專利名稱：涉及酶促去甲?；襟E的天冬甜素的合成和回收的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于合成α-L-天冬氨?；?L-苯丙氨酸甲酯(α-APM；aspartame)的方法，該方法涉及一種N-甲酰基-α-L-天冬氨?；?L-苯丙氨酸化合物的酶促去甲?；４颂幩傅腘-甲?；?α-L-天冬氨?；?L-苯丙氨酸化合物被理解為N-甲?；?α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸或它的甲酯(F-α-AP或F-α-APM)。本發(fā)明還涉及一種方法，該方法用于通過酶促去甲?；瘡?i)N-甲酰基-α-和N-甲?；?β-L-天冬氨?；?L-苯丙氨酸的混合物或者(ii)N-甲酰基-α-和N-甲?；?β-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸甲酯(F-αβ-AP或F-αβ-APM)的混合物中制備和回收α-APM。最后，本發(fā)明涉及一種簡單的方法，該方法用于從N-甲?；?L-天冬氨酸(F-Asp)和L-或D，L-苯丙氨酸甲酯(L-或D，L-PM)連續(xù)式one-pot酶促合成α-APM，該方法也涉及到一種酶促去甲?；磻?yīng)。同時酶促偶聯(lián)和去甲?；磻?yīng)的結(jié)合具有更寬更廣的一般實用性。
天冬甜素(α-APM，L，L-型)已知為一種高強度的人工甜味劑，它具有的甜度約為蔗糖甜度的200倍，而它的口感與蔗糖相近。APM的β-型不具有甜味。α-APM被用于多種可食材料的加甜。α-APM的合成方法包括化學(xué)合成路線(例如，將F-Asp的酐同L-Phe或L-PM偶聯(lián))，該方法不可改變地導(dǎo)致α-和β-型F-APM的比例約70/30到80/20(wt./wt.)的混合物。除所需的去甲?；猓@些化學(xué)方法因此還需要從β-APM中分離α-APM以及巨大的循環(huán)流以回收高純度和足夠產(chǎn)量的α-APM。α-APM的合成方法還包括酶促偶聯(lián)方法(例如，通過將F-Asp或N-芐氧基-羰基-L-Asp，又稱Z-Asp，同D，L-PM或L-PM相偶聯(lián))。酶學(xué)方法具有明顯的優(yōu)點，它們選擇性地產(chǎn)生保護形式的α-偶連的L，L-產(chǎn)物。盡管仍需要一個去甲?；襟E，酶促偶聯(lián)路線并不需要α-APM從β-APM中困難的分離，也不需要巨大的循環(huán)流以回收高純度和足夠產(chǎn)量的α-APM。在用于合成α-APM工藝方法的聲明中，許多方法涉及到甲?；Ｗo路線，并因此在該方法的最后環(huán)節(jié)中需要一個去甲酰基步驟?；瘜W(xué)去甲?；ǔＴ诤屑状己鸵环N強酸的水介質(zhì)中進行，它的缺點為該分子的苯丙氨酸甲酯部分也發(fā)生去甲基化，并且在任何后繼的甲基化步驟中將獲得許多種化合物的混合物。酶促去甲?；鶕?jù)信可在溫和的條件下進行，并因此不同時發(fā)生去甲基化。然而，迄今為止看起來沒有合適的酶促去甲?；椒梢允褂?。
美國專利No.4,668,625的實施例11中披露了的一種N-甲酰-α-L-天冬氨?；?L-苯丙氨酸化合物，即F-α-APM，的酶促去甲?；饔?。這一專利表明青霉素?；D(zhuǎn)移酶不適于從寡肽上除去甲?；鶊F。例如，實施例11中，在與F-α-APM相比活性酶含量極高的情況下(即，50U酶和2gF-α-APM)反應(yīng)36小時后產(chǎn)量據(jù)描述為20％。然而，在目前的應(yīng)用中即使這些結(jié)果也不能被重復(fù)。除還有其它因素外，這是因為所使用的假單胞菌菌株和從中分離具有青霉素?；D(zhuǎn)移酶活性的酶的方法沒有給出清楚的披露。
因此，一種不具備上述缺點的改進的制備方法是有需求的，該方法用于α-L-天冬氨?；?L-苯丙氨酸甲酯(α-APM；天冬甜素)的合成，該方法涉及到一種N-甲?；?α-L-天冬氨?；?L-苯丙氨酸化合物的酶促去甲?；?。
現(xiàn)在，具有甲酰基甲硫氨酰肽去甲?；富钚缘拿?為方便，下文稱為PDF或PDF酶)被出人意料地發(fā)現(xiàn)可用于天冬甜素的合成。根據(jù)本發(fā)明，用于通過N-甲?；?α-L-天冬氨?；?L-苯丙氨酸化合物的酶促去甲?；瘉砗铣搔?L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸甲酯的方法包括以酶處理N-甲?；?α-L-天冬氨?；?L-苯丙氨酸或其甲酯，該酶具有甲?；琢虬滨ｋ娜ゼ柞；富钚圆⒕哂幸环N二價金屬離子作為輔基，該金屬選自元素周期表中的5到11族金屬。
本文所指的元素周期表和族編號(新IUPA(版本))見于化學(xué)與物理手冊(Handbook of Chemistry and Physics)，第70版，CRCPress，1989-1990的封皮內(nèi)頁。來自5到11族金屬的二價金屬離子為，例如，V2+，Cr2+，Mn2+，F(xiàn)e2+，Co2+，Ni2+，Cu2+，Pd2+和Pt2+，優(yōu)選的是Mn2+，F(xiàn)e2+，Co2+和Ni2+。
在優(yōu)選的情況下，二價金屬離子的量應(yīng)與酶的摩爾數(shù)大致相當。二價金屬離子和PDF分子數(shù)的適當摩爾比范圍為0.6到1.4，優(yōu)選情況下為0.8到1.2，二價金屬離子的最優(yōu)選的量為該酶的等摩爾數(shù)。
當然，在F-α-AP被用作起始材料的情況下，需要進行對苯丙氨酸羧酸基團的最后的甲基化步驟以獲得所需的天冬甜素產(chǎn)物。用于該甲基化的方法為技術(shù)人員所知，例見UA-A-4,946,988和EP-A-0468063。
從反應(yīng)混合物中的回收α-APM可以通過技術(shù)人員所知的任何方法進行。天冬甜素的多種結(jié)晶方法已被文獻所描述，例如，EP-A-0091787，EP-A-0399605和EP-A-0582351。在優(yōu)選情況下，α-APM的回收在pH接近于α-APM的等電點下進行，即，在pH3～7下進行。
由于在本領(lǐng)域中迄今為止沒有關(guān)于PDF酶也適于對寡肽或二肽的末端N-甲酰-L-天冬氨酸殘基進行去甲?；娜魏握f明，本發(fā)明尤為出人意料。
