一種鑒別濃度對(duì)蛋白質(zhì)分子二級(jí)結(jié)構(gòu)影響的檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種鑒別濃度對(duì)蛋白質(zhì)分子二級(jí)結(jié)構(gòu)影響的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)借助Langmuir-Blodgett成膜技術(shù)，將待測(cè)蛋白質(zhì)分子溶液滴加于亞相的表面，觀察其能否形成Langmuir單分子膜；(2)若能夠生成Langmuir單分子膜，自滴加時(shí)刻起，采集表面壓力π隨時(shí)間的變化曲線，即實(shí)時(shí)π-t動(dòng)力學(xué)曲線；若π-t動(dòng)力學(xué)曲線中的π表現(xiàn)為一上升的，并且最終呈一穩(wěn)定數(shù)值的曲線，則該蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)保持良好；若π-t動(dòng)力學(xué)曲線中的π表現(xiàn)為一下降趨勢(shì)，則表明蛋白質(zhì)被溶劑化嚴(yán)重，二級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞。本發(fā)明可用于監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的變化，操作簡(jiǎn)單。通過(guò)實(shí)時(shí)測(cè)定不同濃度下蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)變化來(lái)調(diào)控設(shè)計(jì)新型免疫藥物。同時(shí)，對(duì)于指導(dǎo)生產(chǎn)不同分子構(gòu)象的乳制品具有重要商用價(jià)值。
【專利說(shuō)明】一種鑒別濃度對(duì)蛋白質(zhì)分子二級(jí)結(jié)構(gòu)影響的檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種鑒別濃度對(duì)蛋白質(zhì)分子二級(jí)結(jié)構(gòu)影響的檢測(cè)方法，具體地說(shuō)是一 種通過(guò)采集蛋白質(zhì)溶液在亞相表面形成Langmuir單分子膜過(guò)程的表面壓力隨時(shí)間（π -t) 動(dòng)力學(xué)曲線以及通過(guò)壓縮Langmuir膜，獲得表面壓對(duì)單分子膜面積的（π-A)吸附等溫線 的方法，用以鑒別蛋白質(zhì)分子構(gòu)象變化。

【背景技術(shù)】
[0002] 作為生命物質(zhì)的基礎(chǔ)，蛋白質(zhì)具極其重要的地位。蛋白質(zhì)不同的空間結(jié)構(gòu)也決定 了其功能的千差萬(wàn)別。了解蛋白質(zhì)構(gòu)象有利于利用他們的生物活性作用發(fā)展免疫科學(xué)和 指導(dǎo)乳制品的生產(chǎn)制造。蛋白質(zhì)的研究中，牛血清白蛋白（BSA)、人血清白蛋白（HSA)最為 常見(jiàn)，在過(guò)去十幾年里被廣泛研究。其中，J. F. Foster在研究牛血清白蛋白水溶液因 PH不 同而引起的構(gòu)象變化時(shí)，提出了一個(gè)經(jīng)典模型：N(normal) - F(fast) - E(expanded)。因 為在蛋白質(zhì)構(gòu)象變化過(guò)程中，包括空間位阻，范德華力，氫鍵，疏水效應(yīng)，以及多肽和周圍溶 劑相互作用等多種作用力的相互作用。所以，對(duì)于通過(guò)捕捉蛋白質(zhì)構(gòu)象變化過(guò)程中瞬息即 變的外貌變化來(lái)澄清蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的機(jī)理是十分困難的。雖然許多實(shí)驗(yàn)和理論的工作 都在加深我們對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象轉(zhuǎn)變的認(rèn)識(shí)，但是蛋白質(zhì)構(gòu)象變化問(wèn)題仍然沒(méi)有得到很好的解 決。(1:Foster J. F.，Samsa E. G.，Journal of the American Chemical Societyl951, 73, 3 187-3190. 2:Masaru S.，Joseph F.，Biochemistry 1986, 7, 2172-2182. 3:Khan Μ. Y.，Bioch emicall986, 236, 307-310. 4:Fersht A. R.，Daggett V.，Cell2002, 108, 573-582.5:Pereir a L· G. C.，Theodoly 0·，Blanch H. W.，Radke C. J.，Langmuir2003，19, 2349-2356. 6:Barbos a L. R. S. et al. Biophysical Journal2010, 98, 147-157. 7 :Bramanti E. , Ferrari C. , Angeli V.，Onor M.，Synovec R. E.，Talanta2011，85, 2553-2561.)
