSA(取決于AGE-BSA的分批，為1-10μg/孔)與大鼠尾腱膠原蛋白覆蓋平板的交聯(lián)。將含有或不含有試驗化合物的未褐變BSA的PAS緩沖液加入到各孔中作為對照。通過用PAS-Tween緩沖液將各孔洗滌三次除去未交聯(lián)的AGE-BSA。用抗AGE-RNase的多克隆抗體定量與尾腱膠原蛋白覆蓋平板交聯(lián)的AGE-BSA。在1小時保溫后，通過用PAS-Tween洗滌4次除去AGE抗體。
接著通過加入辣根過氧化物酶結合的二抗，例如羊抗兔免疫球蛋白，并保溫30分鐘來檢測結合的AGE抗體。加入底物2，2-連氮基-二(3-乙基苯噻唑啉磺酸)(ABTS發(fā)色團)(Zymed#00-2011)。再讓反應進行15分鐘，410nm下，在Dynatech平板計數(shù)器讀取吸光度。
如下計算各個試驗化合物的抑制百分數(shù)％。
抑制百分數(shù)＝{[光密度(不含化合物)-光密度(含化合物)]/光密度(不含化合物)}100％。
10mM各種試驗化合物的IC50相對抑制如下試驗化合物IC50N-(2-乙酰氨基乙基)肼亞氨酰胺氫溴酸2.6mMN-(2-乙酰氨基乙基)肼亞氨酰胺鹽酸鹽3.6mMN-(3-乙酰氨基丙基)肼亞氨酰胺氫溴酸12.2mM氨基胍鹽酸鹽 12.0mM上面的試驗表明，式I化合物為更有效的高級糖基化形成的抑制劑，這樣這種類型的藥物治療在減少與蛋白高級糖基化和蛋白和其他大分子之間形成交聯(lián)相關的疾病中具有好處。可用藥物治療來防止在糖尿病和衰老過程中發(fā)生的導致例如腎損傷和對腱、韌帶和其它關節(jié)的血管外損傷等并發(fā)癥的蛋白的增加的捕獲和交聯(lián)。實施例7用下面方法來評價在存在核糖時，本發(fā)明化合物抑制N-乙酰基甘氨酰賴氨酸甲酯的交聯(lián)的能力。材料N-乙?；拾滨Ｙ嚢彼峒柞?在下式中的DP)核糖(在下式中的R)試驗化合物(在下式中的C)試劑0.5M磷酸鈉緩沖液pH7.4N-乙?；拾滨Ｙ嚢彼峒柞サ?.5M磷酸鈉緩沖液，pH7.4核糖800mM如果需要，將化合物溶解在上述緩沖液中，pH調(diào)至7.4步驟如下制備含有混合物80mg/ml N-乙酰基甘氨酰賴氨酸甲酯/緩沖液 0.1 0.1 -核糖 0.1 0.1 0.1試驗化合物-0.1 0.1緩沖液0.2 0.1 0.2并在37℃下保溫16-24小時。在保溫期間的最后，使用350nm波長的激發(fā)光和400nm波長的發(fā)射光讀取熒光。根據(jù)下式，從在存在試驗化合物時熒光的降低來計算交聯(lián)的抑制抑制(％)＝100×[DPRC熒光-RC熒光]/DPR熒光各種試驗化合物的抑制如下試驗化合物IC50mMN-(2-乙酰氨基乙基)肼亞氨酰胺氫溴酸11.46N-(2-乙酰氨基乙基)肼亞氨酰胺鹽酸鹽10.64N-(3-乙酰氨基乙基)肼亞氨酰胺鹽酸鹽＞10.0氨基胍鹽酸鹽 10.0上面的實驗表明，式I化合物擁有抑制高級糖基化形成的活性，這種類型的藥物治療減少與蛋白高級糖基化和蛋白和其他大分子之間形成交聯(lián)相關的病理學。藥物治療可被用來防止在糖尿病和衰老過程中發(fā)生的蛋白的增加的捕獲和交聯(lián)，它們導致例如腎損傷和對腱、韌帶和其它關節(jié)的血管外損傷等并發(fā)癥。實施例8為了確定試驗化合物對二氨基氧化酶的作用，使用下面的分析方法。該分析法是基于胺底物轉化成接著與試劑含有的相應的醛產(chǎn)物的比色動力酶分析法。用于該方法中的酶和底物的濃度確保反應為飽和環(huán)境，并在室溫下與保溫時間為線性關系。