具有甲?；琢虬滨ｋ娜ゼ柞；富钚缘拿?PDF’s)在自然界中廣泛存在。多數(shù)情況下它們被描述為甲?；琢虬彼崛ゼ柞；浮５?，必須注意到在文獻中還有其它名稱被用于代替甲?；琢虬彼崛ゼ柞；傅拿Q；特別是可以提及下列名稱(多)肽去甲?；?，N-甲?；琢虬滨０滨；?tRNA去甲?；福琋-甲?；?L-甲硫氨酸酰胺水解酶，N-甲?；琢虬滨?氨?；?tRNA酰胺水解酶。
自然界中，例如在真細菌中的天然PDF’s催化甲?；鶊F從新生多肽的N-末端甲硫氨酸殘基上的去甲?；桓唧w說，PDF’s催化N-甲酰基基團從新生多肽的N-末端L-甲硫氨酸殘基上的水解，該新生多肽通過核糖體蛋白合成機器合成。但是，迄今為止這些酶未知有其它實踐應(yīng)用。相反，Rajagopalan等人(生物化學(xué)(Biochem。736，13910-8(1997)))證實去甲?；笇τ陔牡孜锏腘-末端的甲硫氨酸有強烈的序列優(yōu)先性，并且對該位置的正亮氨酸有稍低程度的序列優(yōu)先性。
PDF’s可獲自，例如，真細菌，如大腸桿菌(Escherichiacoli)，因此，出人意料的是這些酶可以在α-APM的合成中有利地使用?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis)，拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)，丙酮丁醇梭菌(clostridiumacetobutylicum)，海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)，Thermus quaticus，嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)， 眉藻PCC 7601，流感嗜血桿菌(Heamophilus influenzae)，嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearother mophilus)或乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。在優(yōu)選情況下使用一種來自大腸桿菌的酶。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)為了能在根據(jù)本發(fā)明的合成方法中使用，PDF’s需要作為輔基的二價金屬離子，所述金屬選自元素周期表5-11族金屬。
本發(fā)明的酶促去甲?；姆磻?yīng)條件并不十分苛刻。對PDF呈惰性的任何合適的溶劑系統(tǒng)均可以使用；這樣的溶劑包括含水系統(tǒng)(溶液或漿液)或含有可與水混溶的有機溶劑的含水系統(tǒng)，該有機溶劑在該反應(yīng)條件下呈惰性。然而含水系統(tǒng)是優(yōu)選的。N-甲?；衔锏臐舛纫膊⒉豢量蹋?，可以在約10到1000mM的范圍內(nèi)。沒有必要溶解全部N-甲酰基化合物，其部分可以漿液存在。PDF的濃度也并不十分苛刻，通常為甲?；衔镏亓康?.001％到100％，一般低于30.0％，例如約0.2mM的PDF。反應(yīng)的pH在優(yōu)選情況下選自3.0到9.0的范圍，更優(yōu)選的情況下4.0到8.0。溫度并不十分苛刻，適當情況下為10到50℃范圍，例如約37℃。，但對于熱穩(wěn)定的PDF酶可以使用較高的溫度。
到目前關(guān)于PDF’s的分離和鑒別已經(jīng)做了許多工作。下列段落給出了PDF’s的更多一些信息。在本申請的進一步內(nèi)容中將會表明如何獲得本發(fā)明所需的具有二價金屬離子的PDF’s。
天然PDF的一個例子是來自大腸桿菌(E.coli)的PDF酶。它被證明為一種單體酶，該酶長168個氨基酸，分子量為19197道爾頓，正如根據(jù)它的氨基酸序列計算的(減去N-末端甲硫氨酸，該殘基通過翻譯后修飾步驟而除去)。該酶由一個1-147位氨基酸組成的活性核心和一個148-168位氨基酸的C-末端結(jié)構(gòu)域組成；然而后一結(jié)構(gòu)域?qū)τ谌ゼ柞；富钚圆⒎潜匦?。來自E.coli的PDF編碼基因已經(jīng)被克隆(Mazel等，EMBO J.，13，914-923(1994))，并且在E.coli中非常成功的過量表達已被描述(Groche等，(生物化學(xué)和生物物理研究通訊(Biochem.and Biophys.Res.Com.)，246，342-346(1998)))，該表達高達約102到103倍，使用不同表達構(gòu)建體進行。近來已經(jīng)發(fā)表了對含有Zn2+，F(xiàn)e2+和Ni2+的E.coli PDF’s的三維結(jié)構(gòu)之間的比較(Becker等，天然結(jié)構(gòu)生物學(xué)(Nature StructuralBiology)，5，1998，1053-1058)。
然而，由于PDF’s在純化，貯存和以稀釋形式測試期間的極端不穩(wěn)定，PDF’s的研究迄今為止受到很長時間的嚴重阻礙。根據(jù)以這些極不穩(wěn)定的酶制劑進行的生化特征研究的結(jié)果，直到最近才設(shè)想來自E.coli的天然PDF酶每個酶分子含有一個Zr2+離子。該PDF’s仍被視為屬于鋅金屬蛋白酶超家族的一個特殊的家族，但Zn2+不適合作為本發(fā)明方法中的輔基。
近來表明，通過加入過氧化氫酶，PDF可在純化，貯存和對甲?；琢虬滨ｋ娜ゼ柞；富钚赃M行測試(以酶的稀釋形式)期間有效地穩(wěn)定。這一和其它替代的穩(wěn)定方法導(dǎo)致了深入的認識(見Rajagopalan，等，美國化學(xué)學(xué)會雜志，(J.Am.Chem.Soc.)，119，12418-12419(1997)，Becker等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，273，11413-6(1998)，Groche等，生物化學(xué)和生物物理研究通訊(Biochem.and Biophys.Res.Com.)，246，342-346(1998))和Ragusa等，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)，280，515-523(1998)))，即早期從E.coli中純化的酶制劑中存在的Zn2+主要由所使用的分離方法所造成，并且含Zn2+的酶是(幾乎)完全無催化活性的。PDF純化期間過氧化氫酶的加入和/或替代的穩(wěn)定方法使得純化出了天然的具有催化活性的完整E.coliPDF，它被證明每個酶分子含有一個Fe2+離子而非Zn2+離子。據(jù)發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明的α-APM合成方法期間也適于使用該穩(wěn)定方法。
