專利名稱：一種檢測(cè)低豐度低分子量蛋白譜的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于化學(xué)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種用于直接檢測(cè)復(fù)雜樣品中低豐度低分子量蛋白譜的試劑盒。
背景技術(shù)：
近年來，隨著群體蛋白質(zhì)組學(xué)概念的提出和其在實(shí)際研究中的應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用之間的距離將進(jìn)一步縮短。由于人體體液中因疾病引起的蛋白質(zhì)的含量及種類變化是臨床上各種病癥早期診斷及評(píng)價(jià)病情的重要指標(biāo)，因此應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)，尋找與疾病相關(guān)的特異性蛋白變化是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。然而，迄今為止能用于常規(guī)臨床檢測(cè)的生物標(biāo)志物還非常的少。理論上，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的分子量較大，較難進(jìn)入體液循環(huán)中，而一些蛋白質(zhì)降解后的片段，卻有可能通過某種途徑進(jìn)入到體液或血液中。以血清 為例，近年來，血清蛋白質(zhì)組中的低分子量范圍頗受關(guān)注。而質(zhì)譜技術(shù)的迅速發(fā)展和廣泛使用，又為血清蛋白質(zhì)組中的低豐度低分子量范圍的研究提供了有效的手段。現(xiàn)有的針對(duì)低分子量蛋白檢測(cè)的方法一般是使用電泳等分離技術(shù)對(duì)蛋白分子量進(jìn)行篩分后用富集材料將目標(biāo)分析物進(jìn)行富集，再輔以后續(xù)的洗脫步驟，從而進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。這種方法步驟繁瑣，多步的分離和洗脫操作可能將微量的低分子蛋白丟失，并且需要相當(dāng)龐大的檢測(cè)設(shè)備。目前，低豐度低分子量蛋白質(zhì)的分析的難點(diǎn)主要在于1)在分離過程中容易丟失和被其它高分子量的蛋白酶降解；2)在質(zhì)譜鑒定過程中容易被其他高分子量蛋白質(zhì)的信息掩蓋；3)更容易受到鹽、表面活性劑等小分子的干擾影響質(zhì)譜鑒定等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種便攜的試劑盒，用于檢測(cè)低豐度低分子量蛋白譜。為此，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是這樣的一種檢測(cè)低豐度低分子量蛋白譜的試劑盒，包括盒體，盒體內(nèi)設(shè)有分離裝置、蛋白分離富集材料、稀釋緩沖液、清洗緩沖液，蛋白分離富集材料放置在分離裝置中，其特征在于所述的蛋白分離富集材料為多孔硅顆粒，孔道直徑在l_50nm之間，其孔道表面具有化學(xué)修飾基團(tuán)，所述的化學(xué)修飾基團(tuán)為陰離子交換基團(tuán)或陽離子交換基團(tuán)或疏水基團(tuán)或極性基團(tuán)。所述的化學(xué)修飾基團(tuán)選自氨基、巰基或環(huán)氧基中的一種。進(jìn)一步地，所述的蛋白分離富集材料是通過如下步驟得到的
A)將P型摻硼硅片固定在電解池中，按體積比為I:4 6的比例加入乙醇和重量濃度為40%的氫氟酸作為電解液，以硅片為陽極，鉬電極為陰極，進(jìn)行直流電解刻蝕和脫膜，設(shè)定電流強(qiáng)度為0100mA，刻蝕時(shí)間為(Γ15分鐘，刻蝕脫膜后的多孔硅層用乙醇沖洗干凈后超聲粉碎5 20分鐘，再用氮?dú)獯蹈?，所得的多孔硅顆粒的孔徑在5 20nm ；
B)將上述多孔硅顆粒進(jìn)行臭氧氧化處理5 20分鐘，形成表面硅氧鍵；O將氧化后的多孔硅顆粒浸泡在體積濃度為1%的硅烷化試劑與有機(jī)溶劑的混合溶液中反應(yīng)I小時(shí)，再在烘箱中110°c干燥15分鐘，蒸干后的多孔硅顆粒用乙醇浸泡洗凈；
