流感核蛋白疫苗的制作方法
【專利說明】流感核蛋白疫苗
[0001] 背景
[0002] 存在改進(jìn)流感疫苗的需要。目前針對(duì)流感的疫苗策略集中在生成針對(duì)血凝素的穩(wěn) 固的抗體（體液的）反應(yīng)。由于在一年的過程中循環(huán)流感病毒株中高度的抗原性漂移，對(duì) 于每個(gè)流感季必須特定地重新配制疫苗株。雖然年度（或季度）流感疫苗對(duì)于不同年齡類 別的變化程度是成功的，顯然對(duì)于年幼和年老者特別需要更有效的保護(hù)。此外，存在再造病 毒會(huì)進(jìn)化的重大、永久的風(fēng)險(xiǎn)，其在稱為"抗原性漂移"的過程中獲得非常不同的HA(血凝 素）基因。這會(huì)產(chǎn)生公共健康緊急情況，因?yàn)槟壳暗牧鞲幸呙缁旧弦蕾囉贖A抗原。
[0003] 流感病毒是病毒的正粘病毒科（Orthomyxoviridae)中一種有包膜的、單鏈、負(fù)鏈 RNA病毒，分為3個(gè)主要類型A、B和C。流感A病毒感染多種多樣的動(dòng)物，包括人、鳥類、豬、 馬、蝙蝠等等，盡管任何特定的流感病毒的趨向性通常高度適應(yīng)于特定宿主。流感B病毒感 染較小數(shù)目的物種，即人和海豹，但仍然是年度流行性感冒的重要原因。大多數(shù)人流感感染 是通過流感病毒A或B引起的；而感染人和豬的流感C病毒罕見導(dǎo)致嚴(yán)重的人感染或流行 (Lamb)〇
[0004] 目前失活的流感病毒疫苗誘導(dǎo)抵御緊密相關(guān)的病毒株的抗體。目前得到許可的疫 苗主要誘導(dǎo)針對(duì)血凝素（HA)的菌株-特異性的中和抗體，病毒表面上的主要抗原性決定簇 其為高免疫原性的，并可預(yù)防由匹配病毒株的感染引起的疾病。然而，HA具有重要的抗原 變異，其排除其單獨(dú)用于經(jīng)設(shè)計(jì)以提供光譜防護(hù)（broadprotection)的疫苗。為此，針對(duì) 較少可變的靶物生成保護(hù)反應(yīng)的可替換的疫苗策略是非常感興趣的。
[0005] 用流感A病毒的天然感染誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫性兩者。持久的細(xì)胞免疫性主要針 對(duì)保守的、內(nèi)部病毒蛋白，如核蛋白（NP)。在天然感染后NP抗原在人中是免疫原性的，但誘 導(dǎo)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞具有短的壽命（McMichaela，McMichaelb)。
[0006] 針對(duì)NP的細(xì)胞免疫性是有價(jià)值的，因?yàn)槠溽槍?duì)NP表位的不同變體，且靶向NP的 DNA疫苗在動(dòng)物中具有誘導(dǎo)的交叉-保護(hù)的免疫性（Schotsaert)。
[0007] 核蛋白（NP)抗原已長(zhǎng)期被識(shí)別為高度保守的抗原：甚至是最歧化的（divergent) 流感病毒A株在它們編碼的NP蛋白中共享90%同一性（Gorman，Xu)。對(duì)NP的抗原性變化 是罕見的且僅僅在較小程度發(fā)生（Stanekovd)。 現(xiàn)有技術(shù)
[0008] 使用核蛋白作為疫苗中的抗原
[0009] 流感核蛋白用作抗原描述于1980年代（Wraith)。小鼠中針對(duì)NP的細(xì)胞免疫響應(yīng) 能夠誘導(dǎo)免疫性，且能夠顯著地產(chǎn)生針對(duì)分歧的A型病毒的交叉保護(hù)。顯示用由H3N2病毒 純化的NP免疫小鼠可提供免于致死性異源（H1N1)攻擊的實(shí)質(zhì)保護(hù)（75%)，但它不能防止 感染。
[0010] 使用NP基因的DNA疫苗已知20年：將它們用于第一"概念證明"實(shí)驗(yàn)用于DNA免 疫本身（Ulmer)。
[0011] NP從病毒載體的表達(dá)首次在1980年代證明（Yewdell1985)，且用此載體免疫與 細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞針對(duì)分歧的流感病毒A株而非B株與DNA疫苗相比改進(jìn)的生成相關(guān)。
[0012] 自此，已顯示用表達(dá)PR8核蛋白的MVA載體免疫小鼠保護(hù)它們抵御異亞型流感病 毒（Altstein)的低劑量攻擊。更近些，已將一種編碼融合于Ml蛋白的NP蛋白的病毒載體 用于免疫人（Lillie,Berthoud，Antrobus)。這些研究顯著地顯示：當(dāng)體液反應(yīng)通過免疫衰 老（immunosenescence)下降時(shí)，對(duì)于NP的細(xì)胞免疫響應(yīng)可在較年長(zhǎng)的人中被實(shí)質(zhì)地增強(qiáng) (Antrobus)〇