適于穩(wěn)定PDF的方法中的一種是確保在具有被還原的O2成分的環(huán)境中使用PDF，優(yōu)選的情況下在無氧的條件下使用。在這些條件下幾乎不發(fā)生分子氧被還原成過氧化氫并同時氧化二價金屬離子，如Fe2+。溶解的氧成分的還原也可以通過酶促消除來完成，例如通過使用一種葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶系統(tǒng)(Rajagopalan，P.T.R.，andDPei，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，273，N0.35，22305-22310，(1998))。過氧化氫酶的存在防止了酶結(jié)合的Fe2+氧化成Fe3+，該氧化導(dǎo)致PDF催化能力失活。Fe3+結(jié)合得比Fe2+弱很多，由于PDF的金屬離子結(jié)合位點對Zn2+具有高得多的親和性，因此Fe3+很容易同Zn2+相交換。這一級聯(lián)事件的最終影響是PDF的失活。
還可以通過替代的穩(wěn)定方法來穩(wěn)定PDF’s，即通過其它穩(wěn)定試劑的添加/存在來完成，例如三烷基膦(trialkylphosphine)化合物或其衍生物；這樣的化合物的例子有三乙基磷化氫，三丁基磷化氫和TCEP(三-(2-羧乙基)-磷化氫)。與過氧化氫酶類似，這些穩(wěn)定化試劑很容易同H2O2或其他過氧化物反應(yīng)。進一步，PDF的失活還可通過在高濃度下使用PDF來防止，例如在PDF濃度為每ml至少0.1mg PDF下使用，更優(yōu)選的情況下為至少1.0mg/ml。如果使用的是實踐的濃度，PDF濃度的上限并不嚴格。
可以通過在Groche等，生物化學(xué)和生物物理研究通用(Biochem.and Biophys.Res.Com.)，246，342-346，(1998)中描述的各種方法來完成PDF’s中的二價金屬離子交換以獲得具有本發(fā)明所必需的輔基的PDF酶。這些方法包括通過將天然酶在過量的期望的二價金屬離子中溫浴來進行簡單的金屬置換，如果必要可通過以金屬螯合化合物處理天然酶來制備脫輔基蛋白來進行。進一步，可以通過使用期望的二價金屬離子同F(xiàn)e2+的比例經(jīng)過增強的細菌培養(yǎng)基來引入期望的二價金屬離子(至少在的酶分子的一部分引入)。
應(yīng)該注意到，除了本發(fā)明的方法中使用的酶，具有甲?；琢虬滨ｋ娜ゼ柞；富钚缘娜毎?、酶制劑、固定化酶等等當然均也可以被應(yīng)用。因此，本文所使用的術(shù)語酶、PDF等等還包括活性酶的其它形式，包括其遺傳工程突變體，例如，該突變體在去甲?；磻?yīng)中具有增強的活性或選擇性。
被使用的酶可以根據(jù)用于酶活性的標準分類方法來分類。具有甲?；琢虬滨ｋ娜ゼ柞；富钚缘囊唤M非常重要的酶被分類為EC3.5.1.27。
在優(yōu)選的情況下，該酶為具有針對EC 3.5.1.27所描述的活性的酶，這是因為使用這些酶獲得了優(yōu)秀的去甲?；Y(jié)果。應(yīng)當注意，盡管直到最近編碼為EC 3.5.1.31的酶被認為催化一個不同的反應(yīng)，但同時據(jù)表明EC 3.5.1.27和EC 3.5.1.31為同一個基因所編碼并具有相同的活性。因此，本文所用的術(shù)語EC 3.5.1.27不僅包括EC3.5.1.31，還同樣包括所有其它具有與EC 3.5.1.27所描述同樣的活性的酶。
盡管PDF’s家族包括的蛋白具相對較低水平的序列同源性，該家族成員的3D結(jié)構(gòu)表現(xiàn)得相互接近，特別是在二價金屬離子周圍的一個共同折疊結(jié)構(gòu)和三個特征序列。如Wanger等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，273，11413-6(1998)所描述(指定PDF’s為PDF)，對于這些酶的多數(shù)，3個短氨基酸的一段序列特征地以嚴格的保守基元形式存在，即，由于這些酶含有序列(i)HEXXH，(ii)EGCLS和(iii)GXGXAAXQ。在這些序列中，X代表任何天然氨基酸，使用的為標準的單字母氨基酸代碼A＝丙氨酸，C＝半胱氨酸，E＝谷氨酸，G＝甘氨酸，H＝組氨酸，L＝亮氨酸，S＝絲氨酸，Q＝谷氨酰胺。
在優(yōu)選的情況下，本發(fā)明的方法使用可從E.coli中獲得的PDF來完成。
特別地，在PDF中的輔基二價金屬離子為錳，鐵，鈷和鎳離子。上文已經(jīng)說明如何可以實現(xiàn)輔基二價金屬離子的替換。
在優(yōu)選的情況下，本發(fā)明的方法中所使用的PMdf’s在活性位點含有Fe2+和/或Ni2+離子，這是由于這樣可觀察到酶的最大的活性和穩(wěn)定性。含有Ni2+的PDF’s尤為優(yōu)選，因為這些酶對氧化更具抗性并因此而更穩(wěn)定。因此，采取穩(wěn)定化措施和/或一種穩(wěn)定化試劑的添加/存在在該情況下較不重要。有趣的是，F(xiàn)e2+對Ni2+的替換并不明顯地影響酶的特異性去甲?；钚裕摶钚耘c用Fe2+酶的水平一樣高。
但是，含有Fe2+離子的PDF’s(每個酶分子大約一摩爾當量)最為優(yōu)選，這是因為與其天然存在相比它們無需金屬交換并且該金屬離子在所獲得最終產(chǎn)物的剩余存在并不可能導(dǎo)致任何問題，例如毒物學(xué)問題。當然，當分離該酶和在本發(fā)明中使用它時應(yīng)采取措施以避免Zn2+對Fe2+的置換。因此，在優(yōu)選情況下該二價金屬離子為Fe2+離子，并且以PDF酶進行的所有處理均在一種穩(wěn)定化試劑存在下進行。
此處和后文所用的術(shù)語“一種穩(wěn)定化試劑存在下”意指包括所有上文所示用于PDF’s的穩(wěn)定化的手段。
在優(yōu)選的情況下該穩(wěn)定化試劑為過氧化氫酶或一種三烷基膦化合物或衍生物，最優(yōu)選的情況下為過氧化氫酶。
