一種鴨疫里氏桿菌基因缺失株及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于動物細菌基因工程技術領域，涉及動物分子生物學、免疫學等相關領 域。具體涉及一種鴨疫里氏桿菌雙組份調控系統(tǒng)06537/06542基因缺失菌株及應用。
【背景技術】
[0002] 鴨疫里氏桿菌感染是由鴨疫里氏桿菌（Riemerellaanatipestifer，RA)引起雛鴨 的一種急性、接觸性、敗血性傳染病，由于該病的高發(fā)生率、高死亡率和預后的生長遲緩，在 我國肉鴨規(guī)?；B(yǎng)殖過程中已成為一個較為嚴重的問題。目前國外已報道有21個血清型， 在國內還發(fā)現(xiàn)了 4個新的血清型。目從我省分離鑒定的RA菌株中只發(fā)現(xiàn)了血清1型。目前 對于鴨疫里氏桿菌的毒力相關基因還知之甚少，已經(jīng)確定的毒力因子有外膜蛋白A(0mpA) 和二肽肽酶IV(DPPIV)。除此之外還有一些推測與毒力相關的因子。對RA的研究雖然取 得了一些進展，但其分子致病機理仍然不清楚。因此，加強RA分子生物學和致病機制的研 究，對從根本上防止該病的發(fā)生具有重要的現(xiàn)實意義。
[0003] 藥物治療是治療和預防家禽感染鴨疫里氏桿菌的主要方法，當前一般使用抗生素 和磺胺類藥物來預防和治療這種疾病，但是抗生素的廣泛使用容易導致耐藥菌株的出現(xiàn)。 由于RA的血清型復雜，不同地區(qū)的菌株對不同的藥物的使用效果也不同。因此在使用抗生 素前應對菌株進行相關藥敏測試，通過比較確定最佳用藥方案。而疫苗免疫方面，由于RA 的血清型較多，且不同血清型之間基本上沒有或只有非常低的交叉免疫保護力，因此世界 各國學者都致力于鴨疫里氏桿菌基因工程疫苗的研究，力求獲得一種更加安全、高效的新 型疫苗。
[0004]細菌基因工程疫苗是現(xiàn)代疫苗的發(fā)展方向之一。使用安全性高、毒力弱的基因工 程活疫苗作為疫苗有很多優(yōu)點：首先它可通過滴鼻或噴霧等方式接種，能激發(fā)機體產生有 效的黏膜免疫，同時也能激發(fā)機體的系統(tǒng)免疫；其次，它通過滴鼻或噴霧等方式接種，操作 簡便易行；三是其免疫原性好，能產生很好的保護力；四是基因工程活疫苗可對不同血清 型的鴨疫里氏桿菌產生保護力；五是生產方面，快速經(jīng)濟，適合在基層大面積推廣；六是它 可攜帶較大的外源基因片段，易于構建多價基因工程疫苗，達到一種疫苗預防多種疾病的 目的。隨著對鴨疫里氏桿菌的分子生物學及分子致病機理的深入研究，利用現(xiàn)代分子生物 學技術手段與基因工程方法，通過對與代謝相關的因子的失活，構建低毒力的菌株，研制成 鴨疫里氏桿菌基因工程弱毒活疫苗，對預防和控制鴨疫里氏桿菌病具有十分重要的意義。 [0005]目前國內外已有學者開始對鴨疫里氏桿菌作為弱毒活疫苗進行研究，但迄今為止 還沒有一個較為成熟的產品問世。本發(fā)明前期通過體內誘導抗原技術和生物信息學分析找 到了一對RA云夢株（RA-YM)在感染鴨體內誘導表達的新基因，即06537/06542,推測該基 因可能與毒力有關。因此，我們首先克隆06537/06542基因及其上下游同源臂基因，構建重 組自殺性質粒，利用壯觀霉素抗性和PCR進行06537/06542基因缺失株的篩選，并對其遺傳 穩(wěn)定性、毒力及對雛鴨的致病性和免疫原性進行了研究。利用自行構建的基因工程菌株，研 制具有我國知識產權的基因工程載體并應用于生產，將是我國應對當今畜牧業(yè)所面臨的挑 戰(zhàn)，提高競爭力的有力措施。
[0006] 參考文獻
[0007] 1.陳芬芬.鴨疫里氏桿菌體內誘導抗原基因的篩選與應用研究.中國知網(wǎng).湖北 武漢：華中農業(yè)大學，2008
[0008] 2.李繼祥.鴨疫里默氏桿菌致病相關因子研究.[博士學位論文].重慶：西南大 學，2009
[0009] 3.謝妙妙.鴨疫里氏桿菌ECFssigma基因缺失突變株的構建及其生物學特性研 究.[碩士學位論文].湖北武漢：華中農業(yè)大學，2014
[0010] 4.熊濤.湖北省鴨疫里默氏桿菌病的研究.[碩士學位論文].湖北武漢：華中農 業(yè)大學，2001

【發(fā)明內容】

[0011] 本發(fā)明的目的在于提供一株鴨疫里氏桿菌基因缺失菌株。該菌株由于缺失了雙組 份調控系統(tǒng)06537/06542基因的一部分片段，導致毒力下降。本發(fā)明還提供所述菌株在制 備鴨疫里氏桿菌弱毒疫苗中的應用。
[0012] 本發(fā)明的總體技術路線圖見圖1所示，鴨疫里氏桿菌基因缺失株構建路線如圖2 所示。
[0013] 本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：
