本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及達(dá)匹維林在治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的藥物中的應(yīng)用。

技術(shù)背景

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma，gbm)是惡性程度最高的膠質(zhì)瘤，屬whoiv級(jí)，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤以手術(shù)、放療、化療及其他綜合治療為主，最重要的治療手段為手術(shù)治療(comprehensivegenomiccharacterizationdefineshumanglioblastomagenesandcorepathways.nature,2008.455(7216):p.1061-8)。藥物治療在惡性腫瘤的三大療法中發(fā)展速度最快。替莫唑胺(temozolomide，tmz)是目前廣泛用于臨床的膠質(zhì)瘤化療藥，盡管tmz治療后，腦膠質(zhì)瘤病人的生存期有了很大改變，但是同其他化療藥物一樣，腦膠質(zhì)瘤對(duì)tmz的耐藥性嚴(yán)重限制了治療效果而導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)，這已成為嚴(yán)重影響化療效果的主要因素(dehdashti,a.r.,etal.,newtrendsinthemedicalmanagementofglioblastomamultiforme:theroleoftemozolomidechemotherapy.neurosurgfocus,2006.20(4):p.e6)。因此，尋找新的用于術(shù)后控制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤藥物勢在必行。

根據(jù)2009年的統(tǒng)計(jì)，世界范圍內(nèi)大約有3300萬人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，hiv)感染者，其中有大約180萬患者死于獲得性人類免疫缺陷綜合征(acquiredimmunedeficiencysyndrome，aids，艾滋病)(unaids[internet].geneva:globalreport:unaidsreportontheglobalaidsepidemic2010)。自1998年高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(highactiveanti-retroviraltherapy，harrt)被提出并推廣后，艾滋病相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生率及死亡率明顯降低。harrt有效地降低了患者體內(nèi)病毒載量，使艾滋病患者的平均壽命得到延長(palellafjjr,delaneykm,moormanac,etal.decliningmorbidityandmortalityamongpatientswithadvancedhumanimmunodeficiencyvirusinfection.hivoutpatientstudyinvestigators.nengljmed1998；338:853-60.)。然而與不斷下降的艾滋病相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生及死亡率相比，艾滋病非特異性腫瘤(non-aidsdefiningmalignancies，non-adms)的發(fā)生率仍然是逐年增長的，其中就包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(lohsen,hansenab,gerstoftj,obeln.improvedsurvivalinhiv-infectedpersons:consequencesandperspectives.jantimicrobchemother2007；60:461-3.)。大量流行病學(xué)調(diào)查顯示，使用免疫抑制劑會(huì)增加顱內(nèi)膠質(zhì)瘤的發(fā)病率(salvatim,fratia,carolie,etal.glioblastomainkidneytransplantrecipients.reportoffivecases.jneurooncol2003；63:33-7,n,-kesv,kesp,-cunkov,-baronicak.[neurologicalcomplicationsinrenaltransplantrecipients].actamedcroatica2008；62suppl1:76-81)，而hiv/aids患者體內(nèi)免疫功能不全的狀態(tài)，同樣為惡性腫瘤的發(fā)生提供了可乘之機(jī)，choy等人通過分析17例hiv相關(guān)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，發(fā)現(xiàn)hiv陽性的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者較hiv陰性的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者平均年齡更低(w.choy,c.lagman,etal.impactofhumanimmunodeficiencyvirusinthepathogenesisandoutcomeofpatientswithglioblastomamultiforme.braintumorrestreat2016；4(2):77-86)。hiv/aids患者膠質(zhì)瘤相對(duì)早的發(fā)病年齡，可能與hiv介導(dǎo)的免疫抑制有關(guān)。

對(duì)于艾滋病伴發(fā)惡性腫瘤的患者，聯(lián)合應(yīng)用抗腫瘤化療及harrt已顯示出有效性。maso等通過檔案連鎖研究分析hiv/aids患者(1986年到2005年)使用harrt后，癌癥發(fā)生率的改變情況。研究表明，接受harrt的患者，中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病比(standardizedincidenceratios，sir，from1986–1996and1997–2004)從3.5(95％ci:1.5–7.0)降至3.2(95％ci:1.4–6.3)(dalmasol,poleselj,serrainod,etal.patternofcancerriskinpersonswithaidsinitalyinthehaartera.brjcancer2009；100:840-7.)。shiels等對(duì)24例hiv/aids患者接受haart前后，腦腫瘤發(fā)生情況進(jìn)行meta分析。分析結(jié)果表明，腦腫瘤的sir從1.9(95％ci：0.66-5.7)降至1.0(95％ci：0.63-1.7)(shielsms,colesr,kirkgd,poolec.ameta-analysisoftheincidenceofnon-aidscancersinhiv-infectedindividuals.jacquirimmunedeficsyndr2009；52:611-22.)。

