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救必應(yīng)酸在制備抗流感病毒藥物中的應(yīng)用的制作方法

文檔序號:11239923閱讀:1615來源:國知局

本發(fā)明公開了救必應(yīng)酸的新用途,具體為救必應(yīng)酸在制備抗流感病毒藥物中的應(yīng)用。



背景技術(shù):

流行性感冒病毒(簡稱流感病毒)可引起急性呼吸道感染,會(huì)對人類的健康造成威脅。其中,甲型流感病毒由于抗原性易發(fā)生變異,由其引發(fā)的甲型h1n1流感具有流行面廣、傳染性強(qiáng)、發(fā)病率高等特點(diǎn)。目前,應(yīng)對流感病毒主要是通過疫苗和藥物治療。其中,m2離子通道抑制劑金剛烷胺類以及神經(jīng)氨酸酶抑制劑是許多國家在臨床上常用的抗流感病毒藥物,但是這兩類抗病毒藥物現(xiàn)在均出現(xiàn)不同程度的耐藥性,且有一定的毒副作用。因此,尋找新的、高效低毒的抗流感病毒藥物顯得十分重要和緊迫。

救必應(yīng)酸(分子式為c30h48o5),可提取自冬青科冬青屬植物鐵冬青ilexrotundathunb.的干燥樹皮,其原料中藥救必應(yīng)來源豐富,低廉,顯示出救必應(yīng)酸良好的藥物應(yīng)用前景。

救必應(yīng)酸屬五環(huán)三萜化合物,具有五環(huán)三萜母核。五環(huán)三萜類化合物的結(jié)構(gòu)通式為:

式中,r為cooh、coo―β―d―葡萄糖基或其他藥學(xué)上可接受的基團(tuán)。當(dāng)式中的r為cooh時(shí),化合物名為救必應(yīng)酸(rotundicacid)。

目前,專利文獻(xiàn)cn101856357a公開了救必應(yīng)酸具有防治心腦血管疾病,包括心絞痛、心肌梗死、腦梗死的作用。專利文獻(xiàn)cn102391352a公開了救必應(yīng)酸的氨基酸衍生物具有體外抗腫瘤活性。但尚未見關(guān)于救必應(yīng)酸抗流感病毒作用的研究報(bào)道。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

本發(fā)明目的在于公開救必應(yīng)酸的新藥用用途,具體涉及救必應(yīng)酸在制備抗流感病毒藥物中的應(yīng)用。包括h1n1流感病毒。

并進(jìn)一步公開,救必應(yīng)酸在制備治療由流感病毒引起的肺炎藥物中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明首次公開救必應(yīng)酸在制備抗流感病毒藥物中的新用途。經(jīng)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),證明救必應(yīng)酸抗h1n1流感病毒的ic50值為5.8μg/ml,與陽性藥利巴韋林作用相當(dāng)。小鼠流感模型藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí),救必應(yīng)酸可顯著降低流感感染小鼠的肺指數(shù),并且對h1n1呈現(xiàn)一定的量效特征。

具體實(shí)施方式

為更好理解本發(fā)明內(nèi)容,下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的內(nèi)容作進(jìn)一步說明,但本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容不局限于以下實(shí)施例。

實(shí)施例1救必應(yīng)藥材提取物的制備

取救必應(yīng)藥材適量,粉碎,過1號篩,藥材加8倍量70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇,加熱回流提取2次,每次1h,過濾,合并提取液,置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中,在80℃下減壓濃縮至稠膏狀。將濃縮液轉(zhuǎn)移置減壓干燥箱中,在80℃下繼續(xù)進(jìn)行干燥、粉碎,即得救必應(yīng)藥材提取物。

實(shí)施例2體外流感病毒抑制實(shí)驗(yàn)

1.實(shí)驗(yàn)材料

1.1受試藥物:救必應(yīng)酸(從救必應(yīng)中提取得到,純度>98%)。

1.2對照藥物:利巴韋林,齊墩果酸,救必應(yīng)藥材提取物(見實(shí)施例1)

1.3病毒株:甲型h1n1流感病毒鼠肺適應(yīng)株(fm/1/47株)。雞胚傳代,bsl-3(生物安全實(shí)驗(yàn)室三級)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)檢測,分裝,-80℃保存。

1.4細(xì)胞模型:狗腎細(xì)胞mdck細(xì)胞

上述藥物均經(jīng)二甲基亞砜(dmso)充分溶解后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.實(shí)驗(yàn)方法

2.1病毒毒力的測定

將mdck細(xì)胞按5×104/ml濃度接種96孔培養(yǎng)板,每孔100μl,37℃、5%co2培養(yǎng),形成細(xì)胞單層鋪滿狀態(tài)。將100μl10倍系列稀釋得到的6個(gè)濃度的病毒液,依次接種到長滿單層mdck細(xì)胞層的96孔板中,同時(shí)設(shè)細(xì)胞對照。37℃、5%co2病毒培養(yǎng)箱中培養(yǎng),逐日用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞病變(cpe),連續(xù)觀察3天,用mtt法進(jìn)行檢測,在酶標(biāo)儀570nm波長測定吸光度od值,用reed-muench法計(jì)算病毒半數(shù)感染劑量(tcid50),每濃度設(shè)8個(gè)復(fù)孔,整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

測定結(jié)果:mdck細(xì)胞受到流感病毒攻擊后,細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡,在細(xì)胞形態(tài)學(xué)上主要表現(xiàn)為細(xì)胞圓縮,核固縮,碎裂等,在細(xì)胞周圍形成典型的圓形凋小體。用reed-muench法計(jì)算結(jié)果得:病毒毒力tcid50為10-4.5。