D)選擇所需孔徑的多孔硅，用氨基硅烷化試劑、巰基硅烷化試劑或環(huán)氧基硅烷化試劑進(jìn)行表面修飾。更進(jìn)一步地，所述的分離裝置為離心管或微柱或芯片-微流控裝置。本發(fā)明在使用時(shí)，通過分離裝置及蛋白分離富集材料來得到所需的低豐度低分子量蛋白，然后進(jìn)行MALDI-T0F檢測(cè)，獲得高質(zhì)量的肽譜。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
I、本發(fā)明通過制備多孔硅顆粒達(dá)到一步分離、富集和檢測(cè)血清樣品中低分子量蛋白的作用。多孔硅的孔徑大小可以通過電化學(xué)刻蝕條件精確控制，根據(jù)所要篩選的蛋白質(zhì)分子 量大小，對(duì)相應(yīng)材料的孔隙率進(jìn)行選擇。通過表面修飾技術(shù)可以選擇性的捕獲低分子量生物標(biāo)記物，同時(shí)將人血清中含量豐富的高分子量蛋白質(zhì)和蛋白酶排阻在孔道外，防止了低豐度蛋白的降解。多孔硅顆粒的制備條件選擇是該分離材料性能優(yōu)越的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)。2、本發(fā)明中材料的孔徑可以根據(jù)帶分析目標(biāo)物的大小進(jìn)行隨意調(diào)控，并利用多孔硅表面可進(jìn)行多種化學(xué)修飾，可選擇性地從待測(cè)生物樣品中捕獲某一種類的目標(biāo)蛋白質(zhì)。同時(shí)，可以通過在各檢測(cè)點(diǎn)內(nèi)修飾不同的基團(tuán)，進(jìn)行一種試樣的多維分析檢測(cè)。3、本發(fā)明中富集后的顆粒進(jìn)行表面清洗后無需進(jìn)行額外的洗脫除鹽步驟，即可進(jìn)行MALDI-T0F檢測(cè)，獲得高質(zhì)量的肽譜。檢測(cè)后多余的多孔硅顆?？芍苯舆M(jìn)行凝膠電泳分析，對(duì)感興趣的差異蛋白進(jìn)行進(jìn)一步的分離鑒定。避免了樣品多步處理和洗脫過程所造成的損失。4、本發(fā)明中設(shè)備簡單便攜，檢測(cè)方法準(zhǔn)確快捷。整個(gè)測(cè)定過程一般可以在幾分鐘內(nèi)就全部完成，十分迅速，簡單易行，且捕獲特異性高，同時(shí)不會(huì)破壞所測(cè)定的蛋白質(zhì)。


圖I是本發(fā)明中微柱分離裝置示意圖。圖2是本發(fā)明中離心管分離裝置示意圖。圖3為I. O mg · mL—1胰島素樣品經(jīng)過處理后的MALDI-TOF-MS檢測(cè)結(jié)果圖。圖4為采用本發(fā)明對(duì)患者血清樣品進(jìn)行直接檢測(cè)MALDI-T0F-MS結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一多孔硅的制備
取P型摻硼硅片(100)晶型，固定在電解池中，加入O. 5ml乙醇，2-3ml質(zhì)量濃度為40%的氫氟酸作為電解液，以硅片為陽極，鉬電極為陰極，進(jìn)行直流電解刻蝕和脫膜，設(shè)定電流強(qiáng)度為l(T80mA，刻蝕時(shí)間為5分鐘，刻蝕脫膜后的多孔硅層用乙醇沖洗干凈后超聲粉碎15分鐘，再用氮?dú)獯蹈桑玫亩嗫坠桀w粒的孔徑在5 20nm ；
將上述多孔硅顆粒進(jìn)行臭氧氧化處理20分鐘，形成表面硅氧鍵；
將氧化后的多孔硅顆粒浸泡在體積濃度為1%的氨基硅烷化試劑與乙醇溶劑的混合溶液中反應(yīng)I小時(shí)，再在烘箱中110°C干燥15分鐘，蒸干后的多孔硅顆粒用乙醇浸泡洗凈；選擇孔徑為10-12nm的多孔硅，用十一碳烯酸進(jìn)行表面修飾。
實(shí)施例二分離裝置一
參見圖1，為本發(fā)明一種分離裝置的實(shí)施例。圖中I為多孔硅顆粒，2為微柱，多孔硅顆粒放置在微柱中，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定蛋白的分離富集。實(shí)施例三分離裝置二
參見圖2，為本發(fā)明另一種分離裝置的實(shí)施例。圖中I為多孔硅顆粒，3為離心管，多孔硅顆粒放置在離心管中，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定蛋白的分離富集。實(shí)施例四對(duì)胰島素樣品的處理檢測(cè)
本實(shí)施例以26%孔隙率的經(jīng)過十一碳烯酸修飾的多孔硅顆粒作為富集材料，對(duì)低濃度的胰島素樣品進(jìn)行直接檢測(cè)，其具體步驟如下 I、樣品吸附