材料磷酸鈉緩沖液，0.1M，pH＝7.4腐胺(Sigma)，0.03M(4.8mg/ml)二氨基氧化酶(Sigma)，3U/ml(50mg/ml)O-氨基苯甲醛(Sigma)，(0.5mg/ml)96孔平板，平板計數(shù)器w/450nm的吸收性濾步驟室溫下進行反應。除開磷酸鈉緩沖液可在4℃下儲存1個月外，所有的反應試劑和試驗化合物的稀釋液均應用緩沖液新配制。一旦配制，溶液可在室溫下保存。腐胺和二胺氧化酶很易溶于緩沖液中。O-氨基苯甲醛(O-bzld)對光敏感，需要在37℃下稍微加熱。這用鋁箔覆蓋試管中進行。此外，由于氧化，在打開容器后，該試劑開始喪失它的活性，因此，必須迅速完成它。在將容器加熱到室溫后，稱取必須的量。
1.將適宜量的緩沖液吸取到各孔中。
2.向適宜的孔中加入50μl試驗化合物。向試驗和全部孔中加入50μl二氨基氧化酶(DAO)溶液。讓化合物與酶相互作用15分鐘的預保溫步驟。
3.讓分光光度計空置于空氣中用重復移液管向所有孔中加入50μlO-氨基苯甲醛溶液。此后，向試驗和所有孔中加入50μl腐胺底物溶液。底物不加入空白孔中。用自動平板計數(shù)器在450nm讀取初始吸光度。接著讓反應進行37分鐘，讀取最后的吸光度。體積空白(μl)總體積(μl)試驗化合物(μl)緩沖液 200 150 100DAO 505050o-bzld 505050腐胺0 5050化合物 0 0 50D.計算各試驗和空白孔的初始吸光度值作為這些孔的空白。這使得能校正可能來自由化合物引起的任何干擾吸光度的光密度?？瞻卓椎钠鹗嘉舛缺挥米鲄?shù)以確定如果在試驗化合物稀釋時見到任何極其異常的吸光度時，是否任何化合物的滴定可被接受。
從最終吸光度值中減去起始吸光度確定值。結果以不存在任何試驗化合物的總酶活的百分數(shù)表示試驗化合物最終-試驗化合物起始/(全部最終-全部起始)×100濃度與全部的百分數(shù)的半對數(shù)圖能計算IC50值。建議使用軟件如INPLOT。
在該分析中測試本發(fā)明的代表化合物和氨基胍時，獲得下面的結果試驗化合物IC50mMN-(2-乙酰氨基乙基)肼亞氨酰胺鹽酸鹽 6858N-(3-乙酰氨基丙基)肼亞氨酰胺鹽酸鹽 3140氨基胍鹽酸鹽 21實施例9為了確定試驗化合物對可誘導氧化氮合成酶的作用和由此形成的氧化氮，使用下面的分析方法。
用脂多糖誘導巨噬細胞(RAW 264.7)的氧化氮(NO)的產(chǎn)生，加入各種化合物以評價由使用化合物產(chǎn)生的抑制。
洗滌細胞，計數(shù)并稀釋至1.0×106細胞/ml的濃度。接著將100ul細胞/孔等分至96孔組織培養(yǎng)平板中的各孔中，產(chǎn)生1.0×105細胞/ml的最終濃度。在三個孔中進行分析，以收獲足夠的上清以備檢測。在37℃的烘箱中將細胞保溫2小時，接著將使用化合物加入其中。37℃下，將保溫再續(xù)3小時，此后加入脂多糖。37℃下，繼續(xù)保溫過夜，接著，向300μl樣品中加入400μl 1％磺胺的4NHCl溶液和100μl 6NHCl。室溫下，將該混合物保溫10分鐘，加入300μl 1％N-(1-萘基)亞乙基二胺鹽酸鹽的甲醇溶液。在每次加入后，在450nm下讀取光密度。
