本發(fā)明屬于生物技術領域，主要涉及WWC3蛋白分子的作用機制及利用這一機制在制備抗腫瘤藥物方面的應用。

背景技術：

Wnt信號通路與Hippo信號通路均參與生物胚胎發(fā)育，組織器官形成，細胞的增殖、分化與凋亡等重要生理過程，Wnt通路的異常激活和Hippo通路的失活與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著密切的聯(lián)系，揭示他們的內(nèi)在聯(lián)系將為制備抗腫瘤藥物提供重要的理論和實驗基礎。

腫瘤細胞中常常存在著異常的Wnt通路活性。Wnt通路的核心因子是β-連環(huán)蛋白（β-catenin），當經(jīng)典Wnt通路信號激活時， CK1δ/ε活化，活化的CK1δ/ε磷酸化Dishevelled （Dvls），最終導致胞漿內(nèi)β-catenin不被泛素化而蓄積、入核后的β-catenin與Tcf-4結(jié)合并激活Wnt通路的靶基因c-myc，CyclinD1，MMP7等轉(zhuǎn)錄活性，促進腫瘤細胞的增殖和侵襲。當β-catenin被蛋白酶體降解或不能入核時，則Wnt通路活性被中斷。

Hippo通路與腫瘤細胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移的關系備受重視。該通路的分子組成包括：上游分子（Fat，NF2，WWC1，AMOT蛋白等）、中央激酶復合體（MST1/2-WW45-LATS1/2-MOB）和下游效應分子（YAP蛋白）等。當Hippo通路被激活時則抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲，而當Hippo通路活性被抑制時，去磷酸化的YAP入核后則與TEAD(共輔助激活因子)結(jié)合，啟動其靶基因（CTGF和CyclinE等）的轉(zhuǎn)錄活性，促進腫瘤細胞的增殖和侵襲。

因此，發(fā)現(xiàn)既能抑制Wnt信號通路活性又能激活Hippo通路活性的因子，并揭示其作用的分子機制，將會為制備抗腫瘤的藥物或靶向藥物提供理想的作用靶點和重要的理論基礎。

WWC3是人類WWCs蛋白家族(WWC1,WWC2,WWC3)之一，WWCs均含有：近N端雙“WW”結(jié)構域（能與PPxY基序相互作用，參與Hippo通路的激活），中央部分為與膜相關的C2結(jié)構域，近C端為 aPKC結(jié)合位點（參與細胞極性的調(diào)節(jié)），C端為ADDV結(jié)構域（PDZ binding motif）。目前，有關WWCs家族在人類腫瘤中的作用僅限于WWC1參與Hippo通路的研究上。而WWC2和WWC3與人類腫瘤的關系及對Wnt信號通路活性是否有影響等未見報道。

技術實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：本發(fā)明的目的在于提供了WWC3蛋白分子在抑制Wnt信號通路的同時激活Hippo信號通路的作用和分子機制，以及證明存在這些機制的方法，為利用這些機制制備抗腫瘤（靶向）藥物提供依據(jù)。

技術方案：

WWC3蛋白分子在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于：所述WWC3蛋白分子為含有WW結(jié)構域和C2結(jié)構域的型蛋白；

所述WWC3通過DVLs抑制Wnt活性和通過LATS1激活Hippo通路活性。

所述的WWC3蛋白分子在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于：所述WWC3蛋白分子通過其自身的WW結(jié)構域和ADDV結(jié)構域與Wnt通路中重要的上游蛋白分子DVLs相互作用，該相互作用阻礙了CK1δ/ε激酶對DVLs的磷酸化，促進Wnt通路效應蛋白分子β-catenin的降解，減少β-catenin入核，發(fā)揮抑制Wnt通路活性的作用。

所述的WWC3蛋白分子在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于：利用WWC3的突變體和Dvl2剪接體，采用免疫共沉淀的方法證明了WWC3通過WW結(jié)構域和Dvl2的PY基序相互作用，也可通過ADDV結(jié)構域與Dvl2的PDZ結(jié)構域相互作用，發(fā)揮抑制Wnt通路活性的作用。

