一種基于香豆素樹狀體的熒光免疫層析條及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種免疫層析條及其制備方法和用途，特別涉及一種用于檢測甲型流 感病毒的基于香豆素樹狀體的熒光免疫層析條及其制備方法和用途。本發(fā)明屬于生物技術(shù) 領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 流感病毒依據(jù)核蛋白（NP)抗原性分為甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病 毒。甲型流感病毒是導致人、動物傳染性呼吸道疾病的主要病原。HlNl流感病毒或稱為豬 流感病毒，是由人流感病毒和豬流感病毒基因重組產(chǎn)生，在世界各地爆發(fā)流行。人感染禽流 感病毒非常罕見，在人接觸感染禽后引起禽流感病毒（如H5NUH7N9或H9N2)感染，會引起 呼吸道疾病癥狀甚至死亡。
[0003] 甲型流感病毒跨越種屬障礙在人-動物之間傳播，引起流感大流行，對人和動物 健康產(chǎn)生了嚴重影響，因此對于甲型流感病毒的檢測非常有必要。通過至少3種甲型流感 病毒主要亞型病毒（H5、H7、H9)定期篩選人-禽甲型流感病毒，對感染急性期快速檢測流感 病毒的存在，及時臨床治療和應急防控意義非凡。
[0004] 目前流感病毒的檢測方法有病毒培養(yǎng)、酶聯(lián)免疫吸附（ELISA)、熒光免疫以及多聚 酶鏈擴增技術(shù)，這些技術(shù)多用于醫(yī)院和實驗室，需要培訓有素的技術(shù)人員和精密的實驗室 儀器。檢測速度快、方便攜帶、容易操控、抗體的免疫學方法常被許多醫(yī)院實驗室、應急防治 部門使用。以流感病毒核蛋白為檢測靶點的快速流感診斷檢測（RIDTs)也廣泛在臨床實踐 中應用。這些方法具有低廉、不需細胞培養(yǎng)、容易床旁或現(xiàn)場立即使用的優(yōu)點，但由于常規(guī) RIDTs檢測在檢測甲型流感病毒時，常常會由于對病毒的敏感性不同導致在自動讀板儀和 可視觀察中約有2. 2%的檢測結(jié)果不一致，因此RIDTs在作為流感病毒篩選工具使用受到 限制。
[0005] 為進一步改善甲型流感病毒檢測的靈敏性，以磁性圓珠、納米顆粒、熒光為基礎(chǔ)的 檢測系統(tǒng)不斷出現(xiàn)，但在整合到快速篩選的高級方法中時以及在現(xiàn)場使用和床旁檢驗中面 臨多處挑戰(zhàn)。而在這些方法中，熒光材料是甲型流感病毒檢測中非常出色的標記物。
[0006] 香豆素樹狀體是一種新的熒光材料，可被光散二極管（LEDs)激活，在熒光酶聯(lián)免 疫吸附檢測診斷中具有潛在的應用價值和良好操作性。
[0007] 在本發(fā)明中，香豆素樹狀體被整合到甲型流感病毒含量豐富的核蛋白（NP)的單 克隆抗體上，同時偶聯(lián)乳膠圓珠，進而制成了一種基于香豆素樹狀體的熒光免疫層析條并 建立了高度敏感的焚光免疫層析條檢測法（fluorescent immunochromatographic strip test asssay，F(xiàn)ICT)。通過LED-為基礎(chǔ)的便攜式條讀數(shù)計即可檢測禽和人甲型流感病毒的 存在，該高度靈敏的診斷系統(tǒng)可檢測定到納米級含量的流感病毒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種新的用于甲型流感病毒快速檢測的方法。
[0009] 為達到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：
[0010] 本發(fā)明的一種基于香豆素樹狀體的熒光免疫層析條，其特征在于，所述層析條按 照連接順序依次包括樣品襯墊，結(jié)合襯墊，醋酸纖維素膜，吸水紙及位于下方的作為組裝平 臺使用的PVC底板，所述醋酸纖維素膜與結(jié)合襯墊之間有搭接，所述結(jié)合襯墊吸附有表面 吸附甲型流感病毒核蛋白單抗以及香豆素樹狀體的乳膠圓珠；
[0011] 其中，所述的醋酸纖維素膜上有羊抗鼠 IgG多克隆抗體包被的質(zhì)控線，以及甲型 流感病毒核蛋白另一單抗包被的檢測線，樣品襯墊提供了待測樣品加入的位置；
[0012] 其中，所述的香豆素樹狀體的結(jié)構(gòu)如以下結(jié)構(gòu)式所示：
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[0014] 在本發(fā)明中，結(jié)合襯墊表面吸附的單抗與檢測線包被的單抗分別識別甲型流感病 毒核蛋白的不同抗原表位。
[0015] 在本發(fā)明的一個具體實施例中，表面吸附甲型流感病毒核蛋白單抗以及香豆素樹 狀體的乳膠圓珠可通過以下方法制備的：