[0013] 核蛋白的分泌
[0014] 一些研究已表明NP蛋白起初位于核中，減少這些DNA疫苗的免疫原性 (Stanekovd)〇
[0015] 改進(jìn)的針對(duì)NP的細(xì)胞免疫響應(yīng)可通過強(qiáng)制分泌NP，例如通過將tPA信號(hào)肽融合于 NP基因（Luo)、通過配制DNA(Greenland,Sullivan)以及通過使用電穿孔（Laddy)以改進(jìn) DNA遞送來獲得。
[0016] 單體流感核蛋白
[0017] 單體抗原在與C4bp寡聚域的融合體中的優(yōu)選使用描述于專利申請(qǐng) TO2005/014654中。但單體化抗原使用中的風(fēng)險(xiǎn)是它們降低的免疫原性。這由Bachmann和 同事用水泡性口膜炎病毒的糖蛋白G證明（Bachmann1993)，并且用于流感抗原神經(jīng)氨酸 酶，或NA，由Fiers和同事證明（Fiers2001)。可預(yù)期的是減少或去除來自流感核蛋白的 更高級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)降低它們的免疫原性。
[0018] 已顯示多種突變使流感核蛋白轉(zhuǎn)變，其自然寡聚化為單體形式（Ye2006)。在此 2006文章中所述的NP的單體形式在更近期的文章中確認(rèn)為單體的（Tarus,Ye2012)。這 些文章中所述的賦予流感病毒A株的核蛋白單體的兩個(gè)點(diǎn)突變?cè)诹鞲胁《綛和C株的核蛋 白中是保守的（參見Nakada中圖3)。因此，可將相同的點(diǎn)突變引入流感病毒B和C株的核 蛋白，從而賦予這些其他流感核蛋白單體。但是沒有進(jìn)行單體核蛋白的免疫原性的研究。
[0019] 用NP抗原制備流感疫苗中的主要技術(shù)問題是誘導(dǎo)強(qiáng)而且持久的細(xì)胞免疫響應(yīng)。 所述"細(xì)胞免疫響應(yīng)"是一種免疫響應(yīng)，其不涉及抗體，但涉及抗原-特異性T-淋巴細(xì)胞 (且特別是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞）的活化和多種細(xì)胞因子響應(yīng)于抗原的釋放。CD4細(xì)胞或 輔助性T細(xì)胞通過分泌活化免疫響應(yīng)的細(xì)胞因子而提供針對(duì)不同病原體的保護(hù)。細(xì)胞毒性 T細(xì)胞（CD8)引起由于病原體的凋亡所致的死亡而不需使用細(xì)胞因子。
[0020] 盡管對(duì)于針對(duì)NP的CD4或CD8響應(yīng)是否對(duì)于保護(hù)是更重要的仍然有爭(zhēng)議 (Epstein)，但存在共識(shí)，即對(duì)于核蛋白的細(xì)胞反應(yīng)而非體液反應(yīng)對(duì)于此抗原可誘導(dǎo)的保護(hù) 是關(guān)鍵的（Thomas)。當(dāng)T細(xì)胞表位源自高度保守的NP蛋白時(shí)，通過引發(fā)強(qiáng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞 響應(yīng)提供保護(hù)的疫苗可為有用的（Epstein;Roy)。由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫響應(yīng)主要 通過識(shí)別流感病毒-感染的細(xì)胞、通過抑制病毒復(fù)制以及通過加速病毒清除而發(fā)揮功能。
[0021] 賦予免疫性所涉及的特異性T細(xì)胞包括⑶4+和⑶8+T細(xì)胞兩者，并常常分別通過 分泌的細(xì)胞因子和細(xì)胞裂解活性的作用來發(fā)揮它們的功能。流感NP-特異性CD8+CTL特別 能夠在針對(duì)小鼠中致死性流感病毒攻擊的異亞型保護(hù)性免疫性起重要作用（Gschoesser)， 包括流感病毒從上呼吸道粘膜表面的清除（Mbawuike)，促進(jìn)攻擊后的存活和恢復(fù) (Epstein)。最佳的基于NP的疫苗可改進(jìn)CD4和CD8細(xì)胞反應(yīng)兩者。
[0022] 本專利申請(qǐng)?zhí)峁┯糜诟倪M(jìn)對(duì)于流感病毒核蛋白的細(xì)胞免疫響應(yīng)的方法。