目前對(duì)于艾滋病并發(fā)腫瘤的患者，其抗腫瘤化療與之間潛在的藥物相互作用了解不多，可用于安全指導(dǎo)和抗腫瘤化療聯(lián)合應(yīng)用的研究數(shù)據(jù)非常有限，缺乏基于臨床試驗(yàn)的普遍可行的詳細(xì)指南,所以現(xiàn)在臨床醫(yī)生和臨床研宄員只能從藥物代謝的相關(guān)知識(shí)去推測藥物間可能存在的相互作用，從而制定治療方案(marudek,cflexneretal.useofantineoplasticagentsinpatientswithcancerwhohavehiv/aids.lancetoncol.2011；12:905-12)。如果抗hiv藥物本身具有抗腫瘤細(xì)胞活性，一定程度上可以減輕藥物合用(抗hiv藥物與抗腫瘤化療藥物)帶來的潛在不確定的相互作用。前人研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶抑制劑可能有潛在的抗膠質(zhì)母細(xì)胞瘤活性。利托那韋，一種hiv蛋白酶抑制劑，能夠阻斷細(xì)胞內(nèi)泛素化通路，同時(shí)阻滯膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期、誘導(dǎo)其凋亡，從而表現(xiàn)出抗膠質(zhì)瘤活性(guptaak,cernigliagj,mickr,mckennawg,muschelrj.hivproteaseinhibitorsblockaktsignalingandradiosensitizetumorcellsbothinvitroandinvivo.cancerres2005；65:8256-65.)。laurent等在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，利托那韋對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞有細(xì)胞毒性(laurentn,deboüards,guillamojs,etal.effectsoftheproteasomeinhibitorritonavirongliomagrowthinvitroandinvivo.molcancerther2004；3:129-36.)。蛋白酶抑制劑作為haart的特殊治療效果已經(jīng)得到肯定，能否將其用于抗膠質(zhì)瘤，還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

達(dá)匹維林(dapivirine，tmc120)是新一代的非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(non-nucleosidereversetranscriptaseinhibitor，nnrtis)，tmc120是這種化合物的別稱代號(hào)，化學(xué)式寫作c20h19n5，全稱為4-{{4-[(2,4,6-三甲苯基)-氨基]-2-嘧啶}-氨基}-苯甲腈(4-{{4-[(2,4,6-trimethylphenyl)-amino]-2-pyrimidinyl}-amino}-benzonitrile)。目前，達(dá)匹維林主要作為陰道的殺微生物劑，被制成半固體凝膠、彈性硅膠兩種劑型置于陰道環(huán)內(nèi)(akil.a.,etal.,developmentandcharacterizationofavaginalfilmcontainingdapivirine,anon-nucleosidereversetranscriptaseinhibitor(nnrti),forpreventionofhiv-1sexualtransmission.drugdelivtranslres,2011.1(3):p.209-222.)。華盛頓大學(xué)全球衛(wèi)生部國際臨床研究中心baeten博士等，為此開展了一項(xiàng)隨機(jī)、安慰劑對(duì)照、雙盲、3期臨床試驗(yàn)，旨在研究含達(dá)匹維林的陰道環(huán)對(duì)女性預(yù)防hiv-1感染的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該暴露前預(yù)防方法可適度降低女性hiv感染風(fēng)險(xiǎn)以陰道環(huán)的形式在體外實(shí)驗(yàn)及間接體內(nèi)療法中均能有效地阻止hiv-1的感染(fletcher.p.,etal.inhibitionofhumanimmunodeficiencyvirustype1infectionbythecandidatemicrobicidedapivirine,anonnucleosidereversetranscriptaseinhibitor.antimicrobagentschemother,2009.53(2):p.487-95.)。

目前為止，尚未有相關(guān)文獻(xiàn)證實(shí)達(dá)匹維林有抗膠質(zhì)瘤活性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種達(dá)匹維林的新應(yīng)用，具體是：達(dá)匹維林在制備治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明采用的gbm細(xì)胞是人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株u87，體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，達(dá)匹維林對(duì)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株u87的半抑制濃度ic50是10.73μmol/l。

本發(fā)明檢測了達(dá)匹維林在體外對(duì)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株u87的生長抑制作用，達(dá)匹維林的有效藥物濃度是4μmol/l。