所述的WWC3蛋白分子在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于：

所述WWC3的突變體包括WWC3-ΔWW、WWC3-ΔADDV、WWC3-ΔWW&ADDV；

所述Dvl2剪接體包括Dvl2-ΔPDZ、Dvl2-ΔPY、Dvl2-ΔPDZ&PY。

所述的WWC3蛋白分子在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于：所述WWC3通過其自身的WW結(jié)構域與Hippo通路中央激酶LATS1相互作用，促進LATS1磷酸化，進而使Hippo效應蛋白YAP滯留于胞漿，發(fā)揮促進Hippo通路活性的作用。

所述的WWC3蛋白分子在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于： WWC3與LATS1激酶相互作用并發(fā)揮了激活Hippo通路活性的功能，而缺失WW結(jié)構域的WWC3則無此功能；

增加LATS1的表達，可使 WWC3與Dvl2的結(jié)合量減少；減少 LATS1的表達，則 WWC3與Dvl2的結(jié)合量增加，即LATS1與WWC3的結(jié)合同Dvl2存在著競爭性。

本發(fā)明的優(yōu)點：

本發(fā)明提供了一種WWC3蛋白分子的應用。本發(fā)明立足于分子生物學及細胞功能學試驗，設計嚴謹，真實性強，并且具有一定的創(chuàng)新性，WWC3通過影響Wnt及Hippo通路活性抑制肺癌細胞的增殖，侵襲能力，并在裸鼠模型中得以驗證，有較高的轉(zhuǎn)化醫(yī)學的應用前景，為臨床開發(fā)靶向治療藥物提供依據(jù)。

附圖說明

圖1為過表達WWC3對肺癌細胞集落形成能力的影響的結(jié)果對比圖(***P<0.001)；

圖2為敲除WWC3對肺癌細胞集落形成能力的影響的結(jié)果對比圖(***P<0.001)；

圖3為過表達WWC3對肺癌細胞侵襲能力的影響的結(jié)果對比圖(**P<0.01)；

圖4為敲除WWC3對肺癌細胞侵襲能力的影響的結(jié)果對比圖(**P<0.01)；

圖5為MTT法考察雙向調(diào)控WWC3的表達對肺癌細胞增殖能力的影響的結(jié)果對比圖(**P<0.01)；

圖6為過表達WWC3對裸鼠移植瘤形成能力（移植瘤體積和重量）的影響的結(jié)果對比圖(***P<0.001，**P<0.01，n=5)；

圖7為敲除WWC3對裸鼠移植瘤形成能力（移植瘤體積和重量）的影響的結(jié)果對比圖(**P<0.01，n=5)；

圖8為蛋白免疫印記考察WWC3在六種肺癌細胞系和正常支氣管上皮細胞HBE中表達的結(jié)果對比圖；

圖9為熒光素酶報告基因考察雙向調(diào)控WWC3對Wnt通路活性影響的結(jié)果對比圖(**P<0.01,*P<0.05)；

圖10為熒光素酶報告基因考察雙向調(diào)控WWC3對Hippo通路活性影響的結(jié)果對比圖(**P<0.01,***P<0.001)；

圖11為蛋白免疫印記考察雙向調(diào)控WWC3對Wnt通路與Hippo通路靶基因蛋白水平影響的結(jié)果對比圖;

圖12為實時定量PCR考察雙向調(diào)控WWC3對Wnt與Hippo通路靶基因mRNA水平影響的結(jié)果對比圖(*P<0.05);

圖13為免疫共沉淀考察WWC3與DVL2存在相互作用的蛋白印記圖;

圖14為WWC3野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒的結(jié)構模式圖;

圖15為DVL2野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒的結(jié)構模式圖;

圖16為免疫共沉淀考察WWC3通過其WW結(jié)構域和ADDV結(jié)構域與DVL2相互作用的免疫印記圖;

圖17為免疫共沉淀考察DVL2通過其PDZ結(jié)構域和PY基序與WWC3相互作用的免疫印記圖;

圖18為免疫共沉淀考察WWC3的WW結(jié)構域和ADDV結(jié)構域分別與DVL2的PY基序和ADDV結(jié)構域相互作用的免疫印記圖;