[0003] 目前，在探究引起蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的因素方面，主要有pH，離子強(qiáng)度，表面活性劑 或脂肪類物質(zhì)等方面因素。但是，對(duì)于蛋白質(zhì)最常用的溶劑-水，是否會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的轉(zhuǎn) 變產(chǎn)生影響則很少被研究。直到現(xiàn)在，蛋白質(zhì)分子濃度變化是否會(huì)引起自身構(gòu)象的變化這 一課題鮮有研究。眾所周知，不同結(jié)構(gòu)構(gòu)象的蛋白質(zhì)在生物體中承擔(dān)不同的角色，澄清其 構(gòu)象的變化對(duì)于研究其生物催化活性具有重要意義，已經(jīng)有相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)表，但通過(guò)表面化 學(xué)的方法，對(duì)于設(shè)計(jì)新型免疫藥物、具有高活性的生物催化劑、高質(zhì)量乳制品及相關(guān)的生產(chǎn) 加工具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。（l:Shen Y.R.，0stroverkhov，Chemical Reviews2006, 106, 114 0-1154. 2:McClellan S. J. , Franses E. , Colloids and Surfaces B:Biointerfaces2003, 28 ,63-75. 3:Noskov B. A. , et al. , Langmuir2010, 26, 17225 - 17231. 3:Bhattacharya M. , Jain N. , Bhasne K. , Kumari V. , Mukhopadhyay S. , Journal of Fluorescence2011, 21, 1083-109 O. 4:Noskov B. A. , Mikhailovskaya A. A. , Lin S. Y. , Loglio G. , Miller R. , Langmuir2010, 26, 17225-1723. 5:Wang J.，Buck S.M.，Chen Z.，Analyst2003, 128, 773-778. 6:Lu J. R.，Su T. J. , Thomas R. K. , Journal of Colloid and Interface Science 1999, 213, 426-437.)


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明是在提供一種蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的檢測(cè)方法。即借助Langmuir-Blodgett成 膜技術(shù)，通過(guò)實(shí)時(shí)測(cè)定表面壓（η)隨時(shí)間（t)的動(dòng)力學(xué)曲線（π-t)，快速得出蛋白質(zhì)的構(gòu) 象變化情況。
[0005] 本發(fā)明解決技術(shù)問(wèn)題采用如下技術(shù)方案：
[0006] (1)將待測(cè)蛋白質(zhì)分子溶液借助Langmuir-Blodgett成膜技術(shù)制備血清白蛋白的 Langmuir單分子膜；