本發(fā)明檢測了達(dá)匹維林對(duì)u87遷移侵襲能力的影響，達(dá)匹維林的有效藥物濃度是4μmol/l。

本發(fā)明檢測了達(dá)匹維林對(duì)u87細(xì)胞增殖、凋亡、自噬、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，達(dá)匹維林的有效藥物濃度是8μmol/l。

在達(dá)匹維林調(diào)節(jié)u87細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的實(shí)驗(yàn)中，達(dá)匹維林的藥物濃度是16μmol/l。

本發(fā)明還利用裸鼠體內(nèi)移植瘤模型檢測達(dá)匹維林體內(nèi)抗腫瘤活性，所用達(dá)匹維林濃度為16mg/kg(溶解于含5％dmso的生理鹽水中)，每3天腹腔注射給藥1次。

在sd大鼠藥物毒性試驗(yàn)中，達(dá)匹維林組給藥劑量為16mg/kg，腹腔注射給藥，0、3d各給藥1次，共2次，設(shè)3w恢復(fù)期。

通過上述實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明首次證實(shí)了達(dá)匹維林具有體外抗膠質(zhì)瘤細(xì)胞的效果；也首次證實(shí)了達(dá)匹維林具有體內(nèi)抗膠質(zhì)瘤細(xì)胞的效果，能夠延緩腫瘤增長、介導(dǎo)腫瘤凋亡；同時(shí)首次證實(shí)了達(dá)匹維林能夠誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，通過激活jnk通路和pi3k/akt通路，解除原本腫瘤細(xì)胞內(nèi)凋亡的抑制狀態(tài)，激活自噬通路，從而抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞遷移。

附圖說明

圖1顯示cck-8試驗(yàn)檢測達(dá)匹維林對(duì)gbm細(xì)胞u87的細(xì)胞毒作用。

圖2顯示cck-8試驗(yàn)檢測達(dá)匹維林體外條件下對(duì)gbm細(xì)胞的增殖抑制作用。

圖3顯示transwell小室試驗(yàn)檢測達(dá)匹維林體外條件下對(duì)gbm細(xì)胞的遷移促進(jìn)作用。

圖4顯示westernblotting分析達(dá)匹維林作用于gbm細(xì)胞，細(xì)胞增殖、凋亡、自噬、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)變化情況。

圖5顯示流式細(xì)胞術(shù)檢測達(dá)匹維林在體外對(duì)gbm細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。

圖6顯示patnscanintracellularsignalingarraykit檢測達(dá)匹維林體外條件下對(duì)gbm細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的影響。

圖7顯示裸鼠皮下成瘤試驗(yàn)檢測達(dá)匹維林的體內(nèi)抗腫瘤活性。

圖8顯示免疫組化ki67染色檢測達(dá)匹維林體內(nèi)條件下對(duì)gbm細(xì)胞的增殖抑制作用。

圖9顯示腫瘤組織切片tunel染色檢測達(dá)匹維林體內(nèi)條件下對(duì)gbm細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。

圖10顯示體內(nèi)毒性試驗(yàn)檢測達(dá)匹維林有效抗腫瘤劑量下對(duì)肝、腎功能的影響。

具體實(shí)施方式

以下是本發(fā)明的實(shí)施例，但不以任何形式限制本發(fā)明。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

本發(fā)明進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)方法來驗(yàn)證達(dá)匹維林可以用于制備治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤藥物：

(1)cck8法，檢測達(dá)匹維林在體外對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株u87的細(xì)胞毒作用；

(2)transwell試驗(yàn)，檢測達(dá)匹維林在體外影響腫瘤細(xì)胞遷移侵襲能力；

(3)westernblotting蛋白印跡法，檢測達(dá)匹維林在體外對(duì)u87細(xì)胞增殖、凋亡、自噬、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響；

(4)流式細(xì)胞術(shù)，檢測達(dá)匹維林在體外誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡情況；

(5)pathintracellularsignalingarraykit(path細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路抗體芯片試劑盒)，檢測達(dá)匹維林在體外對(duì)u87細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的影響；

(6)裸鼠體內(nèi)移植瘤模型，研究達(dá)匹維林的體內(nèi)抗膠質(zhì)母細(xì)胞瘤活性；

(7)大鼠毒性試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，研究達(dá)匹維林在抗腫瘤作用濃度下，生物體對(duì)其有無明顯毒性反應(yīng)。

