專利名稱：小分子魚皮膠原蛋白肽的提取制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用淡水魚皮提取小分子膠原蛋白肽的制備領(lǐng)域，特別涉及一種利用控制酶解法、膜分離法、活性炭結(jié)合樹脂脫色法制備無色無味小分子魚皮膠原蛋白肽的提取制備方法。
背景技術(shù)：
一般，小分子膠原蛋白肽可以作為有效成分被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、高檔化妝品、保健食品等與人體健康相關(guān)的行業(yè)。目前，國內(nèi)外用于制備小分子膠原蛋白肽的原料主要來源于豬皮和牛皮。然而，由于對瘋牛病、豬口蹄疫的恐慌以及宗教信仰等原因，以水產(chǎn)加工廢棄物尤其利用魚皮制備小分子膠原蛋白肽不斷受到關(guān)注。據(jù)報道，小分子膠原蛋白肽易于消化吸收，具有保護(hù)胃粘膜防止胃潰瘍，促進(jìn)鈣吸收防治骨質(zhì)疏松，促進(jìn)皮膚膠原代謝，抑制血壓上升，以及降低血清中膽固醇含量等多方面的生理功能，導(dǎo)致市場對膠原蛋白的需求量不斷增加。目前，利用以魚皮為原料制備小分子膠原蛋白肽在國內(nèi)外已經(jīng)有了大量的研究和報道。在膠原蛋白肽的提取方法中，利用蛋白酶對膠原蛋白進(jìn)行酶解不僅效率高、而且產(chǎn)品的分子量分布容易控制，因此酶解提取法被廣泛應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。然而，由于蛋白酶價格昂貴，如果沒有對提取工藝進(jìn)行合理設(shè)計，不僅需要添加大量的蛋白酶，而且酶解時間長，造成生產(chǎn)成本偏高，產(chǎn)品分子量分布廣。另一方面，利用魚皮制備的小分子膠原蛋白肽都存在顏色深、帶有魚腥味，導(dǎo)致應(yīng)用范圍受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種生產(chǎn)周期較短、生產(chǎn)成本較低的無色無味小分子魚皮膠原蛋白肽的提取制備方法。利用控制酶解法提取無色無腥味的小分子魚皮膠原蛋白肽的制備方法，它是以淡水魚的魚皮為原料，將其制備成小分子膠原蛋白肽的方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是
本發(fā)明是一種小分子魚皮膠原蛋白肽的提取制備方法，它包括以下步驟(I)粗膠原蛋白的制備以淡水魚的魚皮為原料，用2-5倍原料重的含有20% (v/v)無水乙醇的堿性溶液浸泡12-24h去除雜蛋白和脂肪后用清水漂洗至中性，利用5-10倍原料重的酸性溶液攪拌浸泡l_3h，再用清水漂洗至pH為3-5后，磨碎制備成粗膠原蛋白；(2)膠原蛋白的加熱水解對磨碎的粗膠原蛋白加熱水解；(3)膠原蛋白的內(nèi)切酶酶解加熱水解的膠原蛋白溶液降溫至45-60° C，將溶液的pH調(diào)整至8. 0-9. 0，加入0. 02-0. 1% (w/w)原料重量的內(nèi)切酶對膠原蛋白進(jìn)行酶解；(4)膠原蛋白的外切酶酶解將內(nèi)切酶酶解的膠原蛋白溶液的pH調(diào)整至5. 0-6. 0，加入0. 1-0. 