本實(shí)施例的胰島素樣品為醫(yī)用人體注射液，將胰島素注射液用生理緩沖液PBS稀釋成I. O mg · mL—1后作為待測(cè)溶液。吸附取四個(gè)離心管，分別標(biāo)號(hào)1，2，3，4，各加入50 uL待測(cè)溶液，再在離心管2中加入3 mg未刻蝕的硅粉，在離心管3中加入3 mg孔隙率為26%的多孔硅顆粒，在離心管4中加入3 mg經(jīng)過十一碳烯酸修飾的孔隙率為26%的多孔硅顆粒，四個(gè)離心管在室溫下共同振蕩孵育I h。分離將上述懸濁液靜置2 min,多孔硅顆粒沉降到離心管底部，用移液槍小心的移除上清液。2、樣品檢測(cè)
清洗在離心管中加入100 uL清洗緩沖液(O. 2 mmol · Γ1的PB緩沖液)，渦旋振蕩混勻后將懸濁液靜置2 min，用移液槍小心的移除上清液。再在離心管中加入100 uL去離子水，渦旋振蕩混勻后將懸濁液靜置2 min，用移液槍小心的移除上清液。檢測(cè)將清洗后的多孔硅顆粒用移液槍轉(zhuǎn)移到MALDI靶上，室溫自然干燥，然后將I uL的有機(jī)基質(zhì)溶液(2-氰基-4-羥基肉桂酸，a -CHCA)點(diǎn)覆在顆粒表面，室溫自然干燥；將制備好的樣品送入MALDI-T0F質(zhì)譜儀檢測(cè)。質(zhì)譜檢測(cè)條件激光波長337 nm，激光脈沖頻率200 Hz，加速電壓20 kV，檢測(cè)范圍(TlO kD，延遲時(shí)間為220 ns，線性正離子模式檢測(cè)?；厥諜z測(cè)完畢后將多孔硅顆粒小心的從MALDI靶上轉(zhuǎn)移到離心管中，加入蛋白洗脫液(含有體積比為25%的乙腈和75%的三氟乙酸)，振蕩孵育20 min,將顆粒上吸附的蛋白洗脫下來。將上述懸濁液靜置2 min，用移液槍移除上清液，溶液揮發(fā)后得到的多孔硅顆粒可重新使用。檢測(cè)結(jié)果參見圖3，圖中，橫坐標(biāo)表示質(zhì)譜峰的質(zhì)核比，縱坐標(biāo)表示質(zhì)譜峰的峰強(qiáng)度。16是樣品溶液用傳統(tǒng)方法直接點(diǎn)覆在MALDI靶板上檢測(cè)得到的，17是樣品經(jīng)過硅粉吸附后，將硅粉點(diǎn)覆在靶板上檢測(cè)得到的，18是樣品經(jīng)過多孔硅顆粒富集后，將多孔硅顆粒點(diǎn)覆在靶板上檢測(cè)得到的，19是樣品經(jīng)過實(shí)施例一的多孔硅顆粒富集后，將多孔硅顆粒點(diǎn)覆在靶板上檢測(cè)得到的。19得到的樣品信號(hào)峰明顯高于傳統(tǒng)方法16。實(shí)施例五對(duì)患者血清樣品的處理檢測(cè)
本實(shí)施例以26%孔隙率的經(jīng)過十一碳烯酸修飾的多孔硅顆粒作為富集材料，對(duì)患者的血清樣品進(jìn)行直接檢測(cè)和分析，其具體步驟如下
I、樣品吸附本實(shí)施例的血清樣品從醫(yī)院獲得，血清樣品的制備采用醫(yī)學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)操作，其中5-9為直腸癌患者血清，10-14為非癌癥患者血清，制備好的血清樣品儲(chǔ)存在-80で的超低溫冰箱。吸附將的血清樣品用生理緩沖液PBS稀釋10倍后取50 uL加入離心管中，再加入3 mg經(jīng)過十一碳烯酸修飾的孔隙率為26%的多孔硅顆粒，得到的懸濁液在室溫下振蕩孵育I h。
分離將上述懸濁液靜置2 min，多孔硅顆粒沉降到離心管底部，用移液槍小心的移除上清液。2、樣品檢測(cè)
清洗在離心管中加入100 uL清洗緩沖液(0. 2 mmol じ1的PB緩沖液)，渦旋振蕩混勻后將懸濁液靜置2 min，用移液槍小心的移除上清液。再在離心管中加入100 uL去離子水，渦旋振蕩混勻后將懸濁液靜置2 min，用移液槍小心的移除上清液。檢測(cè)將清洗后的多孔硅顆粒用移液槍轉(zhuǎn)移到MALDI靶上，室溫自然干燥，然后將I uL的有機(jī)基質(zhì)溶液(2-氰基-4-羥基肉桂酸，a -CHCA)點(diǎn)覆在顆粒表面，室溫自然干燥；將制備好的樣品送入MALDI-T0F質(zhì)譜儀檢測(cè)。質(zhì)譜檢測(cè)條件激光波長337 nm，激光脈沖頻率200 Hz，加速電壓20 kV，檢測(cè)范圍(TlO kD，延遲時(shí)間為220 ns，線性正離子模式檢測(cè)。回收檢測(cè)完畢后將多孔硅顆粒小心的從MALDI靶上轉(zhuǎn)移到離心管中，加入蛋白洗脫液(含有體積比為25%的こ腈和75%的三氟こ酸)，振蕩孵育20 min,將顆粒上吸附的蛋白洗脫下來。