圖19為免疫共沉淀考察雙向調(diào)控WWC3對DVL2磷酸化水平影響的結(jié)果對比圖;

圖20為熒光素酶報告基因考察共同敲除WWC3與CK1δ/ε對Wnt通路活性的影響(***P<0.001);

圖21，22為蛋白免疫印記考察在敲除WWC3的基礎上，抑制CK1δ/ε活性或敲除CK1δ/ε的表達，DVL2磷酸化水平的變化對比圖。

圖23為免疫共沉淀考察梯度轉(zhuǎn)染W(wǎng)WC3后CK1δ/ε與DVL2結(jié)合量的變化；梯度轉(zhuǎn)染CK1δ/ε后WWC3與DVL2結(jié)合量的變化對比圖。

圖24為熒光素酶報告基因考察在H1299轉(zhuǎn)染W(wǎng)WC3和突變體后Wnt通路活性的變化對比圖(**P<0.01,*P<0.05);

圖25為蛋白免疫印記考察在H1299轉(zhuǎn)染W(wǎng)WC3和突變體后DVL磷酸化水平和Wnt通路靶基因表達的變化對比圖

圖26為蛋白免疫印記考察雙向調(diào)控WWC3的表達對Hippo通路主要蛋白LATS與YAP磷酸化水平的影響的結(jié)果對比圖

圖27為熒光素酶報告基因考察在H1299轉(zhuǎn)染W(wǎng)WC3和突變體后Hippo通路活性的變化對比圖(*P<0.05);

圖28為免疫共沉淀考察WWC3與LATS1存在相互作用的免疫印記圖

圖29為免疫共沉淀考察過表達DVL2后WWC3與LATS1結(jié)合量變化的結(jié)果對比圖

圖30為免疫共沉淀考察敲除DVL2后WWC3與LATS1結(jié)合量變化的結(jié)果對比圖

圖31為免疫共沉淀考察過表達LATS1后WWC3與DVL2結(jié)合量變化的結(jié)果對比圖

圖32為免疫共沉淀考察敲除LATS1后WWC3與DVL2結(jié)合量變化的結(jié)果對比圖

圖33為蛋白免疫印記考察在過表達WWC3的基礎上，轉(zhuǎn)染DVL2，LATS1和YAP磷酸化水平改變的結(jié)果對比圖

圖34為蛋白免疫印記考察在過表達WWC3的基礎上，敲除DVL2，LATS1和YAP磷酸化水平改變的結(jié)果對比圖

圖35為為蛋白免疫印記考察在過表達WWC3的基礎上，轉(zhuǎn)染DVL2及突變體，LATS1和YAP磷酸化水平改變的結(jié)果對比圖

具體實施方式：

1. WWC3具有抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲作用并在肺癌細胞中低表達

（1）在體外與體內(nèi)實驗中，WWC3均能抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲

為了驗證WWC3在體內(nèi)外的生物學功能的影響，選擇WWC3低表達的H1299肺癌細胞系，轉(zhuǎn)染W(wǎng)WC3過表達質(zhì)粒(G418篩選)；在相對高表達WWC3的A549細胞中轉(zhuǎn)染shRNA- WWC3(G418篩選)，篩選后進行細胞功能學實驗。

(1-1）集落形成實驗：將對照組和轉(zhuǎn)染(敲除)組細胞接種到6cm²培養(yǎng)皿中(1000個/皿)，1640培養(yǎng)基培養(yǎng)12天后，用磷酸鹽緩沖液清洗兩次，冰甲醇固定20min，然后Gimsa染色10min，最后計數(shù)數(shù)目。實驗重復三次，取平均值。我們發(fā)現(xiàn)過表達WWC3能夠顯著抑制肺癌細胞的克隆形成能力(圖1)，敲除WWC3后克隆形成能力增強（圖2）。