在該分析中測試本發(fā)明的代表化合物和氨基胍時，獲得下面的結果試驗化合物NO釋放的抑制百分數(shù)％N-(2-乙酰氨基乙基)肼亞氨酰胺氫溴酸鹽 20N-(2-乙酰氨基乙基)肼亞氨酰胺鹽酸鹽 15N-(3-乙酰氨基丙基)肼亞氨酰胺鹽酸鹽 33氨基胍鹽酸鹽 44實施例10片劑mg/片劑式I化合物50淀粉 50甘露糖醇 75硬脂酸鎂 2硬脂酸 5將化合物，一部分淀粉和乳糖混合，用淀粉糊濕潤成粒。將濕潤的顆粒置于淺盤中，45℃下，干燥過夜。在粉碎機中將干燥的顆粒粉碎至約20目的粒徑。加入硬脂酸鎂，硬脂酸和等量的淀粉，在適宜的片壓機上擠壓之前，混合整個混合物。使用11/3”沖壓機，用4kg的硬度將片劑壓成232mg的重量。根據(jù)USP XVI中描述的方法，這些片劑在半小時內(nèi)崩解。實施例11洗劑mg/g式I化合物 1.0乙醇400.0聚乙二醇400 300.0羥基丙基纖維素 5.0丙二醇 配制成1.0g實施例12為了進一步研究非酶促褐變抑制劑防止例如發(fā)生在牙齒表面的表面蛋白的著色的能力，進行下面褐變實驗。作為膜覆蓋的牙齒表面的替代物，用未曝光和顯影的相紙來提供在相紙背面的固定的蛋白(明膠，如膠原蛋白)的表面。穿出5毫米的圓孔，50℃下，在含3mM疊氮化鈉的100mM葡萄糖-6-磷酸的0.5M磷酸緩沖液pH 7.4的溶液中浸沒一周。葡萄糖-6-磷酸是能以比葡萄糖更快的比例參與非酶促褐變的糖。除葡萄糖-6-磷酸外，還包括洗必太和/或式I化合物。保溫后，將明膠/紙盤用水漂洗，觀察褐色并照相。
與僅浸泡在緩沖液中的盤相比，僅在葡萄糖-6-磷酸中保溫顯示輕微的褐色。包含洗必太(為最終濃度為0.04％洗必太的Peridex形式)則顯示出明顯的褐色。向洗必太中加入式I化合物完全抑制明膠的褐變，在不存在洗必太的情況下，包含式I化合物也是如此。
由葡萄糖-6-磷酸在明膠表面的單獨作用形成的輕微的褐色及式I化合物的對它的防止證明本發(fā)明在防止牙齒表面非酶促褐變中的效用。在存在洗必太時的增加的褐變和本發(fā)明化合物對它的防止證明本發(fā)明在防止洗必太產(chǎn)生的抗噬菌斑制劑增強的非酶促褐變中的效用。實施例13漱口液％式I化合物1.4葡萄糖酸洗必太 0.12乙醇 11.6糖精鈉 0.15FD&Blue NO.1 0.001薄荷油 0.5甘油 10.0Tween 60 0.3加水至 100實施例14牙膏％式I化合物5.5山梨糖醇，70％的水溶液 25糖精鈉 0.15十二烷基硫酸鈉 1.75Carbopol934，6％分散體 15薄荷油 1.0氫氧化鈉，50％水溶液 0.76二價磷酸鈣二水合物 45加水至 100在不脫離其實質或必要特征的情況下，可以其它形式實施或以其它方法進行本發(fā)明。因此本公開被認為從各方面來進行說明，并且不限制所附權利要求所述的本發(fā)明的范圍，落在相同的含義和范圍中的所有變化均被包含在本發(fā)明中。
權利要求
1.一種抑制靶蛋白高級糖基化的組合物，包括有效量的式I化合物
其中alk為具有2-8個碳原子的直鏈或支鏈亞烷基，R為含有1-6碳原子的低級烷基；和它們生物或藥物學可接受的酸加成鹽；和其載體。
2.權利要求1的組合物，其中R為甲基。
3.權利要求1的組合物，其為N-(2-乙酰氨基乙基)肼亞氨酰胺氫溴酸鹽，或其它藥物學可接受的鹽。
4.權利要求1的組合物，其為N-(2-乙酰氨基乙基)肼亞氨酰胺鹽酸鹽，或其它藥物學可接受的鹽。
5.權利要求1的組合物，其為N-(3-乙酰氨基丙基)肼亞氨酰胺氫溴酸鹽，或其它藥物學可接受的鹽。
6.一種施用于動物以抑制在所述動物中的靶蛋白的高級糖基化的藥物組合物，包括藥物學有效量的式I化合物
其中alk為具有2-8個碳原子的直鏈或支鏈亞烷基，R為含有1-6碳原子的低級烷基；和它們生物或藥物學可接受的酸加成鹽；和其載體。
7.權利要求6的組合物，其中R為甲基。
8.權利要求6的組合物，其為N-(2-乙酰氨基乙基)肼亞氨酰胺氫溴酸鹽，或其它藥物學可接受的鹽。