5% (w/w)原料重量的內(nèi)切酶進(jìn)行酶解制備成膠原蛋白肽溶液；(5)蛋白酶的回收和利用膠原蛋白肽溶液經(jīng)過超濾膜，將蛋白酶和未完全酶解的高分子膠原蛋白截留并添加到步驟(4)中繼續(xù)使用；(6)滅酶、脫鹽、濃縮利用90-100° C對超濾獲得的濾液加熱5-15min進(jìn)行滅酶，然后利用納濾膜進(jìn)行脫鹽、濃縮；(7)脫色、脫腥在步驟(6)處理獲得的小分子膠原蛋白肽濃縮液中加入溶液重量的0. 5-2. 0%(w/w)的活性炭進(jìn)行脫色脫腥，接著利用碟式離心機(jī)去除活性炭，再利用樹脂脫色脫腥；(8)小分子膠原蛋白肽粉末的制備將步驟(7)脫腥脫色的膠原蛋白肽溶液通過噴霧干燥，制備成小分子膠原蛋白肽粉末。在步驟(I)中，所述的堿性溶液浸泡條件為堿性溶液為0. 01-0. 05 M NaOH溶液；浸泡溫度為4-20° C。在步驟(I)中，所述的酸性溶液浸泡條件為酸性溶液為0. 05-0. 20 M HCl溶液；浸泡溫度為4-20° C。在步驟(2)中，所述的膠原蛋白加熱水解的條件為在90-100 ° C下加熱30-60min。在步驟(3)中，所述的內(nèi)切酶為膠原蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶中的一種或組合。在步驟(3)中，所述的膠原蛋白內(nèi)切酶酶解條件為在45-55 ° C下酶解1-4 h。在步驟⑷中，所述的外切酶為木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶中的一種或組合。在步驟(4)中，所述的膠原蛋白外切酶酶解條件為在45-55 ° C下酶解1_4 h。在步驟(5)中，所述的超濾膜的規(guī)格為截留分子量為2000-5000道爾頓。在步驟(6)中，所述的納濾膜的規(guī)格為截留分子量為200道爾頓。在步驟(7)中，所述的活性炭脫色脫腥條件為膠原蛋白肽溶液的pH調(diào)整至
4.5-6. 0，在 30-40。C 下保溫 15-60min。在步驟(J)中，所用的脫色脫腥樹脂可以為離子交換樹脂、吸附樹脂或鰲合樹脂中的任一種。在步驟(7)中，所述的樹脂脫色脫腥條件為脫色脫腥溫度為常溫，膠原蛋白肽溶 液的PH保持在4. 5-6. 0，膠原蛋白肽溶液在樹脂中停留的時間為15-60min。所述的淡水魚為鰱魚、草魚、青魚、鳙魚或羅非魚中的一種。本發(fā)明針對酶解法制備小分子膠原蛋白肽時酶的用量大成本高，產(chǎn)品顏色深等問題，因此本發(fā)明根據(jù)膠原蛋白特性，先采用酸加熱法破壞魚皮膠原蛋白結(jié)構(gòu)，再利用內(nèi)切酶和外切酶對淡水魚的魚皮進(jìn)行酶解，這樣不僅可以提高酶解速度，降低蛋白酶的用量，并且可以有效控制產(chǎn)品的分子量，然后利用超濾膜和鈉濾膜可以獲得分子量分布范圍集中的小分子膠原蛋白肽，而且對于蛋白酶和酶解不完全的高分子膠原蛋白還可以實現(xiàn)回收利用，用納濾膜脫鹽，最后利用活性炭和樹脂對膠原蛋白肽進(jìn)行脫腥脫色。本發(fā)明處理條件溫和，可以控制膠原蛋白肽產(chǎn)品的分子量分布，減少蛋白酶的用量，縮短酶解時間，降低生產(chǎn)成本，而且對產(chǎn)品實行有效的脫腥脫色，提高產(chǎn)品的質(zhì)量，擴(kuò)大產(chǎn)品的應(yīng)用范圍。故，本發(fā)明具有以下優(yōu)點
I、本發(fā)明利用低值的淡水魚魚皮為主要原料，可以降低成本。2、本發(fā)明采用酸水解法破壞膠原蛋白結(jié)構(gòu)，不僅可以減少蛋白酶用量，而且可以縮短酶解時間，從而縮短生產(chǎn)周期。3、本發(fā)明采用超濾膜對蛋白酶進(jìn)行回收利用，可以降低蛋白酶的使用成本。