1.檢測達(dá)匹維林體外條件下對(duì)gbm細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用

cck8試驗(yàn)用于檢測dapivirine對(duì)u87細(xì)胞增殖的影響。將處于對(duì)數(shù)生長期的u87制成細(xì)胞懸液后接種于96孔板并培養(yǎng)24h.換為含dapivirine不同濃度(4、8、16、32、64μm)的培養(yǎng)液。以dmso作為陰性對(duì)照并每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。孵育48h后加入cck8溶液37℃孵育2h后全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測儀上避光振蕩混勻并測各孔吸光值(od值)，波長490nm，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次取平均值。采用數(shù)據(jù)分析軟件spss20.0計(jì)算分析各組細(xì)胞生長抑制率(inhibitionrate，ir)和ic50，采用oneway-anova方法,各組分別與對(duì)照組比較采用dunnett檢驗(yàn)；p＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。

細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示，ir(％)隨dapivirine濃度而增加(p<0.001)，ic50計(jì)算得10.73μmol/l(圖1)。

2.檢測達(dá)匹維林體外條件下對(duì)gbm細(xì)胞活力的影響

cck8試驗(yàn)用于檢測dapivirine對(duì)u87細(xì)胞增殖的影響。將處于對(duì)數(shù)生長期的u87制成細(xì)胞懸液后接種于96孔板并培養(yǎng)24h.換為含dapivirine不同濃度(4、8、16μmol/l)的培養(yǎng)液，以dmso作為陰性對(duì)照并每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24,48,72,96，120小時(shí)后，加入cck8溶液37℃孵育2h后全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測儀上避光振蕩混勻并測各孔吸光值(od值)，波長490nm，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次取平均值。采用數(shù)據(jù)分析軟件spss20.0計(jì)算分析各組細(xì)胞活力，采用oneway-anova方法,各組分別與對(duì)照組比較采用dunnett檢驗(yàn)；p＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。

細(xì)胞活力試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，16μmol/l濃度的達(dá)匹維林作用下，gbm細(xì)胞u87的增殖能力受到明顯抑制。

3.檢測達(dá)匹維林體外條件下對(duì)gbm細(xì)胞遷移的影響

transwell小室試驗(yàn)用于檢測細(xì)胞遷移能力。在transwell小室(corning公司)的下室中加入含10％fbs的dmem培養(yǎng)基600ul。體外培養(yǎng)u87細(xì)胞，待細(xì)胞饑餓處理12h以后，加入含不同濃度達(dá)匹維林的無血清dmem培養(yǎng)基(藥物終濃度分別為0、8、16μmol/l)制成10⁵/ml單細(xì)胞懸液，每個(gè)上室加入200μl細(xì)胞懸液，37℃，5％co2,95％濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h后取出小室，棄去小室內(nèi)培養(yǎng)液，濕棉簽擦去上面未穿過微孔的細(xì)胞，甲醇固定1h，pbs洗3遍后置于dapi中染色2min，再用pbs洗3遍后倒置顯微鏡下觀察。隨機(jī)取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)的穿過微孔的細(xì)胞數(shù)，以遷移細(xì)胞的相對(duì)數(shù)目來表示腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，遷移抑制率(％)＝(1－實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù))×100％。

結(jié)果如圖3所示，8μmol/l和16μmol/l濃度的達(dá)匹維林作用下，gbm細(xì)胞的遷移能力有所增強(qiáng)。

4.檢測達(dá)匹維林體外條件下對(duì)gbm細(xì)胞增殖、凋亡、自噬、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

4.1.蛋白樣品的提取和制備：將u87細(xì)胞培養(yǎng)在25cm²培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞生長達(dá)60％左右，加入達(dá)匹維林終濃度為16μmol/l的dmem培養(yǎng)基(對(duì)照組為dmso)，孵箱培養(yǎng)0h、12h、24h或48h后分別提取細(xì)胞總蛋白。用預(yù)冷的pbs輕輕清洗培養(yǎng)瓶2次，每次2ml。用吸引器小心吸出殘留瓶中的液體，到吸干為止。每瓶加入150μl細(xì)胞裂解液，均勻搖晃，冰上裂解15min后，用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下，移液器將細(xì)胞懸液移入1.5ml離心管，再用1ml注射器對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行反復(fù)抽吸20次，利用剪切力切斷大片段核酸。4℃，12000rpm離心30min，收集上清液，即為所需蛋白樣品。預(yù)留10μl用于蛋白定量，其余樣品立即凍存于-80℃保存或者加入1/4體積的5×上樣緩沖液，沸水中煮5min，保存于-20℃。