[0023] 發(fā)明簡(jiǎn)述
[0024] 本發(fā)明涉及用于增加來自流感病毒的NP抗原的免疫原性（特別是細(xì)胞免疫原性） 的方法，即，將來自流感病毒株A、B或C的NP抗原的至少一種變體融合于作為載體蛋白的 雞（chicken)C4bp寡聚化域的變體。
[0025] 本發(fā)明具體涉及融合蛋白，其包含來自流感病毒株A、B或C的NP抗原的至 少一個(gè)單體變體和具有如SEQIDN0:1中所示序列的載體蛋白IMX313,如專利申請(qǐng) W02007/062819 中所述。
[0026] 本發(fā)明具體涉及融合蛋白，該融合蛋白包含來自流感病毒株A的NP抗原的單體變 體，其呈現(xiàn)如SEQID勵(lì):2所示的￡3394和1?4164點(diǎn)突變，和0?313載體蛋白的變體，其具 有包含序列ZXBBBBZ的至少一個(gè)帶正電的肽的C-端取代，其中（i)Z是任何氨基酸或是缺 失的，（ii)X是任何氨基酸和（iii)B是精氨酸（R)或賴氨酸⑷，如SEQIDN0:3中所示， 如2013年12月11日提交的專利申請(qǐng)PCT/EP2013/076289中所述。頂X313載體蛋白的優(yōu) 選變體不誘導(dǎo)與魚精蛋白交叉反應(yīng)的抗體。
[0027] 本發(fā)明具體涉及融合蛋白，其包含NP抗原的單體變體，和修飾的載體蛋白 頂X313T或頂X313P，如分別在SEQIDN0:4和SEQIDN0:5中所示。
[0028] 本發(fā)明還涉及免疫原性組合物，其包含質(zhì)?；虿《据d體中的DNA序列，還包含信 號(hào)肽，如tPA，如SEQIDN0:6中所示。
[0029] 本發(fā)明還涉及編碼所述融合蛋白的重組DNA序列。
[0030] 本發(fā)明還涉及免疫原性組合物，其包含由質(zhì)?；虿《据d體編碼的DNA序列，或融 合蛋白，還包含用于胞內(nèi)TLRs的核酸配體或疫苗佐劑，如2013年12月11日提交的專利申 請(qǐng)PCT/EP2013/076289 中所述。
[0031] 本發(fā)明還涉及DNA質(zhì)粒、病毒載體、融合體或免疫原性組合物，其用作疫苗或免疫 療法，作為預(yù)防或治療流感的方法。
[0032] 發(fā)明詳述
[0033] 在詳細(xì)描述本發(fā)明之前，可理解的是本發(fā)明并不局限于具體例示的方法，并且當(dāng) 然可以變化。特別是，本發(fā)明涉及包含來自流感病毒的至少一個(gè)核蛋白抗原的融合蛋白，并 且不限于特定的流感核蛋白。
[0034] 本文引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)，無論是下文或上文，都通過提述以它們 的整體并入本文。然而，引用文本提及的出版物是為了描述和公開在所述出版物中報(bào)道的 并且可能相關(guān)于本發(fā)明使用的規(guī)程、試劑和載體。
[0035] 此外，除非另外指示，本發(fā)明的實(shí)施采用常規(guī)的蛋白純化和本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的 分子生物學(xué)技術(shù)。這些技術(shù)是技術(shù)人員已知的并且在文獻(xiàn)中充分地解釋。在所附權(quán)利要 求和本發(fā)明的連續(xù)描述中，除了由于表述語言或必需含意而上下文有另外要求外，單詞"包 含（comprise) "、"含有（contain) "、"包涵（involve)" 或"包括（include)" 或變型如"包 含（comprises) "、"包含（comprising)"、"含有（containing) "、"包涵（involved) "、"包括 (includes) "、"包括（including) "以涵蓋的意義使用，S卩，以詳明所述特征的存在，而不排 除其他特征在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案中的存在或添加。
[0036] 定義如下術(shù)語用于更好地理解本發(fā)明：
[0037] 流感病毒有三種類型A、B和C。此分類起初是血清學(xué)的：對(duì)流感病毒A核蛋白的 抗血清與其他A型病毒的核蛋白交叉反應(yīng)，但不與B型或C型病毒的那些交叉反應(yīng)。流感A病毒基于它們的血凝素（H)和神經(jīng)氨酸酶（N)糖蛋白的血清學(xué)交叉反應(yīng)進(jìn)一步分成多個(gè) 亞型。