[0016] (1)將0· 8ml直徑20nm的乳膠圓珠用0· 8ml pH 8. 5的0· IM碳酸氫鈉溶液以及 pH 7. 4的PBS先后分別洗滌3次，短暫離心，棄上清；
[0017] ⑵沉淀中加入0· 8ml pH 8. 5的(λ IM碳酸氫鈉溶液，再加入128 μ L溶于DMSO的 濃度為lmg/mL香豆素樹狀體溶液，室溫搖動1小時，得到結(jié)合香豆素樹狀體的乳膠圓珠；
[0018] (3)將結(jié)合香豆素樹狀體的乳膠圓珠用PBS洗滌2次，短暫離心，棄上清，沉淀用 0. 8ml含lmg/mL的甲型流感病毒核蛋白單抗溶液重懸，4°C孵育1小時；
[0019] (4)緩慢加入0. 5mL戊二醛溶液，渦旋1分鐘，4°C孵育2小時；
[0020] (5)用PBS洗滌2次，短暫離心，棄上清，沉淀用ImL 0. 1%牛血清白蛋白溶液重 懸，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0021] 在碳酸氫鈉緩沖液（pH 8. 5)中，香豆素樹狀體的N-羥基琥珀酰亞胺 (N-hydroxysuccinimide (NHS))醚和乳膠表面的第一氨基團（-NH2)反應形成穩(wěn)定的酰胺 健，釋放NHS。親水性戊二醛羧基（-C00H)和抗體的氨基（-NH2)結(jié)合形成氨基健。在乳膠 上的結(jié)合單克隆抗體用高速離心純化并洗滌。
[0022] 在本發(fā)明中，香豆素樹狀體被整合到乳膠圓珠上，同時偶聯(lián)甲型流感病毒核蛋白 (NP)的單抗，然后將表面吸附甲型流感病毒核蛋白單抗以及香豆素樹狀體的乳膠圓珠吸 附在結(jié)合襯墊上，羊抗鼠 IgG多克隆抗體以及甲型流感病毒核蛋白另一單抗分別包被在 醋酸纖維膜上形成質(zhì)控線（控制區(qū)（C區(qū)））和檢測線（檢測區(qū)（T區(qū)）），最后制成了一 種基于香豆素樹狀體的熒光免疫層析條，同時建立了高度敏感的熒光免疫層析條檢測法 (fluorescent immunochromatographic strip test asssay，F(xiàn)ICT)。在檢測區(qū)甲流病毒單 抗包被處，如無目標NP抗原，乳膠結(jié)合物將在檢測區(qū)不能和單抗反應。如有甲流病毒NP抗 原，將形成甲流核蛋白NP-單抗-香豆素樹狀體-乳膠圓珠結(jié)合物，然后該結(jié)合物沿膜橫向 流動，因為結(jié)合有甲流核蛋白NP抗原，結(jié)合物將與檢測線上的單抗發(fā)生抗原抗體反應而停 留于檢測區(qū)，最后香豆素樹狀體的熒光密度用光散二極管為基礎(chǔ)的便攜式讀數(shù)計檢測。讀 數(shù)計中過濾激發(fā)熒光長波散發(fā)，變成廣譜熒光散發(fā)特異區(qū)間，散發(fā)熒光。在控制區(qū)，羊抗鼠 IgG多克隆抗體識別乳膠表面甲流病毒NP單抗，可檢驗每次檢測的有效性。檢測區(qū)（T)和 控制區(qū)（C)熒光密度比例可轉(zhuǎn)換成檢測樣本中的病毒數(shù)量，因此每次檢測T區(qū)峰值與每次 檢測C區(qū)峰值比值確定相關(guān)診斷數(shù)據(jù)。
[0023] 采用本發(fā)明公開的方法在5分鐘內(nèi)可檢測到IOng/ μ L的甲型流感病毒核蛋白，靈 敏度比免疫斑點雜交和傳統(tǒng)的快速流感診斷方法（RIDTs)(靈敏度25ng/ μ L)高，更重要 的是FICT法至少可檢出5個亞型的甲型流感病毒，即Η1Ν1、Η5Ν3、Η7Ν1、Η7Ν7以及Η9Ν2,臨 床上可區(qū)分檢驗甲型流感病毒感染和其他呼吸道病毒感染。
[0024] 本發(fā)明的FICT法在檢測動物源性甲型流感病毒上具有高度的敏感性，通過提供 許多診斷數(shù)據(jù)可對感染病毒進行定量，因此增強了甲型流感病毒可檢測性。在臨床應用中， FICT檢測呼吸道感染的拭子，所有HlNl陽性的樣品檢出結(jié)果均為陽性。FICT法因為較高 的最低檢測濃度，可對RDT(快速診斷檢測）法檢出陰性的病人進行診斷。使用標化的HlNl 病毒抗原，所有病人的流感病毒可以定量?？傊景l(fā)明公開了一種高效、簡單、定量檢測或 診斷甲型流感病毒的熒光免疫層析條。
【附圖說明】
[0025] 圖1為本發(fā)明的結(jié)合香豆素樹狀體、抗體的乳膠圓珠結(jié)合物的穩(wěn)定性檢測；
[0026] 圖2為本發(fā)明的熒光免疫層析條的靈敏度檢測結(jié)果；
[0027] 圖3為采用本發(fā)明的FICT法對雞場分離的禽流感病毒進行檢測的結(jié)果；
[0028] 圖4為本發(fā)明的FICT方法的臨床檢驗結(jié)果；
[0029] 圖5為HAU滴度的校驗曲線。
【具體實施方式】
[0030] 下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)