4.2.蛋白定量：配制bca工作液使用bca試劑盒(solarbio公司)，取適量a液和b液，按50:1的比例將a液和b液混合均勻。稀釋標(biāo)準(zhǔn)品(5mg/ml)取20μl標(biāo)準(zhǔn)品，用pbs稀釋至100μl，使終濃度為0.5mg/ml，按0、4、8、12、16、20μl分別加入8孔中(96孔板)，并用pbs補(bǔ)足每孔至20μl。使每孔蛋白濃度為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1mg/ml。將2μl提取的蛋白樣品加入96孔板中，并加入18μlpbs。每孔加入200μlbca工作液，37℃放置30min。冷卻至室溫，用酶標(biāo)儀測定a562吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品蛋白濃度。

4.3.sds-page電泳與轉(zhuǎn)膜：認(rèn)真清洗玻璃板，避免殘留膠粒，組裝好玻璃板，用去離子水確定無滲漏。配制10％分離膠，混合均勻，將溶液平緩地注入兩層玻璃板中，高度為距玻璃板上緣1.5cm左右，再在液面上小心注入1ml去離子水，靜置20～30min后，待下層膠凝固，將上層液體側(cè)倒出來。配制5％上層膠，混合均勻，以連續(xù)平穩(wěn)的液流注入玻璃板中，隨即小心插入成孔器，靜置30min，待上層膠凝固完畢。配制電泳緩沖液，稱取tris堿3.03g，甘氨酸14.4g，sds1.0g，去離子水定容至1000ml。組裝電泳裝置、上樣、電泳上層膠采用80v，下層膠120v，待藍(lán)色線條移動(dòng)至玻璃板底端，電泳結(jié)束，關(guān)閉電源。

轉(zhuǎn)膜：配制轉(zhuǎn)移緩沖液稱取tris堿3.03g，甘氨酸14.4g，去離子水定容至800ml溶解，加入甲醇200ml。

組裝轉(zhuǎn)膜夾子：將夾子在轉(zhuǎn)移液中展開，向夾子黑面依次放置襯墊，雙層濾紙，電泳完畢的凝膠，pvdf膜，雙層濾紙，襯墊，小心合上夾子。將組裝好的轉(zhuǎn)膜夾子裝入轉(zhuǎn)移槽中，夾子黑面在轉(zhuǎn)移槽黑面一側(cè)，白面在轉(zhuǎn)移槽紅色一側(cè)。將轉(zhuǎn)移槽倒?jié)M轉(zhuǎn)移液，并放入一個(gè)冰袋，連接導(dǎo)線，注意正負(fù)極，設(shè)定電流300ma，，120min。

4.4.免疫反應(yīng)：配制tbst緩沖液先配制10×tbs500ml(tris堿12.1g；nacl40g；去離子水定容至500ml)，取100ml10×tbs用去離子水稀釋至1000ml，加入tween-201ml后混勻。根據(jù)marker標(biāo)記剪取目的條帶，并用圓珠筆作好標(biāo)記。在搖床上，用tbst緩沖液洗去膜上殘留的轉(zhuǎn)膜液，80rpm，5min×3次，再用tbst配制的5％脫脂奶粉封閉條帶1h，設(shè)定搖床60rpm。將tbst緩沖液配制的適當(dāng)濃度的一抗緩沖液和條帶置入封口的干凈塑料袋子中，搖床60rpm，室溫封閉1h后，平整放置于4℃冰箱中過夜。將條帶取出，用tbst洗滌，搖床80rpm，5min×3次。再用tbst配制的二抗緩沖液室溫封閉1h，搖床60rpm。

4.5顯影、定影：已標(biāo)記上不同蛋白的膜，用ecl發(fā)光液覆蓋，反應(yīng)后，于暗室內(nèi)顯影、定影。

結(jié)果如圖4顯示，n-cadherin，間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物之一，表達(dá)量隨達(dá)匹維林作用時(shí)間增加而升高,如圖4(a)?？俢aspase-3，細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)蛋白，表達(dá)量隨達(dá)匹維林作用時(shí)間增加而降低，同時(shí)caspase-3的降解產(chǎn)物，cleavedcaspase-3，表達(dá)量隨達(dá)匹維林作用時(shí)間增加而升高，見圖4(b)。自噬主要標(biāo)志物之一的lc3a/b，westernblotting結(jié)果顯示lc3a/b-ii與lc3a/b-i比值隨達(dá)匹維林作用時(shí)間增加而升高。atg7以及beclin-1，同樣作為自噬的標(biāo)記物，表達(dá)量隨達(dá)匹維林作用時(shí)間增加，呈現(xiàn)先升高后降低的表現(xiàn)，作用時(shí)間24h時(shí)表達(dá)量最高,如圖4(c)所示。與細(xì)胞增殖相關(guān)的蛋白akt、p-akt、p-snk/jnk表達(dá)量隨達(dá)匹維林作用時(shí)間增加而呈現(xiàn)先升高后降低的表現(xiàn)，akt與p-akt在作用時(shí)間24h時(shí)表達(dá)量最高，p-snk/jnk表達(dá)量隨達(dá)匹維林作用時(shí)間增加而升高，結(jié)果如圖4(d)所示。