在本發(fā)明者對本發(fā)明的PDF’s在合成α-APM中的使用的研究中，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)了該應(yīng)用的一個進一步的優(yōu)點。特別地，據(jù)觀察這些酶具很強的區(qū)域選擇性。它們對于F-α-AP和F-α-APM的去甲?；貏e具非常高的活性而對F-β-AP或F-β-APM不具有或僅具較低的活性。進一步，F(xiàn)-β-AP和F-β-APM的存在據(jù)發(fā)現(xiàn)不會在F-α-AP和F-α-APM的去甲酰基化中對該PDF造成任何抑制。對于F-AP和F-APM的α-和β-形式的各自的活性現(xiàn)在被發(fā)現(xiàn)對于F-AP至少相差20×，對于F-APM相差200×或更多。因此，在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中，對于使用甲?；Ｗo的α-APM的生產(chǎn)路線中對AP和/或APM的α-和β-形式的困難的分離提供了一種優(yōu)質(zhì)和低成本的替代方法。
在本發(fā)明的這一優(yōu)選的實施方案中，出人意料發(fā)現(xiàn)的本發(fā)明的該PDF酶的α-選擇性被用于從F-α-APM和F-β-APM的混合物中選擇性地回收α-APM，或用于從F-α-AP和F-β-AP的混合物中選擇性地制備α-AP并隨后將α-AP轉(zhuǎn)化為α-APM并回收α-APM。
在本發(fā)明的這一實施方案中，(i)N-甲酰基-α和N-甲?；?β-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸(F-αβ-AP)的混合物或(ii)N-甲?；?α和N-甲?；?β-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯(F-αβ-APM)的混合物均經(jīng)過一種酶處理，該酶具有甲?；琢虬滨ｋ娜ゼ柞；窹DF活性和一種輔基二價金屬離子，以分別形成α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸或其甲酯，該金屬離子選自元素周期表的5-11族金屬，當α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸(α-AP)在去甲?；襟E中形成時隨后進行了對苯丙氨酸羧酸基團的甲基化步驟，并且回收α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯(α-APM)。
如果被使用，后繼的甲基化步驟和α-APM的回收為技術(shù)人員所知，如上文所描述。
特別地，從F-α-AP(M)和F-β-AP(M)的混合物中選擇性制備α-AP(M)可適宜地同通過甲?；Ｗo途徑的AP(M)的化學(xué)合成方法聯(lián)合使用。在本發(fā)明之前，在這些路線中的甲?；ケＷo步驟一直很困難并且需要長反應(yīng)時間和通常的進一步酯化步驟。進一步，在該過程中形成了至少8種化合物的混合物(4種α-化合物α-APM，α-AP，α-AMP和α-AMPM以及它們對應(yīng)的β化合物；在AMP中該甲酯基團存在于L-Asp部分的β-羧基官能團上，APMP代表一個二甲基酯)。α-APM在這些過程中的回收需通過中間體選擇性沉淀和α-APM.HCl鹽的回收來完成，其中其它七種化合物主要留在溶液中并需要經(jīng)循環(huán)重新轉(zhuǎn)化回其起始材料L-Asp和L-Phe(通過水解)并且在其回收后再轉(zhuǎn)化為α-APM。由于過長的反應(yīng)時間，相對較低的α-APM一次性產(chǎn)量以及回收損失所造成的L-Asp和L-Phe的低效，這是不利的。
在優(yōu)選的情況下，在本發(fā)明的第二個實施方案中該PDF為一種EC3。5.1.27，因為這樣可獲得優(yōu)秀的結(jié)果。更優(yōu)選的情況下，該PDF包含序列(i)HEXXH，(ii)EGCLS和(iii)GXGXAAXQ。特別地，所使用的該PDF可獲自E.coli，二價金屬離子為錳，鐵，鈷和鎳離子。二價金屬離子為鐵和/或鎳離子時更為優(yōu)選。優(yōu)選情況下二價金屬離子為Fe2+并且用PDF酶進行的所有處理均在一種穩(wěn)定化試劑存在的情況下進行。在該情況下，該穩(wěn)定化試劑優(yōu)選地為過氧化氫酶或三烷基膦化合物或衍生物，最優(yōu)選的情況下為過氧化氫酶。
對于關(guān)于反應(yīng)條件等等的進一步相關(guān)描述，上文在討論本發(fā)明的第一個實施方案中已經(jīng)給出了詳細的參考。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的酶促去甲?；襟E被并入α-APM的一種新的連續(xù)式酶促合成中。特別地，在該實施方案中使用嗜熱菌蛋白酶作為連接酶將N-甲?；?L-天冬氨酸(F-ASP)同L-或D，L-苯丙氨酸甲酯(L-或D，L-PM)進行酶促偶聯(lián)，并且同時，在相同的反應(yīng)器中，通過偶聯(lián)反應(yīng)形成的N-甲?；?α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯(N-F-α-APM)通過一種具有甲?；琢虬滨ｋ娜ゼ柞；?PDF)活性和一種輔基二價金屬離子的酶的處理以去甲?；?，該金屬離子選自元素周期表的5-11族金屬，該酶存在于用于酶學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)的反應(yīng)系統(tǒng)。
應(yīng)注意此處和后文所使用的術(shù)語“嗜熱菌蛋白酶”意指的嗜熱菌蛋白酶，包括其突變體和任何其它對于所述的偶聯(lián)反應(yīng)具有適當偶聯(lián)活性的酶。