2.2救必應(yīng)酸細(xì)胞毒性測定

取mdck細(xì)胞已長成單層的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,傾去培養(yǎng)液,用pbs洗滌2次,加入不含血清的dmem培養(yǎng)基連續(xù)2倍系列稀釋(488μg/ml-3.81μg/ml)的救必應(yīng)酸藥液,100μl/孔,每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔,設(shè)正常細(xì)胞對照4孔。37℃、5%co2病毒培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h,用mtt法進(jìn)行檢測,在570nm波長下測出各實(shí)驗(yàn)組與細(xì)胞對照組的吸收度。以對照孔為參照,計(jì)算各實(shí)驗(yàn)孔細(xì)胞的活力比值。根據(jù)reed-muench法計(jì)算細(xì)胞毒性濃度cc50,整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

測定結(jié)果:救必應(yīng)酸的細(xì)胞半數(shù)毒性濃度cc50>488μg/ml。

2.3救必應(yīng)酸抗h1n1活性測試

取mdck細(xì)胞已長成單層的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,傾去培養(yǎng)液,用pbs洗滌2次,加入100tcid50病毒液,100μl/孔,37℃、5%co2吸附2h。加入不含血清的dmem培養(yǎng)基連續(xù)2倍系列稀釋(244μg/ml-3.81μg/ml)的救必應(yīng)酸藥液,同時(shí)設(shè)病毒對照組、細(xì)胞對照組、陽性藥組、救必應(yīng)藥材提取物組和齊墩果酸組。在37℃、5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h后,用mtt法進(jìn)行檢測,用酶標(biāo)儀測570nm波長處的吸光度od值。按下述公式計(jì)算藥物對病毒的抑制率:病毒抑制率(%)=(藥物處理組od均值-病毒對照組od均值)/(細(xì)胞對照組od均值-病毒對照組od均值)×100%,根據(jù)reed-muench法計(jì)算藥物對流感病毒致cpe產(chǎn)生50%抑制的濃度,即半數(shù)抑制濃度ic50,整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果:根據(jù)mtt結(jié)果,采用reed-muench法計(jì)算救必應(yīng)酸的半數(shù)抑制濃度ic50為5.8μg/ml,齊墩果酸的半數(shù)抑制濃度ic50為37.5μg/ml,救必應(yīng)藥材提取物的半數(shù)抑制濃度ic50>244μg/ml。陽性藥物利巴韋林的半數(shù)抑制濃度ic50為6.8μg/ml。

結(jié)論:救必應(yīng)酸在對h1n1流感病毒具有較強(qiáng)的抑制作用,其ic50值與利巴韋林ic50值大小接近,且比齊墩果酸以及救必應(yīng)藥材提取物ic50值都要小,證明救必應(yīng)酸對h1n1流感病毒的抑制作用與陽性對照藥物利巴韋林相當(dāng),且強(qiáng)于齊墩果酸和救必應(yīng)藥材提取物。

實(shí)施例3體內(nèi)流感抑制實(shí)驗(yàn)

1.實(shí)驗(yàn)材料

1.1受試藥物:救必應(yīng)酸(從救必應(yīng)中提取得到,純度>98%)。

1.2對照藥物:達(dá)菲,齊墩果酸,救必應(yīng)藥材提取物(見實(shí)施例1)

1.3病毒:甲型h1n1流感病毒鼠肺適應(yīng)株(fm/1/47株)。雞胚傳代,bsl-3(生物安全實(shí)驗(yàn)室三級)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)檢測,分裝,-80℃保存。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

balb/c小鼠體重18g-22g,80只,購自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

3.實(shí)驗(yàn)方法

將balb/c小鼠隨機(jī)分為8組,分別為空白對照組、模型對照組、達(dá)菲對照組、齊墩果酸組、救必應(yīng)藥材提取物組、救必應(yīng)酸高、中、低3個(gè)劑量組,每組10只。除空白對照組外,各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物用乙醚輕度麻醉,以15個(gè)ld50的fm1流感病毒液滴鼻感染,每只35μl。感染前一天開始灌胃給藥,每次按0.2ml/10g體重灌胃,每天1次,連續(xù)給藥5天。空白組和模型對照組在同等條件下灌胃給予等體積蒸餾水。第6天稱重后解剖,取肺,稱重量,計(jì)算肺指數(shù)與肺指數(shù)抑制率。

計(jì)算公式:肺指數(shù)=肺質(zhì)量(g)/體重(g)×100%;肺指數(shù)抑制率=(模型對照組平均肺指數(shù)-實(shí)驗(yàn)組平均肺指數(shù))/模型對照組平均肺指數(shù)×100%數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)方法:肺指數(shù)用平均值±sd值表示,組間比較采用單因素方差分析;采用spss19.0軟件處理數(shù)據(jù)。

4.實(shí)驗(yàn)結(jié)論

肺指數(shù)值越大,表示肺炎越嚴(yán)重。由表1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,本發(fā)明的救必應(yīng)酸能夠顯著降低流感感染小鼠的肺指數(shù),且對h1n1呈現(xiàn)一定的量效特征,表明救必應(yīng)酸對流感病毒具有防治作用。此外,救必應(yīng)酸對于流感病毒的防治效果明顯強(qiáng)于齊墩果酸與救必應(yīng)藥材提取物。本發(fā)明所述的救必應(yīng)酸可作為活性成分制備用于抗流感病毒的藥物。

表1藥物對流感病毒fm/1/47株感染小鼠肺炎模型肺指數(shù)的影響(n=10)

注:##與空白對照組比較,p<0.05,**與模型對照組比較,p<0.01。

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