[0014] 為了實現(xiàn)本發(fā)明，申請人首先查閱了RA-YM株全基因組序列的注釋。結果表明， 其存在3個經(jīng)典TCS。本實驗選取陳芬芬（2008)通過體內誘導抗原技術篩選到的雙組分 調控系統(tǒng)Ive-3,即06537/06542作為研究對象。其編碼基因在RA-YM基因組上的位置為 52760bp-53989bp。其中，組氨酸激酶HK的編碼基因Ive-3a位于RAYM_06537上，由524個 核苷酸組成，共編碼174氨基酸。反應調控因子RR的編碼基因Ive-3b位于RAYM_06542上， 由688個核苷酸組成，共編碼228個氨基酸。從圖3中可看出，兩個編碼基因在基因組上的 位置比鄰，轉錄方向一致，且中間只間隔了 18bp，這與一般的雙組分調控系統(tǒng)的結構特征相 符。
[0015] 以文獻報導的RA-YM株基因組為模板，以LeftarmL1和LeftarmL2、RightarmR1 和RightarmR2為引物，提取的RA-YM株基因組為模板進行PCR擴增，擴增條帶經(jīng)電泳圖顯 示，大小約為500bp左右，與預期的目的片段454bp和456bp-致，將擴增產物回收。由于 RA-YM對壯觀霉素敏感，因此用引物SpcRSl、SpcRS2從pIC333質粒上擴增壯觀霉素抗性 基因以作為篩選標記，擴增產物經(jīng)電泳圖顯示，條帶約為l〇〇〇bp左右，大小與預期目的片 段llOObp-致，將擴增產物回收。將回收的Leftarm、Rightarm和3口〇[!片段通過Overlap PCR連接，將擴增產物回收，與pMD18-T載體連接，連接產物轉化的陽性克隆進行SpcR抗性 基因PCR鑒定和雙酶切鑒定。將酶切鑒定的陽性克隆送往北京擎科測序，BLASTn比對同源 性99%。分別用邱111和5&(3 1將自殺性質粒口1?112和已構建含有目的片段的口1'-1^1? 質粒雙酶切。目的片段回收，16°C水浴鍋過夜連接，連接產物轉化E.coliX7213。擴大培 養(yǎng)陽性克隆，提取質粒，用KpnI和SacI雙酶切鑒定。雙酶切電泳圖顯示有兩條帶，一條 帶大小約為2000bp，另一條帶大小約為5000bp，與預期的2010bp目的片段和pRE112質粒 相符。同時，SpcR基因PCR鑒定也表明重組自殺性質粒pRE112-LSR已成功構建。將轉化 了重組自殺性質粒pRE-LSR的E.coliX7213菌株與RA-YM株進行接合轉移，同源臂之間發(fā) 生交換，重組自殺性質粒pRE-LSR整合到RA-YM株的染色體上，發(fā)生結合轉移的陽性接合子 表型為SpcR，能夠在含Spc(50yg/mL)的TSA平板上生長，挑取抗性平板上的單菌落到含有 Spc(50yg/mL)的TSB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。以C-SpcR-CSl、C-SpcR-CS2為引物，擴增壯觀霉 素抗性基因，得到ll00bp左右的SpcRS因片段，擴增結果顯示SpcR片段成功插入基因組 中。設計兩對引物Deta-Dl、Deta-D2和Check-Cl、Check-C2,分別擴增計劃缺失的片段和 全長，陽性接合子過夜培養(yǎng)菌液為模板進行PCR擴增反應，前者無法擴增，后者得到1968bp 左右的片段。以RA-YM株作對照，PCR擴增反應得到330bp和1708bp左右的片段。PCR產 物電泳圖顯示已經(jīng)成功缺失了06537/06542基因中的798bp的片段。將篩選到的RA-YM 06537/06542基因缺失株在含有Spc的TSB培養(yǎng)基中盲傳，用引物C-SpcR-CSl、C-SpcR-CS2 和Deta-Dl、Deta-D2對每一代都進行鑒定。鑒定結果顯示連續(xù)傳了5代都沒有擴增出已缺 失的06537/06542基因片段。
[0016] 本發(fā)明的原理是基因的同源重組，通過外源DNA與染色體DNA之間的同源序列發(fā) 生重組，從而改變其遺傳特性。我們通常使用電擊轉化，結合轉移來實現(xiàn)同源重組。電擊 轉化法是將菌體制作成感受態(tài)的狀態(tài)，利用高壓電脈沖菌體細胞膜出現(xiàn)微孔，外源DNA片 段通過微孔進入菌體細胞核，與基因組發(fā)生重組，質膜隨后修復，細菌恢復生長。電擊轉化 法依細胞的類型不同，可以選擇和優(yōu)化電擊轉化過程中的電場強度和DNA濃度等一系列參 數(shù)，得到比較高的DNA轉化率。結合轉移是在質粒轉移的過程中，供體菌和受體菌通過結合 作用緊密接觸，質粒從供體菌向受體菌轉移，同時進行質粒復制。轉移質粒帶有tra基因， 能完整的編碼轉移酶，質粒能從一個細胞到另一個細胞自主地轉移，如果質粒不含tra基 因，轉移質粒中應該含有質粒轉移起始位點oriT，雖然不能夠自主轉移，但是能被其他一些 含有完整的tra基因的質粒誘導轉移。
[0017] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下突出的優(yōu)點：
[0018] 1.本發(fā)明所用的材料為鴨疫里氏桿菌野生致病菌株RA-YM，該菌株是從湖北云夢 某養(yǎng)鴨場分離所得一種血清1型菌株，血清1型為我國目前流行較廣的血清型，因此以該致 病菌進一步構建的06537/06542基因缺失菌株RA-YMA06537/06542針對湖北地區(qū)乃至全 國均有廣闊的應用前景。
[0019] 2.本發(fā)明發(fā)