在優(yōu)選的情況下，在反應(yīng)已經(jīng)進行直至轉(zhuǎn)化率高于40％后回收所形成的α-APM。此處所指的轉(zhuǎn)化涉及到L-PM轉(zhuǎn)化為所需的α-APM終產(chǎn)物，該轉(zhuǎn)化從偶聯(lián)步驟開始。在沒有同時的去甲?；襟E的情況下，F(xiàn)-Asp和L-或D，L-PM的酶促偶聯(lián)反應(yīng)(由于該反應(yīng)的平衡位置，該反應(yīng)在熱力學(xué)上不利)產(chǎn)率主要朝向底物一側(cè)進行。在偶聯(lián)反應(yīng)期間同時存在的PDF導(dǎo)致向反應(yīng)右側(cè)的有利的移動，這樣便直接導(dǎo)致了α-APM。與之相反，如果未使用本發(fā)明的PDF，則需要采取其它麻煩的措施以移動所述的平衡，并且不可能在直接的連續(xù)式生產(chǎn)方法中合成α-APM。在缺乏PDF的情況下α-APM的直接產(chǎn)量為零。移動該平衡以使其更有利于合成(F-α-APM而非α-APM)一側(cè)的嘗試已經(jīng)通過創(chuàng)造反應(yīng)條件來進行，其所形成的F-α-APM作為L-或D-PM的附加化合物在原處進行沉淀。但是，這樣的形成一種附加化合物需要相對高濃度(并且過量，2當量)的L-PM或D，L-PM。在后一種情況下將產(chǎn)生F-α-APM同L-和/或D-PM的加成物中間體沉淀(在前一種情況下為F-α-APM.L-PM加成化合物)。因此，令人驚奇地，根據(jù)本發(fā)明的第三個實施方案，α-APM的直接形成的轉(zhuǎn)化成為可能。
本發(fā)明的這一有利的第三種實施方案只是由于一個出人意料的發(fā)現(xiàn)才成為可能，即與本文所用的PDF’s與對N-甲?；?α-二肽衍生物或其它(N-末端)N-甲酰寡肽的去甲?；钚韵啾?，其對F-Asp不具有很明顯的去甲?；钚?。
這更令人吃驚，因為為技術(shù)人員已知的是對于肽化學(xué)已知的多數(shù)其它去保護酶(例如，用于除去苯乙酸殘基的的PenG-?；D(zhuǎn)移酶，或用于除去氨基甲酰基團的去氨基甲酰酶)，未觀察到它們在對被保護的單體和寡聚體化合物的活性間具有這樣明顯的差異。與之相反，對被保護的單體和寡聚體化合物的活性間的差異幾乎不存在(例如關(guān)于PenG-?；D(zhuǎn)移酶)或與之相反，即，對于被保護的單體化合物具較高的活性(例如，關(guān)于去氨基甲酰酶)。
因此，本發(fā)明所用的PDF’s適用于本發(fā)明的方法是完全預(yù)期不到的。本發(fā)明的方法所用的PDF’s表現(xiàn)得與其它去酰基酶(或酰胺水解酶)完全不同。
因為迄今為止本領(lǐng)域中沒有任何說明指出PDF酶適于對寡肽或二肽的末端N-甲?；?L-天冬氨酸殘基進行去甲?；?，因此本發(fā)明的實施方案尤為出人意料。進一步，該PDF’s對N-甲?；被岷?N-末端)N-甲酰基寡肽具有明顯不同的去甲?；钚?。這使一種技術(shù)上可行的方法成為可能，該方法沉淀出α-APM，并且基本上不形成副產(chǎn)物(例如α-APM的哌嗪二酮)，并且在連續(xù)法單步驟過程中無需大量的循環(huán)，等等。
用于本發(fā)明第三種實施方案的反應(yīng)條件也并不十分苛刻。如上文關(guān)于第一種實施方案所提及，任何對PDF惰性的合適的溶劑系統(tǒng)均可被應(yīng)用；這樣的溶劑系統(tǒng)包括含水系統(tǒng)(溶液或漿液)或含有可與水混溶的有機溶劑的含水系統(tǒng)，該有機溶劑在該反應(yīng)條件下呈惰性。然而含水系統(tǒng)是優(yōu)選的。N-甲?；鹗蓟衔?F-ASP)的濃度也并不苛刻，例如，可以在約10到1000mM的范圍內(nèi)。沒有必要溶解全部N-甲酰基化合物，其部分可以以漿液存在。PDF的濃度同樣也并不十分苛刻，通常為甲?；衔镏亓康?.001％到100％，一般低于30.0％，例如約0.2mM的PDF。反應(yīng)的pH在優(yōu)選情況下選自3.0到9.0的范圍，更優(yōu)選的情況下4.0到8.0，因為此時α-APM的形成不伴隨任何副產(chǎn)物的顯著形成并且所用的酶保持高穩(wěn)定性和活性。如果所形成的α-APM被沉淀，則形成副產(chǎn)物的危險更小。溫度并不十分苛刻，適當情況下為10到50℃范圍，例如約37℃。但對于熱穩(wěn)定的PDF酶可以使用較高的溫度。
如果PDF為具有EC.3.5.1.27所描述的活性的酶，本發(fā)明的該第三種實施方案中可獲得良好的結(jié)果。在優(yōu)選的情況下，該PDF酶包含序列(i)HEXXH，(ii)EGCLS和(iii)GXGXAAXQ。
如果該PDF酶對于在N-末端有N-甲?；琢虬彼岬?寡)肽具有去甲?；钚?，則本發(fā)明的這一第三種實施方案更為有利，該活性比其對N-甲?；琢虬彼岬娜ゼ柞；钚愿咧辽?0×，在優(yōu)選情況下至少100×，最優(yōu)選的情況下至少200×。
應(yīng)當注意，為選擇最適合的PDF’s，該PDF’s的去甲?；钚赃€可以對除N-甲?；琢虬彼?寡)肽及其對應(yīng)的N-甲?；被嶂獾?N-末端)N-甲?；衔飦頉Q定。所獲得的對這些其它的N-甲?；?寡)肽和氨基酸的去甲酰基活性值之間的比例可被采用以作為對該第三種實施方案的具體PDF的合適度的近似量度。
本發(fā)明的這一優(yōu)選的實施方案甚至可以有比α-APM的合成的更普遍的應(yīng)用。當酶促去甲酰基化反應(yīng)與一種N-甲?；被?在合成α-APM的情況下為F-Asp)同另一種氨基酸或在末端氨基基團無保護的(寡)肽(在合成α-APM的情況下為L-PM)的酶促偶聯(lián)同時進行時尤為有利。
在優(yōu)選的情況下，本發(fā)明的方法使用可從E.coli中獲得的PDF來完成。特別地，在PDF中的輔基二價金屬離子為Mn2+，F(xiàn)e2+，Co2+和Ni2+離子。上文已經(jīng)說明如何進行輔基二價金屬離子的交換。
在優(yōu)選的情況下，本發(fā)明的該實施方案中使用在活性位點含有Fe2+/Ni2+離子的PDF’s。
特別地，該二價金屬離子為Fe2+離子并且用PDF酶進行的所有處理均在一種穩(wěn)定化試劑存在的情況下進行。該穩(wěn)定化試劑優(yōu)選地為過氧化氫酶或三烷基膦化合物或衍生物，最優(yōu)選的情況下為過氧化氫酶。
除上文提及的關(guān)于反應(yīng)條件等等的描述外，應(yīng)注意到在本發(fā)明的這一第三種實施方案內(nèi)，為在足夠高水平上保持嗜熱菌蛋白酶連接酶(其為一種蛋白內(nèi)切酶)和PDF活性，采取一個或多個附加措施可能導(dǎo)致更好結(jié)果。例如，防止嗜熱菌蛋白酶對所使用的PDF的任何可能的酶解是可取的。特別地，用固定化形式的嗜熱菌蛋白酶和/或PDF是有利的。固定化可通過技術(shù)人員可用的任何方法處理。一種適當?shù)姆椒橐运^的CLEC’s(“交聯(lián)酶結(jié)晶”)形式使用該酶。其它的方法包括使用所謂的“結(jié)晶酶(crystalline enzyme)”嗜熱菌蛋白酶和PDF。