5.檢測達(dá)匹維林在體外誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡情況

流式細(xì)胞儀檢測達(dá)匹維林在體外誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡情況：u87細(xì)胞在dmem培養(yǎng)基含體積分?jǐn)?shù)為10％胎牛血清，100ku/l青霉素和100mg/l鏈霉素，37℃，5％co2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25％胰酶消化傳代，以2×10⁵/孔接種6孔板，24h后細(xì)胞貼壁生長狀態(tài)良好時(shí)開始實(shí)驗(yàn)操作。藥物設(shè)計(jì)：設(shè)計(jì)藥物濃度0、8、16μmol/l的達(dá)匹維林處理u87細(xì)胞，藥物處理：棄細(xì)胞培養(yǎng)板中原有的培養(yǎng)基，按藥物設(shè)計(jì)的濃度加入含藥培養(yǎng)基處理細(xì)胞。將上述細(xì)胞板置于5％co237℃培養(yǎng)箱內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)12h、24h、48h后停止培養(yǎng)。用不含的胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心后細(xì)胞用pbs洗2次，再將細(xì)胞分別轉(zhuǎn)移至流式管。將fitcannexinvapoptosisdetectionkit中的緩沖液用去離子水稀釋成1×緩沖液，然后每個(gè)流式管中加入100μl的1×緩沖液混懸細(xì)胞。每個(gè)流式管中分別加入fitcannexinvapoptosisdetectionkit中的fitcannexinv和pi各5μl，避光，室溫放置15min。每個(gè)流式管中再分別加入400μl的1×緩沖液，充分混勻后于1h內(nèi)上樣，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

結(jié)果如圖5顯示，在藥物濃度為16μmol/l時(shí)，隨著藥物作用時(shí)間延長，達(dá)匹維林誘導(dǎo)u87細(xì)胞凋亡的程度增強(qiáng)；在達(dá)匹維林濃度為8μmol/l時(shí)，對(duì)u87細(xì)胞無明顯凋亡誘導(dǎo)作用。6.檢測達(dá)匹維林對(duì)gbm細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的影響

6.1.制備細(xì)胞裂解產(chǎn)物：使用patnscanintracellularsignalingarraykit試劑盒內(nèi)的1x細(xì)胞裂解液，按1ml裂解液加10μlpmsf(100mm)(solarbio公司)或加入蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物(solarbio公司)至終濃度為1mm，搖勻置于冰上。倒掉培養(yǎng)液，并將皿(直徑10cm)倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液。每皿細(xì)胞加5ml4℃預(yù)冷的pbs(0.01mph7.2～7.3)。平放輕輕搖動(dòng)1min洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將pbs棄凈后把培養(yǎng)皿置于冰上。每皿細(xì)胞加500μl含pmsf的裂解液，于冰上裂解2min，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)皿要經(jīng)常來回?fù)u動(dòng)。裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)(動(dòng)作要快)，然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中。(整個(gè)操作盡量在冰上進(jìn)行。)4℃下12000rpm離心3min。(提前開離心機(jī)預(yù)冷)將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5min的離心管中。bca法測蛋白濃度，并用arraydiluentbuffer將所有蛋白濃度調(diào)至0.2–1.0mg/ml。

6.2.使用pathscan試劑盒檢測細(xì)胞蛋白：使用雙蒸水將試劑盒內(nèi)20x的緩沖洗滌液稀釋至1x工作濃度。使用試劑盒內(nèi)的抗體稀釋液將20x的抗體混合物稀釋成1x工作濃度。將試劑盒內(nèi)20x的hrp-linkedstreptavidin稀釋至1x工作濃度。將試劑盒內(nèi)有硝酸纖維涂層的玻璃板、分隔柵欄和金屬固定夾取出后組裝起來，將硝酸纖維膜分隔成16個(gè)小格。保證硝酸纖維涂層面朝上。向每格內(nèi)滴加100μl封閉液，置于搖床上，轉(zhuǎn)速60rpm，室溫封閉15min。吸去封閉液，向每格內(nèi)滴加50-75μl細(xì)胞裂解液，置于搖床(60rpm)室溫孵育2h。吸去細(xì)胞裂解液，每格內(nèi)滴加100μl1x緩沖洗滌液，置于搖床(80rpm)洗滌5min×3次，吸去洗滌液。每格內(nèi)加入75μl1x抗體混合物，置于搖床(60rpm)室溫孵育1h。吸去抗體混合物，每格內(nèi)滴加100μl1x緩沖洗滌液，置于搖床(80rpm)洗滌5min×4次，吸去洗滌液。每格內(nèi)滴加75μl1xhrp-linkedstreptavidin，置于搖床(60rpm)室溫孵育30min。吸去hrp-linkedstreptavidin，每格內(nèi)滴加100μl1x緩沖洗滌液，置于搖床(80rpm)洗滌5min×4次，吸去洗滌液。拆下金屬夾及分隔柵欄，將有硝酸纖維素涂層面的玻璃板用用ecl發(fā)光液覆蓋，反應(yīng)后，于暗室內(nèi)顯影、定影。