（1-2）基質(zhì)膠侵襲實驗：在24孔板中以雙無的1640培養(yǎng)基按照1：3的比例稀釋基質(zhì)膠(BD Biosciences)，鋪8微米孔徑的上室(Costar)。然后將轉(zhuǎn)染后的A549、H1299以100微升含有5×10⁵個的細胞密度接種在上室并孵育16小時。下室放含有10%小牛血清的培養(yǎng)基。種植后培養(yǎng)48小時后，甲醇固定15分鐘，蘇木素染色。隨機選取10個視野，計數(shù)侵襲到小室下的細胞數(shù)。實驗重復三次，取平均值。我們發(fā)現(xiàn)過表達WWC3能夠顯著抑制肺癌細胞的侵襲能力（圖3），敲除WWC3后肺癌細胞侵襲能力增強（圖4）。

（1-3）MTT實驗：96孔板中用含10%血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)約3000個左右的轉(zhuǎn)染后的A549、H1299細胞，每個孔加入20 微升的5 mg/ml MTT (Thiazolyl Blue)溶液，在37℃孵育4小時后，去除溶液，用150微升的DMSO溶解生成的MTT結(jié)晶，用分光光度計檢測490nm波長的吸收峰值進行定量。我們發(fā)現(xiàn)過表達WWC3后肺癌細胞增殖能力減弱，敲除WWC3后肺癌細胞增殖能力增強（圖5）。

（1-4）裸鼠皮下成瘤實驗：上述轉(zhuǎn)染的 H1299和A549細胞懸液進行裸鼠(BALB/c)背部皮下接種(對照組和實驗組各五只裸鼠)，每只裸鼠接種0.2ml細胞懸液（約含細胞1×10⁷個）后無菌條件下飼養(yǎng)，以便觀察WWC3對腫瘤細胞體內(nèi)增殖情況的影響。觀察并測量腫瘤大小與小鼠體重（每3天測量一次），繪制腫瘤生長曲線和小鼠生存曲線。8周統(tǒng)一處死，取瘤體稱取瘤重，觀察是否存在轉(zhuǎn)移灶。腫瘤制作石蠟切片。我們發(fā)現(xiàn)過表達WWC3組的瘤體質(zhì)量與體積明顯小于空白對照組（圖6），敲除WWC3組的瘤體質(zhì)量與體積明顯大于空白對照組（圖7）。

（1-5）經(jīng)裸鼠尾靜脈體內(nèi)成瘤實驗：上述轉(zhuǎn)染的H1299和A549細胞懸液進行裸鼠尾靜脈接種，每只裸鼠接種0.1ml細胞懸液（約含細胞1×10⁶個）后無菌條件下飼養(yǎng)，以便檢測WWC3對腫瘤細胞全身轉(zhuǎn)移情況的影響。觀察并測量小鼠體重（每3天測量一次），繪制小鼠生存曲線。8周統(tǒng)一處死，取小鼠全身主要臟器(心、肝、脾、肺、腎)，稱重，肉眼觀察臟器表面是否存在轉(zhuǎn)移灶，固定臟器制作石蠟切片。應用HE染色法鏡下觀察臟器中是否存在腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。如存在轉(zhuǎn)移，比較轉(zhuǎn)染組和空白對照組的腫瘤轉(zhuǎn)移面積和數(shù)目的多少。我們發(fā)現(xiàn)：過表達WWC3組與空白對照組相比，(肺)腫瘤轉(zhuǎn)移數(shù)目和面積顯著減少；敲除WWC3組，肺轉(zhuǎn)移數(shù)目和大小顯著增加。

（2）WWC3在肺癌組織（癌細胞系）中為低表達

用預冷的RIPA裂解液（RIPA ：PMSF=100：1）對6種肺癌細胞系（A549、H1299、H460、H292、LK2、Calu1）及正常支氣管上皮細胞HBE的進行裂解，冰上超聲3 次，放置10 分鐘，4℃，12000rpm離心15分鐘，取上清，用BCA試劑盒測定總蛋白含量，以BSA 為標準品。通過8%濃度的SDS-PAGE進行蛋白分離，上樣量為60微克，電泳1小時，將凝膠中的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，取出后以磷酸鹽吐溫緩沖液（PBS 中加入0.1%(v/v) 吐溫20）洗膜液洗膜5分鐘后，將膜放入含5% 脫脂奶粉的磷酸鹽吐溫緩沖液中，搖床上室溫封閉120 分鐘；磷酸鹽吐溫緩沖液洗膜5分鐘后，將膜放入一抗WWC3—1：500，Sigma，GAPDH—1：10000，Sigma，4°C過夜；磷酸鹽吐溫緩沖液洗膜10 分鐘×3 次；辣根酶標記山羊抗兔IgG(1:3000，中杉金橋)、山羊抗鼠IgG(1:3000，中杉金橋) 室溫搖床上孵育振蕩120 分鐘，磷酸鹽吐溫緩沖液洗膜10 分鐘×3 次；使用發(fā)光液(Pierce) 發(fā)光。ECL發(fā)光后，利用ImageJ進行條帶灰度值測定，以WWC3/GAPDH的比值作為相對表達量, 實驗重復三次取均值（圖8）。