在替代情況下，可以使用PDF’s的遺傳工程突變體，該突變體具有(可以接受的，在優(yōu)選情況下不變甚至增強的)對去甲?；磻?yīng)的活性，但在存在嗜熱菌蛋白酶的情況下較不易失活。這些突變體可通過多種不同的方法產(chǎn)生；例如，通過定點誘變，位點特異的隨機誘變，區(qū)域特異的隨機誘變和完全的隨機誘變；后一形式的誘變作為定點進化較為人知。進行這些不同的蛋白工程途徑的通用方法為技術(shù)人員所熟知。如果使用了一種隨機途徑，該突變循環(huán)將需要隨后的抗性和活性突變體的選擇，這樣便完成了對不再含有嗜熱菌蛋白酶識別位點的合適的突變體的鑒別。為獲得完全抵抗嗜熱菌蛋白酶降解的PDF突變體，不同蛋白質(zhì)工程途徑的組合和/或多輪的隨機誘變表現(xiàn)為最有效的程序。
反之亦然，可以制造嗜熱菌蛋白酶的突變體，該突變體具有(可以接受的，在優(yōu)選情況下不變甚至增強的)偶聯(lián)活性，但對PDF’s的滅活較小。
另一個用于避免嗜熱菌蛋白酶和PDF的相互滅活的合適的方法是在兩種酶之間使用物理屏障，該屏障防止兩種酶直接接觸但允許反應(yīng)物和產(chǎn)物幾乎無阻礙地運輸。適當?shù)奈锢砥琳系囊粋€例子是截留值為約10kDa的透析膜，其中嗜熱菌蛋白酶同用于偶聯(lián)反應(yīng)的底物部分存在于膜的一側(cè)， 而PDF和反應(yīng)產(chǎn)物部分存在于其另一側(cè)。
作為上述對用于α-APM合成的適當?shù)倪B續(xù)酶促方法的探索的結(jié)果，本發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了該連續(xù)法的構(gòu)思，即一個酶促偶聯(lián)反應(yīng)和同時的對偶聯(lián)產(chǎn)物的去甲酰基化的結(jié)合，該構(gòu)思除用于α-APM的合成之外具有更廣泛更基本的應(yīng)用。
因此，本發(fā)明在其最廣泛的范圍內(nèi)還涉及到從兩種起始材料進行的二或寡肽或其衍生物的新的連續(xù)法合成，該起始材料的第一種為N-甲酰保護的氨基酸，該氨基酸能同第二種氨基酸或其衍生物或同二或寡肽或其衍生物進行酶促偶聯(lián)反應(yīng)，這樣產(chǎn)生了一種N-甲酰基保護的反應(yīng)化合物，其中第一種起始材料的N-甲酰基保護基團在同第二種起始材料的酶促偶聯(lián)反應(yīng)中被保留，其所述的保護基團使用一種酶從反應(yīng)化合物中酶裂解，該酶具有甲?；琢虬滨ｋ娜ゼ柞；富钚院鸵环N二價金屬輔基離子，該金屬離子選自元素周期表的5-11族金屬，該基團從該反應(yīng)物裂解的速率遠遠高于從第一種起始材料裂解的速率，即至少高10×以上，其中對起始材料之間的酶促偶聯(lián)反應(yīng)和反應(yīng)化合物的酶促去甲酰基化同時涉及到兩種酶。
以下表1所示為這樣的酶，起始材料(和其保護基)和最終產(chǎn)物的組合的例子。
表1
本發(fā)明將通過以下實施例和比較實施例闡明。然而，本發(fā)明的范圍決不限于所示的實施例。PDF(Fe2+)的分離所使用的方法的詳細討論的參考見Groche等，BBRC 246，342-346(1998)。以下段落給出了其概要；縮寫見下文解釋。
一種EC3.5.1.27PDF(Fe2+)酶從過量生產(chǎn)的E.coli細胞中被分離，該細胞在1.6 L TB培養(yǎng)基中30℃下生長14-16小時。約13g菌體(濕重)被懸浮于26ml緩沖液(20mM Hepes/KOH，100mM KF，pH7.7，補充以10μg/ml來自牛肝的過氧化氫酶(BoehringerMannheim)和1mM AEBSF)，在0℃下超聲破碎(Branson B12，20分鐘)并以200,000g離心1小時。清亮的上清(1.3g蛋白；根據(jù)biuete反應(yīng))同pH調(diào)至7.7的1.3ml 10％(w/v)Polymin G-35(BASF)相混合并以40,000g離心10分鐘。該上清被用于20ml Met-Lys-Sepharose柱，該柱已經(jīng)用20mM Hepes/KOH，100mM KF，0.2mM TCEP，pH7.7平衡過。經(jīng)過以120ml的20mM Hepes/KOH，100mM KF，0.2mM TCEP，pH7.7洗柱后，該PDF(Fe2+)被150ml的20mM Hepes/KOH，100mM KCl，0.2mM TCEP，pH7.7洗脫出來。含蛋白的流分使用AmicoPM10膜進行超濾濃縮(產(chǎn)量140mg蛋白，具有活性800IU/mg；分析條件5mM甲?；琢虬彼岜彼幔?0℃，pH＝7.2)。調(diào)整TCEP濃度至1mM，蛋白質(zhì)含量至40mg/ml后，PDF(Fe2+)被-60℃凍存。TB培養(yǎng)基 12g/l Bacto-胰蛋白胨，Difco；24g/l酵母抽提物，ifco；4g/l甘油；2.3g/l KH2PO4；12.5g/l K2HPO4；HepesN-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙烷硫酸；AEBSF2-氨基乙基-對-苯磺酰氟；TECP 三-(2-羧乙基)-膦。起始材料和反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC分析所有化合物的分析均以反相HPLC柱(Nuleosil 300-5 C184.6mm×250mm；Macherey-Nagel，Düren)進行，該分析在室溫下使用0-24％(體積比)的0.1％(體積比)三氣乙酸水滲液中的乙腈的線性梯度(30分鐘內(nèi))，流速為1毫升/分鐘。所有的化合物以UV分光光度計在254nm的波長下檢測。去甲?；磻?yīng)去甲?；磻?yīng)(實施例1-3，以及比較實施例A-C)如下進行表2所示的各實施例的化合物(100mM)在100mM 2-(N-嗎啉子)-乙磺酸(MES)/KOH，pH＝6.2緩沖水溶液和250mM KCl存在下在37℃下溫育。該實施例和比較實施例A-C的反應(yīng)通過加入按上文制備的PDF(Fe2+)至最終濃度為0.2mM而起始。在不同的時間取出樣品(5μl)并同45μl HClO4(終濃度為體積比2％)混合終止反應(yīng)以測量去甲?；幕衔?含一個自由的氨基)的濃度。在簡短的離心后，根據(jù)Fields的方法(酶學(xué)方法(Method in Enzymology)，25 464-468(1972))以三硝基苯磺酸(TNBS)測定在上清中的去甲?；衔锏牧?，該測定使用ε420＝21.2mM-1cm-1。各時間點的(去甲?；?化合物的量通過原有的自由氨基化合物的量來校正，后者通過進行不加PDF的溫育中來檢測。反應(yīng)化合物的鑒別還通過HPLC分析來證實(如上所述)。