4、本發(fā)明制備的膠原蛋白肽的分子量為200-5000道爾頓,而且分子量分布范圍可以通過超濾膜進(jìn)行調(diào)整控制，便于操作。5、本發(fā)明制備的小分子膠原蛋白肽為白色，無腥臭味。下面結(jié)合附表和具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。



圖I為第一個實施例小分子膠原蛋白肽分子量分布的質(zhì)譜 圖2為第二個實施例小分子膠原蛋白肽分子量分布的質(zhì)譜圖。
具體實施例方式實施例I
在10 kg羅非魚魚皮中加入50L的含有20% (v/v)無水乙醇的0. OlM NaOH溶液，在20° C下浸泡12h，利用自來水漂洗干凈后，加入50L的0. 05M HCl溶液在20° C下浸泡Ih，用自來水漂洗至pH為3后，利用分離式高濃磨漿機(jī)將處理后的魚皮磨碎，在90° C下加熱60min,然后利用氫氧化鈉將其pH調(diào)整至8. 0,然后加入2 g的膠原蛋白酶,在55° C下酶解4h，利用鹽酸將酶解液的pH調(diào)整到5.0，加入20 g的木瓜蛋白酶，在55° C下酶解Ih后，利用截留分子量為5000道爾頓的超濾膜進(jìn)行分離，未能通過超濾膜的溶液回收到木瓜蛋白酶酶解步驟繼續(xù)使用，通過超濾膜的濾液利用100° C加熱5min滅酶，然后利用截留分子量為200道爾頓的鈉濾膜進(jìn)行脫鹽濃縮，可以獲得Brix為25%的膠原蛋白肽溶液7L，然后將pH調(diào)整至4. 5，加入35g活性炭，在40° C下脫色脫腥酶解15min后，利用碟式離心機(jī)去除活性炭，然后利用大孔吸附樹脂在常溫下對其脫色脫腥15min，最后利用噴霧干燥機(jī)進(jìn)行噴霧干燥，可以獲得I. 5kg左右水分含量為7% (w/w)的小分子魚皮膠原蛋白肽粉。實施例2
在10 kg鰱魚魚皮中加入40L的含有20% (v/v)無水乙醇的0. 05M NaOH溶液，在4° C下浸泡24h，利用自來水漂洗干凈后，加入70L的0. 20M HCl溶液在4° C下浸泡3h，用自來水漂洗至pH為5后，利用分離式高濃磨漿機(jī)將處理后的魚皮磨碎，在100° C下加熱30min，然后利用氫氧化鈉將其pH調(diào)整至9. 0，然后加入5 g的膠原蛋白酶和5 g的堿性蛋白酶,在45° C下酶解lh，利用鹽酸將酶解液的pH調(diào)整到6.0，加入50 g的菠蘿蛋白酶，在50° C下酶解4h后，利用截留分子量為2000道爾頓的超濾膜進(jìn)行分離，未能通過超濾膜的溶液回收到菠蘿蛋白酶酶解步驟繼續(xù)使用，通過超濾膜的濾液利用90° C加熱15min滅酶，然后利用截留分子量為200道爾頓的鈉濾膜進(jìn)行脫鹽濃縮，可以獲得Brix為30%的膠原蛋白肽溶液5L，然后將pH調(diào)整至6. 0，加入IOOg活性炭，在40° C下脫色脫腥酶解30min后，利用碟式離心機(jī)去除活性炭，然后利用陰離子交換樹脂在常溫下對其脫色脫腥30min，最后利用噴霧干燥機(jī)進(jìn)行噴霧干燥，可以獲得I. 3kg左右水分含量為7% (w/w)的小分子魚皮膠原蛋白肽粉。利用質(zhì)譜儀對本發(fā)明生產(chǎn)的膠原蛋白肽的分子量分布進(jìn)行測，結(jié)果如圖I、圖2所示。由于沒有檢測到大于2000道爾頓的分子離子峰，小于600道爾頓排除所用基質(zhì)a-氰基-4-羥基肉桂酸的干擾后得到的分子離子峰也不多，因此數(shù)據(jù)沒有顯示。由圖I、圖2可知通過酶解獲得的深海魚類膠原蛋白的分子量主要分布在500-2000道爾頓，尤其是集中在600-1500道爾頓之間，可以容易被人體所吸收。通過對比脫色前和脫色后的樣品(表