[0007] (2)采集蛋白質(zhì)分子形成Langmuir單分子膜過(guò)程的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)；即實(shí)時(shí)測(cè)定 Langmuir單分子膜表面壓隨時(shí)間的π-t動(dòng)力學(xué)曲線；若π-t表現(xiàn)為一上升的、并且最終 呈一穩(wěn)定數(shù)值的曲線，則該蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)保持良好；若n-t動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)為一下降趨 勢(shì)，這表明蛋白質(zhì)被溶劑化嚴(yán)重，二級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞；分子中氫鍵斷裂，取而代之的是與水分 子形成分子間氫鍵，此時(shí)，蛋白質(zhì)分子從原來(lái)的心形結(jié)構(gòu)變成展開(kāi)狀，并伴隨催化析氫活性 的降低。
[0008] 本發(fā)明所述蛋白質(zhì)分子的Langmuir單分子膜的制備中以去離子水或磷酸鹽緩沖 液為亞相。
[0009] 與已有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果體現(xiàn)在：
[0010] (1)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，在外界因素（如溫度、壓力、pH值、離子強(qiáng)度、表面活性劑的加入 等）恒定條件下，蛋白質(zhì)溶液還會(huì)因自身濃度的不同而發(fā)生構(gòu)象的轉(zhuǎn)變；因此本發(fā)明采用 LB成膜技術(shù)，通過(guò)采集蛋白質(zhì)形成Langmuir單分子膜過(guò)程的Langmuir單分子膜表面壓隨 時(shí)間的n _t動(dòng)力學(xué)參數(shù)來(lái)鑒別蛋白質(zhì)分子構(gòu)象變化。
[0011] (2)本發(fā)明可用于監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的變化，操作簡(jiǎn)單。通過(guò)實(shí)時(shí)測(cè)定不同濃度 下蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)變化來(lái)調(diào)控設(shè)計(jì)新型免疫藥物。同時(shí)，對(duì)于指導(dǎo)生產(chǎn)不同分子構(gòu)象的 乳制品具有重要商用價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1是構(gòu)建蛋白質(zhì)Langmuir膜的示意圖
[0013] 圖2是本發(fā)明水為亞相的π -t動(dòng)力學(xué)曲線
[0014] 圖3是本發(fā)明水為亞相的π -A等溫線
[0015] 圖4是本發(fā)明PH = 4. 2的磷酸鹽緩沖溶液π -t動(dòng)力學(xué)曲線
[0016] 圖5是本發(fā)明PH = 7. 2的磷酸鹽緩沖溶液π -t動(dòng)力學(xué)曲線 [0017] 圖6是本發(fā)明的圓二色譜圖（⑶）
[0018] 圖7本發(fā)明的消弱全反射譜（FTIR)
[0019] 圖8本發(fā)明的原子力顯微鏡圖（AFM)
[0020] 圖9本發(fā)明的原子力顯微鏡圖（AFM)
[0021] 圖10本發(fā)明的電化學(xué)催化析氫

【具體實(shí)施方式】
[0022] 本發(fā)明可用于鑒別濃度對(duì)蛋白質(zhì)（牛血清白蛋白，人血清白蛋白，酪蛋白，乳白蛋 白，乳球蛋白）分子二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，以下實(shí)例以牛血清白蛋白為實(shí)例進(jìn)行說(shuō)明。
[0023] 實(shí)施例1 :