具有抑制Wnt通路、促進Hippo通路活性的作用

選擇WWC3低表達的H1299細胞系進行WWC3的過表達實驗。為了更加直觀的觀察結(jié)果，我們采用了Wnt3A（50ng/mL）對細胞的Wnt活性進行了預刺激使其信號放大。在24孔板內(nèi)利用脂質(zhì)體Lipo3000(Invitrogen)共轉(zhuǎn)染0.5微克的WWC3與0.5微克的Super 8x Top Flash(Wnt通路報告基因質(zhì)粒)以及50納克對照質(zhì)粒pRL-TK(海腎素)， pEGFP-C2空載體作為過表達質(zhì)粒的陰性對照。在37°C孵育30小時后，采用雙熒光素梅報告基因檢測系統(tǒng)（Promega, Madison, WI）檢測報告基因的表達(采用Super 8x TOP Flash報告基因活性與pRL-TK海參素報告基因活性的比值作為TCF-4介導的Wnt通路活性的值)，結(jié)果顯示W(wǎng)WC3能夠顯著抑制Wnt3A誘導的Wnt通路活性（圖9）。同樣，在H1299細胞中，共轉(zhuǎn)染W(wǎng)WC3與pGL3b_8xGTIIC(Hippo通路報告基因質(zhì)粒)以及pRL-TK(方法、劑量同前)，熒光素酶報告基因顯示W(wǎng)WC3能夠顯著抑制YAP活性(促進Hippo通路活性)（圖10）。

選擇相對高表達WWC3的A549細胞系進行WWC3的干擾實驗。在A549中共轉(zhuǎn)染shRNA-WWC3與Super 8x TOP Flash質(zhì)粒(Wnt通路報告基因質(zhì)粒)以及pRL-TK質(zhì)粒(方法、劑量同前)，結(jié)果顯示敲除WWC能夠顯著增加Wnt3A誘導的Wnt通路活性（圖9）。同理，在A549中共轉(zhuǎn)染shRNA-WWC3與pGL3b_8xGTIIC(Hippo通路報告基因質(zhì)粒)與pRL-TK質(zhì)粒(方法、劑量同前)，結(jié)果顯示敲除WWC3能夠促進YAP活性(抑制Hippo通路活性)（圖10）。

在H1299細胞中轉(zhuǎn)染W(wǎng)WC3，48h后提取蛋白及RNA，Western Blot及qPCR技術檢測發(fā)現(xiàn)WWC3的過表達能夠顯著下調(diào)Wnt通路主要蛋白non-phosphorylated β-catenin，以及靶基因c-myc、MMP7、cyclinD1的蛋白及mRNA表達水平，同時下調(diào)Hippo通路靶基因CTGF的蛋白及mRNA表達水平（圖13,14）。在A549中轉(zhuǎn)染shRNA-WWC3，Western Blot及qPCR技術檢測發(fā)現(xiàn)敲除WWC3能夠顯著上調(diào)Wnt通路主要蛋白non-phosphorylated β-catenin，以及靶基因c-myc、MMP7、cyclinD1的蛋白及mRNA表達水平，同時上調(diào)Hippo通路靶基因CTGF的蛋白及mRNA表達水平（圖11,12）。