將上述懸濁液靜置2 min，用移液槍移除上清液，溶液揮發(fā)后得到的多孔硅顆粒可重新使用。檢測(cè)結(jié)果參見圖4。圖中，橫坐標(biāo)表示質(zhì)譜峰的質(zhì)核比，縱坐標(biāo)表示質(zhì)譜峰的峰強(qiáng)度。5-9為直腸癌患者血清樣品，10-14為非癌癥患者血清樣品，15為未處理的血清樣品。對(duì)峰位置進(jìn)行容差為0. 15%的對(duì)齊處理，并將峰強(qiáng)度進(jìn)行歸一化處理，把相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度低于0. 5的峰記為0，相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度高于0. 5的峰記為1，將篩選挑選出來的峰用SPSS軟件進(jìn)行分層聚類分析，分析結(jié)果說明本方法可以對(duì)血清樣品中的低豐度蛋白進(jìn)行直接檢測(cè)，并可以初步將正常人和癌癥患者區(qū)分開，只有8號(hào)一例被歸入正常人中。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)低豐度低分子量蛋白譜的試劑盒，包括盒體，盒體內(nèi)設(shè)有分離裝置、蛋白分離富集材料、稀釋緩沖液、清洗緩沖液，蛋白分離富集材料放置在分離裝置中，其特征在于所述的蛋白分離富集材料為多孔硅顆粒，孔道直徑在l-50nm之間，其孔道表面具有化學(xué)修飾基團(tuán)，所述的化學(xué)修飾基團(tuán)為陰離子交換基團(tuán)或陽離子交換基團(tuán)或疏水基團(tuán)或極性基團(tuán)。
2.如權(quán)利要求I所述的一種檢測(cè)低豐度低分子量蛋白譜的試劑盒，其特征在于所述化學(xué)修飾基團(tuán)選自氨基、巰基或環(huán)氧基中的一種。
3.如權(quán)利要求I所述的一種檢測(cè)低豐度低分子量蛋白譜的試劑盒，其特征在于所述的蛋白分離富集材料是通過如下步驟得到的 A)將P型摻硼硅片固定在電解池中，按體積比為I:4 6的比例加入乙醇和重量濃度為40%的氫氟酸作為電解液，以硅片為陽極，鉬電極為陰極，進(jìn)行直流電解刻蝕和脫膜，設(shè)定電流強(qiáng)度為0100mA，刻蝕時(shí)間為(Γ15分鐘，刻蝕脫膜后的多孔硅層用乙醇沖洗干凈后超聲粉碎5 20分鐘，再用氮?dú)獯蹈桑玫亩嗫坠桀w粒的孔徑在5 20nm ； B)將上述多孔硅顆粒進(jìn)行臭氧氧化處理5 20分鐘，形成表面硅氧鍵； C)將氧化后的多孔硅顆粒浸泡在體積濃度為1%的硅烷化試劑與有機(jī)溶劑的混合溶液中反應(yīng)I小時(shí)，再在烘箱中110°C干燥15分鐘，蒸干后的多孔硅顆粒用乙醇浸泡洗凈； D)選擇所需孔徑的多孔硅，用氨基硅烷化試劑、巰基硅烷化試劑或環(huán)氧基硅烷化試劑進(jìn)行表面修飾。
4.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的一種檢測(cè)低豐度低分子量蛋白譜的試劑盒，其特征在于所述的分離裝置為離心管或微柱或芯片-微流控裝置。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)低豐度低分子量蛋白譜的試劑盒，包括盒體，盒體內(nèi)設(shè)有分離裝置、蛋白分離富集材料、稀釋緩沖液、清洗緩沖液，蛋白分離富集材料放置在分離裝置中，所述的蛋白分離富集材料為多孔硅顆粒，孔道直徑在1-50nm之間，其孔道表面具有化學(xué)修飾基團(tuán)，所述的化學(xué)修飾基團(tuán)為陰離子交換基團(tuán)或陽離子交換基團(tuán)或疏水基團(tuán)或極性基團(tuán)。本發(fā)明中通過制備多孔硅顆粒達(dá)到一步分離、富集和檢測(cè)血清樣品中低分子量蛋白的作用。本發(fā)明設(shè)備簡單便攜，檢測(cè)方法準(zhǔn)確快捷。
文檔編號(hào)G01N1/40GK102788833SQ20121025292
公開日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2012年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月20日
發(fā)明者談潔, 趙偉潔, 鄔建敏 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)