pathscan結(jié)果顯示，達(dá)匹維林作用下，gbm細(xì)胞的akt(ser473),bad(ser112)和sapk/jnk(thr183/tyr185)的磷酸化水平較未作用組明顯升高。

實(shí)施例2檢測達(dá)匹維林的體內(nèi)抗腫瘤活性

6.1.4到6周的雄性裸鼠在spf級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)一周，以適應(yīng)環(huán)境。u87細(xì)胞在dmem培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)為10％胎牛血清，100ku/l青霉素和100mg/l鏈霉素)，37℃，5％co2,飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種裸鼠前，用0.25％胰酶消化傳代，離心后用pbs吹打混勻，重復(fù)離心1次。然后用預(yù)冷的pbs吹打均勾細(xì)胞成混懸液，置于碎冰上冰浴，備用。將腫瘤細(xì)胞懸液接種到裸鼠的右側(cè)背部皮下，每只裸鼠接種腫瘤細(xì)胞的個(gè)數(shù)約5×10⁷，觀察成瘤情況，如圖7(a)。2周后可見裸鼠右側(cè)背部形成直徑0.3cm瘤塊，開始給藥。給藥方案：對(duì)照組，含5％dmso的生理鹽水，每3天給藥1次；達(dá)匹維林濃度16mg/kg(溶解于含5％dmso的生理鹽水中)，每3天給藥1次；2組裸鼠均釆用腹腔注射給藥，實(shí)驗(yàn)全程監(jiān)測裸鼠體重，見圖7(b)。當(dāng)對(duì)照組腫瘤最大者直徑超過1cm后結(jié)束給藥，處死裸鼠取出腫瘤組織，見圖7(c)。累計(jì)給藥4次。用游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小如圖7(d)，按照以下公式計(jì)算：v(體積)＝l×w²/2，其中l(wèi)是腫瘤縱軸的長度，w為腫瘤橫軸的長度。切取大小適宜的腫瘤組織，用4％的多聚甲醛固定過夜。將固定組織用酒精進(jìn)行梯度脫水，后石蠟包埋，制成石蠟塊后將包埋腫瘤組織切成厚度5μm的石蠟切片，再用載玻片將石蠟切片撈起、烤片機(jī)上烘干。

6.2.he染色、免疫組化、tunel染色

he染色：切片脫蠟脫水：二甲苯、酒精(濃度由高到低)，蒸餾水洗凈，蘇木素染色1min，自來水沖干凈，鹽酸分化1秒，自來水沖干凈，伊紅浸染1秒，酒精從低到高脫水，自然晾干，中性樹脂封片，顯微鏡下鏡檢，如圖8(a)。

免疫組化：切片置于二甲苯中脫蠟，梯度酒精洗去二甲苯。蒸餾水洗凈，用枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液行熱抗原修復(fù)20min，自然冷卻到室溫，pbs漂洗5min，重復(fù)3次，用3％h2o2室溫10min阻斷內(nèi)源性的過氧化物酶，pbs漂洗5min，重復(fù)3次，用正常的羊血清封閉非特異性的結(jié)合位點(diǎn)，pbs漂洗5min，重復(fù)3次，每片玻片滴加50pl稀釋為工作液的一抗ki67室溫孵育2小時(shí)，pbs漂洗5min，重復(fù)3次，加入辣根過氧化物標(biāo)記的二抗，室溫30min，pbs漂洗5遍，重復(fù)3次，然后滴加dab顯色3～10min，顯微鏡下觀察有無顯色。蘇木素復(fù)染，自來水沖干凈，鹽酸分化1s，自來水沖干凈，50-60度水中返藍(lán)，梯度酒精脫水，中性樹膠封片，標(biāo)記然后鏡檢,結(jié)果如圖8(b)所示。