[0038] "流感核蛋白"意指流感病毒的全部三種類型（A、B和C)的核蛋白。
[0039] "載體蛋白（carrierprotein) "通常指抗原與之綴合或融合并由此賦予更多免疫 原性的蛋白。本文該術(shù)語特定地在攜帶抗原的蛋白的涵義中使用。蛋白的功能在于增加與 之綴合或融合的所述抗原的免疫原性。
[0040] "NP的變體"指所有具有序列的蛋白，所述序列與來自流感病毒株A、B和C的流感 核蛋白的野生型形式具有至少90%的同一性。
[0041] "雞C4bp寡聚化域的變體"是2013年12月11日提交的專利申請(qǐng)W02007/062819 和PCT/EP2013/076289 (兩篇文獻(xiàn)通過提述并入本文）中所述的SEQIDNO: 1的C4bp域的 變體，特別是至少48個(gè)連續(xù)氨基酸的片段和/或與專利申請(qǐng)W02007/062819中所述的SEQ IDNO: 1具有至少70%氨基酸序列同一性（的變體）。
[0042] "頂X313載體蛋白的變體"描述于2013年12月11日提交的專利申請(qǐng)PCT/ EP2013/076289 中。
[0043] 魚精蛋白由一組具有4500道爾頓的平均分子量的從魚獲得的異源肽組成。魚精 蛋白的氨基酸組成的大約67%是精氨酸。它長(zhǎng)期用于配制胰島素（于中性魚精蛋白鋅胰島 素（NeutralProtamineHagedorn))，或用于中和肝素。
[0044] 術(shù)語"融合蛋白"指重組蛋白，其非天然存在，包含來自不同來源的已融合的兩個(gè) 域。更精確地，在本發(fā)明中，融合蛋白包含融合于雞C4bp寡聚化域的載體域變體（特別是 '頂X313T'或'頂X313P'）的流感核蛋白抗原。融合體具有產(chǎn)生同源產(chǎn)物的優(yōu)勢(shì)。更正式 地，"綴合"可描述為遺傳的：將編碼原-免疫原性載體蛋白的DNA剪接至編碼抗原的DNA。 可將抗原融合至載體蛋白的N-或C-端。
[0045] 本發(fā)明涉及免疫原性組合物，其包含流感核蛋白抗原的至少一個(gè)變體抗原和C4bp 寡聚化域的變體，并引發(fā)增加的針對(duì)流感核蛋白抗原的細(xì)胞免疫響應(yīng)。
[0046] 根據(jù)本發(fā)明，融合于雞C4bp寡聚化域的載體蛋白變體（特別是IMX313T或 頂X313P)的核蛋白可為來自流感病毒的任何類型（A、B或C)的核蛋白。
[0047] 可將核蛋白抗原融合于載體蛋白（特別是頂X313T或頂X313P)的N-或C-末端。
[0048] 根據(jù)本發(fā)明，至少一個(gè)核蛋白融合于一個(gè)載體蛋白，特別是頂X313T或頂X313P; 然而，兩個(gè)或多個(gè)核蛋白（相同的或不同的）可融合于相同的載體蛋白。
[0049] 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的方面，融合于雞C4bp寡聚化域的變體（特別是IMX313T 或頂X313P)的核蛋白抗原是單體抗原。實(shí)際上，使用單體抗原是有利的，如專利申請(qǐng)TO 2005/014654中所述，條件是單體化不減少它們的免疫原性。而且，NP在結(jié)晶中形成三聚體 (Ye2006)和體內(nèi)的其他寡聚體（Arranz,Moeller)。三聚或寡聚蛋白融合于七聚體蛋白如 頂X313T或頂X313P面臨產(chǎn)生空間沖突（stericclashes)的風(fēng)險(xiǎn)。另一方面，天然寡聚蛋 白的單體形式具有減少的免疫原性（Fiers)。
[0050] 為了獲得單體核蛋白抗原，本領(lǐng)域的技術(shù)人員知曉可引入NP抗原的蛋白序列以 誘導(dǎo)其單體化的不同的點(diǎn)突變。具體地，NP抗原呈現(xiàn)兩個(gè)下述點(diǎn)突變中的至少一個(gè)：E339A 和R416A。
[0051] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，NP抗原來自流感病毒株A。
[0052] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，NP抗原包含兩個(gè)點(diǎn)突變E339A和R416A，并且 因此為單體的。
[0053] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，NP抗原呈現(xiàn)如SEQIDN0:2中所示的多肽序列。
[0054] 對(duì)從DNA疫苗表達(dá)的抗原的增加