因此，WWC3是一種抑制Wnt通路同時促進Hippo通路活性的蛋白分子。

通過WW結(jié)構域和ADDV結(jié)構域分別與Dvl2的PY基序和PDZ結(jié)構域相互作用

A549細胞系用5mL PBS清洗兩遍，并用1mL NP-40裂解液冰浴15分鐘后，將細胞裂解產(chǎn)物從培養(yǎng)板中轉(zhuǎn)移至新的1.5mL EP管中，在裂解產(chǎn)物4℃ 16000g離心20分鐘后將上清轉(zhuǎn)移至新管中，加入protein(A+G) beads(Santa Cruz Technology),4℃旋轉(zhuǎn)搖床2h后，取上清至新的離心管，加入Dvl2抗體(2μL/mg)，作為誘餌蛋白進行沉降，4℃旋轉(zhuǎn)過夜。次日加入protein(A+G) besds，4℃旋轉(zhuǎn)6h后，1000rpm 5min 4℃，棄上清，保留沉淀，加入1mLRIPA裂解液(RIPA:PMSF=100:1)洗磁珠，反復3次后，加入2×Loading Buffer，煮樣10min，進行Western Blot檢測。結(jié)果顯示內(nèi)源性WWC3與Dvl2存在相互作用。同樣，在A549中共轉(zhuǎn)染GFP-WWC3及FLAG-Dvl2質(zhì)粒，免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)外源性的WWC3和Dvl2同樣可以相互作用(方法同前)（圖13）。

構建WWC3剪接體(WWC3-ΔWW、WWC3-ΔADDV、WWC3-ΔWW&ADDV) 與Dvl2剪接體(Dvl2-ΔPDZ、Dvl2-ΔPY、Dvl2-ΔPDZ&PY)（圖14,15），以確定WWC3與Dvl2相互作用的結(jié)合位點。

在H1299細胞系中共轉(zhuǎn)染W(wǎng)WC3野生型質(zhì)粒及Dvl2野生型和突變體質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后48h，收集細胞，免疫共沉淀顯示Dvl2通過其PDZ結(jié)構域和PY基序與WWC3相互作用(方法同前)（圖17）；同樣，在H1299中共轉(zhuǎn)染Dvl2野生型質(zhì)粒和WWC野生型和突變體質(zhì)粒，免疫共沉淀顯示W(wǎng)WC3通過其WW結(jié)構域和ADDV結(jié)構域與Dvl2相互作用(方法同前)（圖16）。

在H1299中共轉(zhuǎn)染W(wǎng)WC3-ΔWW與Dvl2-ΔPY質(zhì)粒，免疫共沉淀顯示保留ADDV結(jié)構域的WWC3與保留PDZ結(jié)構域的Dvl2能夠相互作用（圖18）；在H1299中共轉(zhuǎn)染W(wǎng)WC3-ΔADDV與Dvl2-ΔPDZ質(zhì)粒，免疫共沉淀顯示保留WW結(jié)構域的WWC3與保留PY結(jié)構域的Dvl2仍能夠相互作用（圖19）。

因此：WWC3是通過其自身的WW結(jié)構域和ADDV結(jié)構域分別與Dvl2的PY基序和PDZ結(jié)構域相互作用。

4.WWC3與Dvl2的相互作用阻礙了CK1δ/ε對Dvl2的磷酸化而負性調(diào)控Wnt通路活性

在H1299細胞中轉(zhuǎn)染W(wǎng)WC3質(zhì)粒，48h后提取蛋白，Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)：WWC3的過表達能夠顯著下調(diào)Dvl2的磷酸化；在A549中轉(zhuǎn)染shRNA- WWC3，Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)WWC3的敲除能夠顯著上調(diào)Dvl2的磷酸化（圖20）。

在A549細胞中轉(zhuǎn)染shRNA-WWC3，同時加入CK1δ/ε抑制劑(IC261,Santa Cruz Technology)，或轉(zhuǎn)染siRNA-CK1δ/ε，37℃ 30小時后，熒光素酶報告基因和Western Blot(方法同前)顯示：敲除CK1δ/ε或抑制其活性能夠顯著逆轉(zhuǎn)由于WWC3沉默引起的Wnt通路活性的上調(diào)（圖20）以及Dvl2磷酸化的上調(diào)（圖21,22）。