[0024] 配置濃度為8. Oppm，體積為0. lmL的牛血清白蛋白溶液，將其滴加進(jìn)盛有190mL 去離子水的亞相中，測(cè)量表面壓與時(shí)間的n _t動(dòng)力學(xué)曲線，找出穩(wěn)定成膜時(shí)間，由圖2可 以看到，表面壓隨時(shí)間的增長(zhǎng)逐漸上升抬起，并在大于600min時(shí)，保持了動(dòng)態(tài)平衡，表明 Langmuir膜達(dá)到了可逆-平衡狀態(tài)，說(shuō)明穩(wěn)定成膜時(shí)間為600min。通過(guò)對(duì)π -t的一級(jí)動(dòng) 力學(xué)擬合，獲得表面分子對(duì)亞相的分配平衡常數(shù)Kd，并由熱力學(xué)公式-Λ G = RTlnKd計(jì)算 出Langmuir膜的表面吉布斯剩余自由能（AG)。結(jié)果表明分配平衡常數(shù)Kd〈l，說(shuō)明蛋白分 子僅有部分停留在A/W界面成膜，多數(shù)蛋白分子則分散在亞相；AG〈10KJ/mol，說(shuō)明BSA分 子構(gòu)象的變化不涉及化學(xué)鍵的形成。通過(guò)壓縮Langmuir膜，記錄表面壓力對(duì)單分子膜面積 的π-Α吸附等溫曲線，由圖3看到有兩個(gè)相轉(zhuǎn)變點(diǎn)。第一個(gè)相變點(diǎn)為氣態(tài)到液態(tài)擴(kuò)張膜， 第二個(gè)相變點(diǎn)為液態(tài)擴(kuò)張膜到液態(tài)凝聚膜。相變點(diǎn)的最小抬起面積（MLA)定義為表面壓恰 好從零開(kāi)始上升時(shí)BSA單位分子占有的面積，是一個(gè)理論值，該值可以對(duì)BSA蛋白分子尺寸 結(jié)構(gòu)進(jìn)行定性描述。圖中MLA值為9.0nm2。由圖6⑶譜顯示，在208nm，221nm有兩負(fù)峰， 在193nm有一正峰，證明含有a-helix結(jié)構(gòu)，而且其含量為31. 5%。該⑶同時(shí)可以得到 β -sheet含量為23. 5%，β -turn含量為4. 3%，Random coil含量為28. 9%。在該圖中同 時(shí)可以看到〇. 8ppm牛血清白蛋白溶液，在193nm沒(méi)有出現(xiàn)峰，說(shuō)明BSA在此低濃度下的基 本為無(wú)序結(jié)構(gòu)。〇.8ppm下a-helix含量13.4%。β-sheet含量為25.0%，β-turn含量 為20. 1%，Random coil含量為41. 5%，說(shuō)明濃度降低a-helix含量逐漸降低，β-sheet, β-turn, Random coil含量相繼增高，說(shuō)明隨濃度的降低，BSA分子構(gòu)象確實(shí)發(fā)生了變化。 CD譜的紅移同時(shí)說(shuō)明牛血清白蛋白內(nèi)部分子鍵與水分子發(fā)生溶解或自組裝，導(dǎo)致低濃度下 牛血清白蛋白的無(wú)序結(jié)構(gòu)。圖7，F(xiàn)TIR譜圖顯示牛血清白蛋白的紅外譜圖分別在1658cm-l 和1550cm-l出現(xiàn)表示酰胺I、酰胺II的峰。與該圖中0· 8ppm的BSA，在1640cm-l有一個(gè) 水的強(qiáng)吸收峰，酰胺I的峰比8. Oppm的峰更寬且出現(xiàn)紅移現(xiàn)象，酰胺II峰的消失證明了蛋 白質(zhì)構(gòu)象的轉(zhuǎn)變圖8為AFM，圖中顯示了該濃度下BSA分子呈現(xiàn)出粗糙不平的表面結(jié)構(gòu)，與 圖9濃度為0. 8ppm的BSA分子相比較而言表面十分凹凸不平，說(shuō)明隨濃度的降低，BSA分子 逐漸發(fā)生了構(gòu)象的變化，表現(xiàn)出的形貌也趨于平坦。圖10顯示，催化析氫峰電位為-1. 76V。 較其他低濃度的BSA催化析氫峰電位值而言要偏正，說(shuō)明高濃度下的BSA分子結(jié)構(gòu)更有利 于催化析氫反應(yīng)的進(jìn)行。
[0025] 實(shí)施例2 :