9.權利要求6的組合物，其為N-(2-乙酰氨基乙基)肼亞氨酰胺鹽酸鹽，或其它藥物學可接受的鹽。
10.權利要求6的組合物，其為N-(3-乙酰氨基丙基)肼亞氨酰胺鹽酸鹽，或其它藥物學可接受的鹽。
11.一種抑制靶蛋白的高級糖基化產(chǎn)物形成的方法，該方法包括施用有效量的組合物，其中所述組合物包括式I化合物
其中alk為具有2-8個碳原子的直鏈或支鏈亞烷基，R為含有1-6碳原子的低級烷基；和它們生物或藥物學可接受的酸加成鹽；和其載體。
12.權利要求11的方法，其中R為甲基。
13.權利要求11的方法，其為N-(2-乙酰氨基乙基)肼亞氨酰胺氫溴酸鹽，或其它藥物學可接受的鹽。
14.權利要求11的方法，式I的化合物其為N-(2-乙酰氨基乙基)肼亞氨酰胺鹽酸鹽，或其它藥物學可接受的鹽。
15.權利要求11的方法，式I的化合物其為N-(3-乙酰氨基丙基)肼亞氨酰胺鹽酸鹽，或其它藥物學可接受的鹽。
16.一種治療動物以抑制所述動物中靶蛋白的高級糖基化終產(chǎn)物形成的方法，該方法包括施用有效量的藥物學組合物，其中所述藥物學組合物包括式I化合物
其中alk為具有2-8個碳原子的直鏈或支鏈亞烷基，R為含有1-6碳原子的低級烷基；和它們生物或藥物學可接受的酸加成鹽；和其載體。
17.權利要求16的方法，其中R為甲基。
18.權利要求16的方法，其中式I化合物為N-(2-乙酰氨基乙基)肼亞氨酰胺氫溴酸鹽，或其它藥物學可接受的鹽。
19.權利要求16的方法，其中式I化合物為N-(2-乙酰氨基乙基)肼亞氨酰胺鹽酸鹽，或其它藥物學可接受的鹽。
20.權利要求16的方法，其中式I化合物為N-(3-乙酰氨基丙基)肼亞氨酰胺鹽酸鹽，或其它藥物學可接受的鹽。
21.一種抑制口腔中由非酶促褐變導致的牙齒著色的方法，包括施用有效量的包含式I化合物的抑制高級糖基化終產(chǎn)物形成的組合物
其中alk為具有2-8個碳原子的直鏈或支鏈亞烷基，R為含有1-6碳原子的低級烷基；和它們生物或藥物學可接受的酸加成鹽；和其載體。
22.一種治療動物以抑制所述動物中靶蛋白的高級糖基化終產(chǎn)物的形成，而不伴隨性地影響二氨基氧化酶和可誘導的氧化氮合成酶的方法，該方法包括施用有效量的藥物組合物，該藥物組合物包含N-(2-乙酰氨基乙基)肼亞氨酰胺和其生物學和藥物學可接受的酸加成鹽，和其載體。
23.權利要求22的方法，其中組合物包括N-(2-乙酰氨基乙基)肼亞氨酰胺氫溴酸鹽。
24.權利要求22的方法，其中組合物包括N-(2-乙酰氨基乙基)肼亞氨酰胺鹽酸鹽。
25.化合物N-(2-乙酰氨基乙基)肼亞氨酰胺氫溴酸鹽，或其它藥物學可接受的鹽。
26.化合物N-(2-乙酰氨基乙基)肼亞氨酰胺鹽酸鹽，或其它藥物學可接受的鹽。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用式(Ⅰ)化合物的組合物和抑制非酶促交聯(lián)(蛋白老化)的方法,其中alk為具有2—8個碳原子的直鏈或支鏈亞烷基,R為含有1—6碳原子的低級烷基;和它們生物或藥物學可接受的酸加成鹽。相應地,公開了一種包含該N－?；被榛聛啺滨０返慕M合物,該組合物能抑制靶蛋白高級糖基化終產(chǎn)物的形成。該方法包括將靶蛋白與組合物接觸。由于可以處理食物腐敗和動物蛋白老化,由此預測了本發(fā)明的工業(yè)和治療用途。
文檔編號A61P1/00GK1209117SQ96199999
公開日1999年2月24日 申請日期1996年12月26日 優(yōu)先權日1995年12月26日
發(fā)明者P·C·烏爾里赫, D·R·瓦格勒 申請人:奧爾頓有限公司