在H1299細胞中梯度轉(zhuǎn)染W(wǎng)WC3，免疫共沉淀顯示：隨著WWC3表達的逐漸增加，CK1ε與Dvl2的結(jié)合量逐漸減少（方法同前）（圖23）；另一方面，在H1299中梯度轉(zhuǎn)染CK1ε，免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)：隨著CK1ε表達的逐漸增加，WWC3與Dvl2的結(jié)合量逐漸減少（方法同前）（圖23）

最后在H1299細胞中轉(zhuǎn)染W(wǎng)WC3和WWC3突變體，熒光素酶報告基因顯示W(wǎng)WC3野生型能夠顯著抑制Wnt通路活性，而WWC3-ΔWW&ADDV（不能與Dvl2結(jié)合）則無此作用（方法同前）（圖24）；蛋白免疫印記發(fā)現(xiàn)：野生型WWC3能夠下調(diào)Wnt通路中p-Dvl2，活化的β-catenin和靶基因蛋白表達水平，而WWC3-ΔWW&ADDV（不能與Dvl2結(jié)合）則無此作用（方法同前）（圖25）

5.LATS1與Dvl2競爭性結(jié)合WWC3而促進Hippo通路活性

在H1299細胞中轉(zhuǎn)染W(wǎng)WC3質(zhì)粒，48h后提取蛋白，Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)：YAP與LATS激酶的磷酸化水平上調(diào)（圖24）；相反，在A549中敲除WWC3后，Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)：YAP與LATS激酶的磷酸化水平下調(diào)（圖26）；上述結(jié)果均這證明WWC3為Hippo通路的正向調(diào)節(jié)因子。

在H1299中分別轉(zhuǎn)染W(wǎng)WC3和WWC3的三種突變體質(zhì)粒，利用熒光素酶報告基因?qū)嶒?，發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，WWC3能夠顯著減低YAP活性(激活Hippo通路)，而缺失WW結(jié)構域的Mutant1與Mutant3則不能（圖27）；同時我們應用免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)野生型WWC3能夠與LATS1激酶相互作用，而缺失WW結(jié)構域的WWC3則不能（圖28）。這說明WWC3的WW結(jié)構域促進Hippo通路激活中起到重要作用。

根據(jù)Dvl2也能與WWC3的WW結(jié)構域結(jié)合這一實驗結(jié)果，說明LATS1和Dvl2都可以與WWC3的同一位點結(jié)合。因此，我們預測：LATS1與Dvl2很有可能競爭性結(jié)合WWC3，進而影響Hippo通路活性。為了證明這一推測，一方面在H1299中過表達Dvl2，免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)WWC3與LATS1的結(jié)合減少（圖29）；在H1299中敲除Dvl2，免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)WWC3與LATS1的結(jié)合量增多（圖30）。另一方面我們在H1299中過表達LATS1，免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)WWC3與Dvl2的結(jié)合量減少（圖31）；在H1299中干擾LATS1的表達，免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)WWC3與Dvl2的結(jié)合量增加（圖32）。這些證明了LATS1和Dvl2能夠競爭性結(jié)合WWC3.

為了探究LATS與Dvl2競爭性結(jié)合WWC3后對Hippo通路活性有怎樣的影響，在H1299中共轉(zhuǎn)染W(wǎng)WC3與Dvl2兩種質(zhì)粒，48h后，Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)Dvl2能夠逆轉(zhuǎn)WWC3引起的p-LATS1、p-YAP水平上調(diào)（圖33）；在H1299中共轉(zhuǎn)染W(wǎng)WC3質(zhì)粒與siRNA-Dvl2，Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)敲除Dvl2能夠進一步上調(diào)WWC3引起的LATS1與YAP的磷酸化（圖34）。

最后在H1299中共轉(zhuǎn)染W(wǎng)WC3質(zhì)粒和Dvl2野生型及突變體質(zhì)粒，Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)能夠與WWC3結(jié)合的野生型Dvl2質(zhì)粒能夠逆轉(zhuǎn)WWC3引起的p-LATS1與p-YAP水平的上調(diào)，而不能與WWC3結(jié)合的Dvl2 Mutant3質(zhì)粒則不能逆轉(zhuǎn)（圖35）。