該結(jié)果在表2中概述。所示的該產(chǎn)物產(chǎn)量為反應(yīng)10小時后的產(chǎn)量。在實施例1和2中顯示去甲?；磻?yīng)可持續(xù)至轉(zhuǎn)化率超過90％。
另外，在F-α-AP和F-α-APM的去甲?；磻?yīng)中該PDF的催化特性(特別是對于F-α-APM進行的1小時和對于F-α-AP進行的3小時的去甲?；某跏挤磻?yīng)速率)通過在2-140mM的不同的底物濃度下進行實施例1和2的反應(yīng)來測定。特別測定了該酶的以下催化特性KM[mM]Michaelis常數(shù)(其為反應(yīng)速率為觀察到的最大速率的50％時的底物濃度)Kcat[min-1]轉(zhuǎn)換數(shù)Kcat/KM[M-1sec-1]催化系數(shù)(又稱特異性常數(shù))表2還給出了測定的值。
進行了以下的實施例和比較實施例實施例1PDF(Fe2+)在用F-α-APM合成α-APM中的使用實施例2PDF(Fe2+)在用F-α-AP合成α-AP中的使用實施例3PDF(Fe2+)在用F-αβ-APM(注100mM F-α-APM，25mM F-β-APM)合成α-APM中的使用比較實施例APDF(Fe2+)在F-β-APM去甲?；械氖褂帽容^實施例BPDF(Fe2+)在F-β-AP去甲?；械氖褂帽容^實施例APDF(Fe2+)在F-Asp去甲酰基化中的使用表2酶PDF(Fe2+)
*)在該實施例中未觀察到F-β-APM對酶對F-α-APM的活性的抑制。比較例D青霉素酰基轉(zhuǎn)移酶在用F-α-APM合成α-APM中的應(yīng)用。
與上述實施例稍有不同，該實驗如下實施將1g F-α-APM溶于25ml蒸餾水，通過加入0.1M NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH至6.5。隨后加入一種固定化青霉素?；D(zhuǎn)移酶制劑0.2g。反應(yīng)混合物在37℃下靜置48小時。在反應(yīng)期間按有規(guī)律的時間間隔取樣并使用α-APM作為參照物以薄層色譜分析該樣品。所取的樣品中沒有一個被證明由F-α-APM形成了α-APM。實施例4由F-Asp和L-PM進行α-APM的連續(xù)式酶促合成在室溫下攪拌緩沖溶液中的5mg/ml的CLEC-嗜熱菌蛋白酶(PeptiCLEC-TR，來自Altus Biologics Inc.，Cambridge，USA)，該緩沖溶液含有100mM MES/KOH(pH＝6.2)，1.7MNaCl，10mM CaCl2，1M F-Asp和100mM L-PM。起始偶聯(lián)反應(yīng)并持續(xù)反應(yīng)大約3-4小時直至F-α-APM濃度水平達到約11mM。隨后向反應(yīng)混合物中加入8mg/ml按上文敘述制備的PDF(Fe2+)并繼續(xù)反應(yīng)20小時以上。在所述的期間內(nèi)，F(xiàn)-α-APM的濃度降至大約7mM，此期間觀察到19mMα-APM的逐步形成。在24小時L-PM的量為55mM，所形成的L-Phe的量為18mM；在那時也存在3mM的α-APM的哌嗪二酮。這樣便表明經(jīng)PDF(Fe2+)的處理，該偶聯(lián)反應(yīng)的平衡被移向右側(cè)并且同時在該邊連續(xù)式方法中形成了α-APM。進一步表明，該反應(yīng)在所述的24小時后還在進行；這樣便可獲得更高產(chǎn)量的α-APM。
權(quán)利要求
1.通過對N-甲?；?α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸化合物進行酶促去甲?；瘉砗铣搔?L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯的方法，其特征在于N-甲?；?α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸或其甲酯經(jīng)一種酶的處理，該酶具有甲?；琢虬滨ｋ娜ゼ柞；富钚院鸵环N二價金屬離子輔基，該金屬離子選自元素周期表的5-11族金屬。
2.權(quán)利要求1的方法，其特征在于該具有甲?；琢虬滨ｋ娜ゼ柞；富钚缘拿笧榫哂嘘P(guān)于EC 3.5.1.27的描述的活性的酶。
3.權(quán)利要求1或2的任一方法，其特征在于該具有甲?；琢虬滨ｋ娜ゼ柞；富钚缘拿赴蛄?i)HEXXH，(ii)EGCLS和(iii)GXGXAAXQ。
4.權(quán)利要求1-3的任一方法，其特征在于該具有甲酰基甲硫氨酰肽去甲?；富钚缘拿缚色@自大腸桿菌。
5.權(quán)利要求1-4的任一方法，其特征在于該二價金屬離子為錳，鐵，鈷和鎳離子。
6.權(quán)利要求5的方法，其特征在于該二價金屬離子為鐵和/或鎳離子。
7.權(quán)利要求6的方法，其特征在于該二價金屬離子為鐵離子并且所有用具有甲?；琢虬滨ｋ娜ゼ柞；富钚缘拿高M行的處理均在一種穩(wěn)定化試劑的存在下進行。
8.權(quán)利要求7的方法，其特征在于該穩(wěn)定化試劑為過氧化氫酶或一種三烷基膦化合物或其衍生物。
9.權(quán)利要求8的方法，其特征在于該穩(wěn)定化試劑為過氧化氫酶。
10.用于通過對N-甲?；?α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸化合物進行酶促去甲酰基化來制備和回收α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯的方法，其特征在于(i)N-甲?；?α和N-甲酰基-β-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的一種混合物，或(ii)N-甲酰基-α和N-甲?；?β-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯的一種混合物經(jīng)過一種具有甲?；琢虬滨ｋ娜ゼ柞；富钚院鸵环N二價金屬離子輔基的酶的處理，分別形成α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸或其甲酯，該金屬離子選自元素周期表的5-11族金屬，當α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸在去甲?；襟E中形成時隨后進行了對苯丙氨酸羧酸基團的甲基化步驟，并且回收α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯。