I)，表明經(jīng)過脫色后，小分子魚皮膠原蛋白肽的顏色明顯得到改善，基本接近白板。而且經(jīng)過感官評價，本發(fā)明制備的小分子膠原蛋白肽沒有濃烈的腥臭味，因此可以廣泛應(yīng)用于保健食品、生物醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)。綜上所述，本發(fā)明在酸性條件下對已經(jīng)去除雜蛋白脫脂的膠原蛋白進(jìn)行短時間加熱水解，然后通過酶解獲得小分子膠原蛋白肽溶液，采用超濾膜回收蛋白酶和酶解程度不夠的膠原蛋白進(jìn)行再利用，用納濾膜脫鹽，活性炭結(jié)合樹脂脫色脫腥后，通過噴霧干燥獲得無色無味的小分子魚皮膠原蛋白肽粉。本發(fā)明的生產(chǎn)制備過程可以將酶解罐和膜分離設(shè)備進(jìn)行連接，減少二次污染，而且通過膜分離對蛋白酶進(jìn)行回收再利用，可以節(jié)約成本；制備的小分子膠原蛋白肽為無色無味，應(yīng)用范圍將更廣泛。需要說明的是本發(fā)明所用的淡水魚可以是鰱魚、草魚、青魚、鳙魚或羅非魚中的一種。上述僅為本發(fā)明的具體實施例，但本發(fā)明的設(shè)計構(gòu)思并不局限于此，凡利用此構(gòu)思對本發(fā)明進(jìn)行非實質(zhì)性的改動，均應(yīng)屬于侵犯本發(fā)明保護(hù)范圍的行為。表I脫色前后小分子膠原蛋白肽樣品的色澤比較
權(quán)利要求
1.一種小分子魚皮膠原蛋白肽的提取制備方法，其特征在于它包括以下步驟(1)粗膠原蛋白的制備以淡水魚的魚皮為原料，用2-5倍原料重的含有20% (v/v)無水乙醇的堿性溶液浸泡12-24h去除雜蛋白和脂肪后用清水漂洗至中性，利用5-10倍原料重的酸性溶液攪拌浸泡l_3h，再用清水漂洗至pH為3-5后，磨碎制備成粗膠原蛋白；(2)膠原蛋白的加熱水解對磨碎的粗膠原蛋白加熱水解；(3)膠原蛋白的內(nèi)切酶酶解加熱水解的膠原蛋白溶液降溫至45-60° C，將溶液的pH調(diào)整至8. 0-9. 0，加入0. 02-0. 1% (w/w)原料重量的內(nèi)切酶對膠原蛋白進(jìn)行酶解；(4)膠原蛋白的外切酶酶解將內(nèi)切酶酶解的膠原蛋白溶液的PH調(diào)整至5. 0-6. 0，加入0. 1-0. 5% (w/w)原料重量的內(nèi)切酶進(jìn)行酶解制備成膠原蛋白肽溶液；(5)蛋白酶的回收和利用膠原蛋白肽溶液經(jīng)過超濾膜，將蛋白酶和未完全酶解的高分子膠原蛋白截留并添加到步驟(4)中繼續(xù)使用；(6)滅酶、脫鹽、濃縮利用90-100° C對超濾獲得的濾液加熱5-15min進(jìn)行滅酶，然后利用納濾膜進(jìn)行脫鹽、濃縮；(7)脫色、脫腥在步驟(6)處理獲得的小分子膠原蛋白肽濃縮液中加入溶液重量的0.5-2. 0%(w/w)的活性炭進(jìn)行脫色脫腥，接著利用碟式離心機(jī)去除活性炭，再利用樹脂脫色脫腥；(8)小分子膠原蛋白肽粉末的制備將步驟(7)脫腥脫色的膠原蛋白肽溶液通過噴霧干燥，制備成小分子膠原蛋白肽粉末。