tunel染色：使用tunel試劑盒(roche細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒，pod)。組織切片進(jìn)行脫臘和水合處理，將組織切片浸入蛋白酶k工作液，21-37℃下反應(yīng)15-30min。制備tunel反應(yīng)混合液：滴加50μl酶溶液(管1)至余下的管2標(biāo)記溶液中(約450μl)，得到總體積500μl的tunel反應(yīng)混合液。設(shè)置陰性對(duì)照樣品：將經(jīng)固定和通透處理的細(xì)胞與50μl/每孔的標(biāo)記溶液一起孵育，標(biāo)記溶液中無末端轉(zhuǎn)移酶(非tunel反應(yīng)混合液)。設(shè)置陽性對(duì)照樣品：將經(jīng)固定和通透處理的細(xì)胞與微球菌核酸酶或重組的dnasei，gradei(3000u/ml-3u/ml，溶于50mmph7.5的tris-hcl，含10mmmgcl2，1mg/mlbsa)，15-25℃下處理10min，在標(biāo)記反應(yīng)前誘導(dǎo)dna鏈斷裂。使用蛋白酶k預(yù)處理組織切片后，用pbs漂洗玻片2次。吸干樣品周圍的水分，滴加50μltunel反應(yīng)混合液到樣品(對(duì)于陰性對(duì)照樣品，每個(gè)樣品滴加50μl不含末端轉(zhuǎn)移酶的標(biāo)記溶液)。加蓋，37℃下避光和加濕環(huán)境下反應(yīng)60min。用pbs漂洗玻片3次。熒光顯微鏡下，加滴pbs，進(jìn)行樣品分析。采用450-500nm激發(fā)波長，在515-565nm(綠光)范圍內(nèi)進(jìn)行熒光信號(hào)檢測。吸干樣品周圍的水分，滴加50μlpod轉(zhuǎn)換液(管3)到樣品上，37℃加濕環(huán)境下反應(yīng)30min。pbs漂洗玻片3次，滴加50-100μldab底物或者其他的pod底物，顯微鏡下觀察有無顯色。pbs漂洗玻片3次。蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片鏡檢，結(jié)果如圖9所示。

結(jié)果顯示，達(dá)匹維林組he染色切片在顯微鏡下可見點(diǎn)狀壞死灶被伊紅著色，對(duì)照組的he染色切片在顯微鏡下未見腫瘤壞死灶；ki67免疫組化染為棕褐色的代表增殖活性強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞，達(dá)匹維林組的ki67陽性率(9.93±1.53％)明顯低于對(duì)照組(25.78±1.89％)；tunel染色染為棕褐色的代表凋亡細(xì)胞，達(dá)匹維林組的凋亡細(xì)胞所占比率(4.00±0.83％)顯著高于對(duì)照組(1.32％±0.30％)。結(jié)果證實(shí)，達(dá)匹維林能夠介導(dǎo)腫瘤組織的細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤組織增殖。

6.3.毒性試驗(yàn)：取14只6～7周齡sd大鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為2組，分別為達(dá)匹維林組和陰性對(duì)照組，腹腔注射給藥，0、3d各給藥1次，共2次，設(shè)3w恢復(fù)期。其中，達(dá)匹維林組每只給藥劑量為16mg/kg，陰性對(duì)照組則每只給予1ml生理鹽水。每次給藥次日觀察注射部位有無發(fā)紅、腫脹、化膿、壞死等異常反應(yīng)。檢測指標(biāo)：初次給藥后約1w、恢復(fù)期第2w、第3w采血進(jìn)行血清生化檢驗(yàn)，血生化指標(biāo)包括：肝功能(alt、ast)和腎功能(crea、urea)相關(guān)指標(biāo)，結(jié)果如圖10所示。

結(jié)果顯示：臨床癥狀觀察結(jié)果顯示各組動(dòng)物在給藥前后均未見任何異常癥狀。觀察至第3w，全部動(dòng)物無異常癥狀，無死亡。達(dá)匹維林組與對(duì)照組血清生化檢驗(yàn)結(jié)果顯示，給藥前(第0d)兩組大鼠4項(xiàng)血生化指標(biāo)均無異常；初次給藥后1w時(shí)，查alt、ast、urea均無異常，crea結(jié)果示達(dá)匹維林組高于陰性對(duì)照組；恢復(fù)期第2、3w復(fù)查血生化指標(biāo)，達(dá)匹維林組與對(duì)照組4項(xiàng)指標(biāo)均無異常。試驗(yàn)結(jié)果表明在給予大鼠抗腫瘤劑量的達(dá)匹維林時(shí)，該藥物對(duì)于肝臟無明顯毒性，對(duì)于腎臟可能有一過性損傷作用，但并無持久影響。