11.權(quán)利要求10的方法，其特征在于具有甲?；琢虬滨ｋ娜ゼ柞；富钚缘拿笧榫哂嘘P(guān)于EC 3.5.1.27的描述的活性的酶。
12.權(quán)利要求10或11的任一方法，其特征在于該具有甲酰基甲硫氨酰肽去甲?；富钚缘拿赴行蛄?i)HEXXH，(ii)EGCLS和(iii)GXGXAAXQ。
13.權(quán)利要求10-12的任一方法，其特征在于該具有甲酰基甲硫氨酰肽去甲?；富钚缘拿缚色@自大腸桿菌。
14.權(quán)利要求10-13的任一方法，其特征在于該二價金屬離子為錳，鐵，鈷和鎳離子。
15.權(quán)利要求14的方法，其特征在于該二價金屬離子為鐵和/或鎳離子。
16.權(quán)利要求15的方法，其特征在于該二價金屬離子為鐵離子并且所有用具有甲?；琢虬滨ｋ娜ゼ柞；富钚缘拿高M行的處理均在一種穩(wěn)定化試劑的存在下進行。
17.權(quán)利要求16的方法，其特征在于該穩(wěn)定化試劑為過氧化氫酶或一種三烷基膦化合物或其衍生物。
18.權(quán)利要求17的方法，其特征在于該穩(wěn)定化試劑為過氧化氫酶。
19.通過對N-甲?；?α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸化合物進行酶促去甲?；瘉砗铣搔?L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯的方法，其特征在于使用嗜熱菌蛋白酶作為連接酶將N-甲?；?L-天冬氨酸同L-或D，L-苯丙氨酸甲酯酶促偶聯(lián)，并且同時在相同的反應(yīng)器中，通過偶聯(lián)反應(yīng)形成的N-甲?；?α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯通過一種存在于用于酶促偶聯(lián)反應(yīng)的反應(yīng)體系中的具有甲酰基甲硫氨酰肽去甲?；富钚院鸵环N二價金屬離子輔基的酶的處理去甲酰基化，該金屬離子選自元素周期表的5-11族金屬。
20.權(quán)利要求19的方法，其特征在于所形成的α-APM在反應(yīng)進行至轉(zhuǎn)化率大于40％后被回收。
21.權(quán)利要求19或20的任一方法，其特征在于具有甲?；琢虬滨ｋ娜ゼ柞；富钚缘拿笧榫哂嘘P(guān)于EC 3.5.1.27的描述的活性的酶。
22.權(quán)利要求19-21的任一方法，其特征在于該具有甲酰基甲硫氨酰肽去甲?；富钚缘拿赴行蛄?i)HEXXH，(ii)EGCLS和(iii)GXGXAAXQ。
23.權(quán)利要求19-22的任一方法，其特征在于該具有甲?；琢虬滨ｋ娜ゼ柞；富钚缘拿妇哂袑?寡)肽的去甲?；钚?，該(寡)肽在其N-末端具有N-甲酰基甲硫氨酸，該活性比其對N-甲酰基甲硫氨酸的去甲?；钚愿咧辽?0倍，在優(yōu)選情況下高至少100倍，在最優(yōu)選情況下高至少200倍。
24.權(quán)利要求19-23的任一方法，其特征在于該具有甲酰基甲硫氨酰肽去甲酰基酶活性的酶可獲自大腸桿菌。
25.權(quán)利要求19-24的任一方法，其特征在于該二價金屬離子為錳，鐵，鈷和鎳離子。
26.權(quán)利要求25的方法，其特征在于該二價金屬離子為鐵和/或鎳離子。
27.權(quán)利要求26的方法，其特征在于該二價金屬離子為鐵離子并且所有用具有甲?；琢虬滨ｋ娜ゼ柞；富钚缘拿高M行的處理均在一種穩(wěn)定化試劑的存在下進行。
28.權(quán)利要求27的方法，其特征在于該穩(wěn)定化試劑為過氧化氫酶或一種三烷基膦化合物或其衍生物。
29.權(quán)利要求28的方法，其特征在于該穩(wěn)定化試劑為過氧化氫酶。
30.用于從兩種起始材料合成二或寡肽或其衍生物的方法，該起始材料的第一種為N-甲酰保護的氨基酸，該氨基酸能同第二種氨基酸或其衍生物或同二或寡肽或其衍生物進行酶促偶聯(lián)反應(yīng)，這樣產(chǎn)生了一種N-甲?；Ｗo的反應(yīng)化合物，其中第一種起始材料被N-甲酰基保護的基團在同第二種起始材料的酶促偶聯(lián)反應(yīng)期間被保留，其所述的保護基團使用一種酶從反應(yīng)化合物中酶促裂解，該酶具有甲酰基甲硫氨酰肽去甲?；富钚院鸵环N二價金屬離子輔基，該金屬離子選自元素周期表的5-11族金屬，該基團從該反應(yīng)物裂解的速率遠遠高于從第一種起始材料裂解的速率，即至少高10倍以上，其中對起始材料之間的酶促偶聯(lián)反應(yīng)和反應(yīng)化合物的酶促去甲?；瑫r涉及兩種酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及α－L－天冬氨?；璍－苯丙氨酸甲酯的合成,該合成涉及到通過一種酶對一種N－甲?；粒璍－天冬氨?；璍－苯丙氨酸甲酯化合物的酶促去甲酰基化,該酶具有甲?；琢虬滨ｋ娜ゼ柞；富钚院鸵环N元素周期表的5－11族二價金屬離子作為輔基。本發(fā)明還涉及到通過用這樣的酶處理從N－甲?；粒挺拢璍－天冬氨酰基－L－苯丙氨酸化合物的混合物中選擇性制備和回收α－L－天冬氨?；璍－苯丙氨酸甲酯。最后,本發(fā)明涉及從N－甲?；璍－天冬氨酸和L－或D,L－苯丙氨酸甲酯合成α－L－天冬氨?；璍－苯丙氨酸甲酯的連續(xù)式酶促合成方法,該方法涉及與一種酶促偶聯(lián)反應(yīng)同時的一種酶促去甲?；磻?yīng),本發(fā)明還一般涉及通過同時進行的酶促偶聯(lián)和去甲?；磻?yīng)的連續(xù)式二或寡肽合成。
文檔編號C07K5/075GK1335851SQ99816316
公開日2002年2月13日 申請日期1999年12月20日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月22日
發(fā)明者P·J·L·M·奎德弗利格, T·松克, A·F·V·瓦格納 申請人:荷蘭加甜劑公司