[0026] 配置濃度為2.0--111，體積為0.41^牛血清白蛋白溶液，將其滴加進(jìn)盛有19〇1^去 離子水的亞相中，測(cè)量表面壓與時(shí)間的n-t動(dòng)力學(xué)曲線，找出穩(wěn)定成膜時(shí)間，由圖2可以看 至IJ，該實(shí)施例與實(shí)施例1規(guī)律一樣，均表現(xiàn)出上升抬起，并最終成動(dòng)態(tài)穩(wěn)定。具體表現(xiàn)為，表 面壓隨時(shí)間的增長(zhǎng)逐漸上升抬起，并在大于600min時(shí)，保持了動(dòng)態(tài)平衡，表明Langmuir膜 達(dá)到了可逆-平衡狀態(tài)，說(shuō)明穩(wěn)定成膜時(shí)間為600min。通過(guò)對(duì)π-t的一級(jí)動(dòng)力學(xué)擬合， 結(jié)合熱力學(xué)公式-Λ G = RTlnKd計(jì)算出Langmuir膜的表面吉布斯剩余自由能AG〈10KJ/ mol,說(shuō)明BSA分子構(gòu)象的變化不涉及化學(xué)鍵的形成。通過(guò)壓縮Langmuir膜，記錄表面壓力 對(duì)單分子膜面積的η-A吸附等溫曲線，由圖3看到有兩個(gè)相轉(zhuǎn)變點(diǎn)。第一個(gè)相變點(diǎn)為氣態(tài) 到液態(tài)擴(kuò)張膜，第二個(gè)相變點(diǎn)為液態(tài)擴(kuò)張膜到液態(tài)凝聚膜。相變點(diǎn)的最小抬起面積MLA值 為為6. 2nm2,較實(shí)施例1而言要小，說(shuō)明隨濃度降低，分子結(jié)構(gòu)逐漸由心形結(jié)構(gòu)逐漸呈鋪展 結(jié)構(gòu)。
[0027] 實(shí)施例3 :
[0028] 配置濃度為1. Oppm，體積為0. 8mL的牛血清白蛋白溶液，將其滴加進(jìn)盛有190mL去 離子水的亞相中，測(cè)量表面壓與時(shí)間的n-t動(dòng)力學(xué)曲線，由圖2可以看到，該實(shí)施例與實(shí)施 例1，2規(guī)律不同，該濃度下BSA π-t動(dòng)力學(xué)曲線表現(xiàn)為水平，甚至有下降趨勢(shì)，這一現(xiàn)象說(shuō) 明，該實(shí)施例中的BSA分子構(gòu)與實(shí)施里1，2不同。通過(guò)對(duì)π-t的一級(jí)動(dòng)力學(xué)擬合，結(jié)合熱 力學(xué)公式-Λ G = RTlnKd計(jì)算出Langmuir膜的表面吉布斯剩余自由能AG〈10KJ/mol，說(shuō) 明BSA分子構(gòu)象的變化不涉及化學(xué)鍵的形成。通過(guò)壓縮Langmuir膜，記錄表面壓力對(duì)單分 子膜面積的η-A吸附等溫曲線，由圖3看到有兩個(gè)相轉(zhuǎn)變點(diǎn)。第一個(gè)相變點(diǎn)為氣態(tài)到液態(tài) 擴(kuò)張膜，第二個(gè)相變點(diǎn)為液態(tài)擴(kuò)張膜到液態(tài)凝聚膜。相變點(diǎn)的最小抬起面MLA值為5. 8nm2, 均小于8. 0ppm*0. lmL和2. 0ppm*0. 4mLBSA的MLA。同樣證實(shí)了隨濃度降低BSA分子構(gòu)象 會(huì)逐漸鋪展。圖9AFM顯示該濃度下BSA分子形貌較圖8濃度為8. Oppm的BSA而言更為平 坦，說(shuō)明，隨濃度降低BSA分子構(gòu)象由心形逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)殇佌沟木€狀。圖9顯示，催化析氫峰 電位為-1. 79V。較實(shí)施例1BSA的催化析氫峰電位值而言要偏負(fù)，說(shuō)明低濃度下的BSA分子 結(jié)構(gòu)更不利于催化析氫反應(yīng)的進(jìn)行。
[0029] 實(shí)施例4 :