2.如權(quán)利要求I所述的小分子魚皮膠原蛋白肽的提取制備方法，其特征在于:在步驟(I)中，所述的堿性溶液浸泡條件為堿性溶液為0. 01-0. 05 M NaOH溶液;浸泡溫度為4-20° C。
3.如權(quán)利要求I所述的小分子魚皮膠原蛋白肽的提取制備方法，其特征在于在步驟(I)中，所述的酸性溶液浸泡條件為酸性溶液為0. 05-0. 20 M HCl溶液；浸泡溫度為4-20。Co
4.如權(quán)利要求I所述的小分子魚皮膠原蛋白肽的提取制備方法，其特征在于在步驟(2)中，所述的膠原蛋白加熱水解的條件為在90-100 ° C下加熱30-60 min。
5.如權(quán)利要求I所述的一種小分子魚皮膠原蛋白肽的提取制備方法，其特征在于在步驟(3)中，所述的內(nèi)切酶為膠原蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶中的一種或組合；所述的膠原蛋白內(nèi)切酶酶解條件為在45-55 ° C下酶解1-4 h。
6.如權(quán)利要求I所述的小分子魚皮膠原蛋白肽的提取制備方法，其特征在于在步驟(4)中，所述的外切酶為木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶中的一種或組合；所述的膠原蛋白外切酶酶解條件為在45-55 ° C下酶解1-4 h。
7.如權(quán)利要求I所述的小分子魚皮膠原蛋白肽的提取制備方法，其特征在于在步驟(5)中，所述的超濾膜的規(guī)格為截留分子量為2000-5000道爾頓。
8.如權(quán)利要求I所述的小分子魚皮膠原蛋白肽的提取制備方法，其特征在于在步驟(6)中，所述的納濾膜的規(guī)格為截留分子量為200道爾頓。
9.如權(quán)利要求I所述的小分子魚皮膠原蛋白肽的提取制備方法，其特征在于在步驟(7)中，所述的活性炭脫色脫腥條件為膠原蛋白肽溶液的pH調(diào)整至4.5-6. 0，在30-40° C下保溫15-60min ;所用的脫色脫腥樹脂可以為離子交換樹脂、吸附樹脂或鰲合樹脂中的任一種；所述的樹脂脫色脫腥條件為脫色脫腥溫度為常溫，膠原蛋白肽溶液的PH保持在4.5-6. 0，膠原蛋白肽溶液在樹脂中停留的時間為15-60min。
10.如權(quán)利要求I所述的小分子魚皮膠原蛋白肽的提取制備方法，其特征在于所述的淡水魚為鰱魚、草魚、青魚、鳙魚或羅非魚中的一種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種小分子魚皮膠原蛋白肽的提取制備方法，工藝步驟包括以淡水魚的魚皮為原料，除去非膠原蛋白，經(jīng)過脫脂、脫腥、磨碎等步驟，在酸性條件下對膠原蛋白加熱水解處理，然后采用酶解法控制膠原蛋白的降解程度，采用膜分離法獲得目標(biāo)小分子膠原蛋白肽并對蛋白酶回收再利用，接著通過納濾脫鹽，活性炭結(jié)合樹脂脫色脫腥后，利用噴霧干燥獲得無色無味的小分子魚皮膠原蛋白肽粉。本發(fā)明工藝簡單，而且通過膜分離對蛋白酶進(jìn)行回收再利用，可以節(jié)約成本；制備的小分子膠原蛋白肽為無色無味，可廣泛應(yīng)用于保健食品、生物醫(yī)藥、化妝品等與人體健康相關(guān)的行業(yè)。
文檔編號C07K2/00GK102703555SQ201210187819
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月8日
發(fā)明者劉光明, 曹敏杰, 王寶周, 翁武銀, 蘇文金 申請人:集美大學(xué)