[0030] 配置濃度為2. Oppm，體積為0. lmL的牛血清白蛋白溶液，將其滴加進(jìn)盛有190mL磷 酸鹽緩沖溶液（圖4為PH = 4. 2,圖5為PH = 7. 2)的亞相中，測(cè)量表面壓與時(shí)間的π -t 動(dòng)力學(xué)曲線，圖4顯示在該磷酸鹽緩沖PH = 4· 2下BSA π -t動(dòng)力學(xué)曲線表現(xiàn)規(guī)律為上升抬 起最終呈動(dòng)態(tài)穩(wěn)定。圖5顯示在該磷酸鹽緩沖PH = 7. 2下BSA π -t動(dòng)力學(xué)曲線表現(xiàn)規(guī)律 為上升抬起最終呈動(dòng)態(tài)穩(wěn)定。由于BSA等電點(diǎn)兩側(cè)顯示相反電性，我們將顯示不同電性BSA 測(cè)試π-t動(dòng)力學(xué)曲線，依然得到了與亞相為水相的高濃度BSA(8.0ppm*1.0mL)的π-t動(dòng) 力學(xué)曲線的相同規(guī)律。說(shuō)明BSA分子構(gòu)象變化不是正負(fù)電的靜電吸引造成。而是由于水的 作用產(chǎn)生的較弱的分子間氫鍵所造成。
[0031] 實(shí)施例5:
[0032] 配置濃度為0. 2ppm，體積為1. OmL的牛血清白蛋白溶液，將其滴加進(jìn)盛有190mL磷 酸鹽緩沖溶液（圖4為PH = 4. 2,圖5為PH = 7. 2)的亞相中，測(cè)量表面壓與時(shí)間的π -t 動(dòng)力學(xué)曲線，圖4顯示在該磷酸鹽緩沖PH = 4· 2下BSA π -t動(dòng)力學(xué)曲線表現(xiàn)規(guī)律為幾乎 沒(méi)有上升抬起趨勢(shì)，而是幾乎一直處于水平狀態(tài)。圖5顯示在該磷酸鹽緩沖PH = 7. 2下 BSA π -t動(dòng)力學(xué)曲線表現(xiàn)規(guī)律為幾乎沒(méi)有上升抬起趨勢(shì)，而是幾乎一直處于水平狀態(tài)。由于 BSA等電點(diǎn)兩側(cè)顯示相反電性，我們將顯示不同電性BSA測(cè)試π-t動(dòng)力學(xué)曲線，依然得到了 與亞相為水相的低濃度BSA(1.0ppm*0.8mL)的π-t動(dòng)力學(xué)曲線的相同規(guī)律。說(shuō)明BSA分 子構(gòu)象變化不是正負(fù)電的靜電吸引造成。而是由于水的作用產(chǎn)生的較弱的分子間氫鍵所造 成。
【權(quán)利要求】
1. 一種鑒別濃度對(duì)蛋白質(zhì)分子二級(jí)結(jié)構(gòu)影響的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步 驟： (1) 借助Langmuir-Blodgett成膜技術(shù)，將待測(cè)蛋白質(zhì)分子溶液滴加于亞相的表面，觀 察其能否形成Langmuir單分子膜； (2) 若能夠生成Langmuir單分子膜，自滴加時(shí)刻起，采集表面壓力π隨時(shí)間的變化曲 線，即實(shí)時(shí)π -t動(dòng)力學(xué)曲線； 若π-t動(dòng)力學(xué)曲線中的π表現(xiàn)為一上升的，并且最終呈一穩(wěn)定數(shù)值的曲線，則該蛋白 質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)保持良好； 若π-t動(dòng)力學(xué)曲線中的π表現(xiàn)為一下降趨勢(shì)，則表明蛋白質(zhì)被溶劑化嚴(yán)重，二級(jí)結(jié)構(gòu) 被破壞。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒別濃度對(duì)蛋白質(zhì)分子二級(jí)結(jié)構(gòu)影響的檢測(cè)方法，其特 征在于，所述蛋白質(zhì)為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、酪蛋白、乳白蛋白、乳球蛋白中的任意 一種。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104062438SQ201410320581
【公開(kāi)日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2014年7月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月7日
【發(fā)明者】苗世頂, 何淑蓮, 黃梅, 葉偉, 丁麗平, 陳德超 申請(qǐng)人:合肥工業(yè)大學(xué)