專利名稱:一種抑制骨橋蛋白表達(dá)的小分子rna藥物及其表達(dá)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域中一種抑制骨橋蛋白(OPN)表達(dá)的方法。
背景技術(shù):
OPN是一分子量為44KD的分泌型糖基化磷蛋白,主要通過(guò)與其受體整合素和CD44相互作用,參與多器官多組織的生理病理過(guò)程,具有多種功能。研究表明OPN的表達(dá)和動(dòng)脈粥樣硬化、骨質(zhì)疏松癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病及多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
惡性腫瘤已成為引起人類死亡的主要原因,其死亡率僅次于心血管疾病,而腫瘤的轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤死亡率高、預(yù)后差的主要原因。很多研究表明細(xì)胞中OPN的高表達(dá)與惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān),OPN在腫瘤細(xì)胞的黏附、移行、浸潤(rùn)、血管新生以及腫瘤的微環(huán)境中起著關(guān)鍵作用。臨床上OPN高表達(dá)的腫瘤患者一般復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率高,預(yù)后較差。因此抑制腫瘤細(xì)胞中OPN的表達(dá),有可能降低腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能,從而提高腫瘤患者的生存率。
RNAi(RNA interference,RNA干擾)是近幾年發(fā)展起來(lái)的一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術(shù),與反義技術(shù)相比其抑制基因表達(dá)更有效、特異且持久。RNAi現(xiàn)象由Fire等在線蟲(chóng)中首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道,隨后在果蠅、植物和動(dòng)物細(xì)胞中都證實(shí)了這種現(xiàn)象的存在。隨后Tuchl等發(fā)現(xiàn)體外合成的21bp的siRNA可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中特異有效的抑制基因表達(dá),不久Brummelkamp等將含有19-29bp的shDNA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,成功轉(zhuǎn)錄出shRNA并能特異抑制目標(biāo)基因的表達(dá),之后RNAi技術(shù)在抗腫瘤、抗病毒和基因功能研究的領(lǐng)域中都得到了廣泛的應(yīng)用。
目前在實(shí)驗(yàn)室一般使用合成的dsRNA或shRNA表達(dá)載體來(lái)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的沉默,合成RNA成本高,容易降解,不能長(zhǎng)期有效的抑制目標(biāo)基因的表達(dá);而一些早期開(kāi)發(fā)的RNAi載體如pSilencer和pSUPER等都缺少指示標(biāo)記和抗性篩選基因,給其使用帶來(lái)很多不便。因此我們構(gòu)建的RNAi載體可以有效的解決這些問(wèn)題,另外雖也有文獻(xiàn)報(bào)道使用RNAi技術(shù)在小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞中抑制OPN表達(dá),但我們?cè)O(shè)計(jì)的是針對(duì)人的OPN基因的不同抑制位點(diǎn),并且抑制效果很好。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種抑制骨橋蛋白(OPN)表達(dá)的方法。
本發(fā)明提供的抑制骨橋蛋白(OPN)表達(dá)的方法是使用RNAi技術(shù)。
本發(fā)明提供了兩條shRNA序列shRNA1CGACTCTGATGATGTAGATGACACTTTCAAGAGAAGTGTCATCTACATCATCAGAGTCGShRNA2GCGAGGAGTTGAATGGTGCATACAATTCAAGAGATTGTATGCACCATTCAACTCCTCGC包含上述兩條shRNA的質(zhì)粒及其細(xì)胞系均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。具體的質(zhì)粒為pcDNA3.0+GFP+U6/OPN-RNAi-1和pcDNA3.0+GFP+U6/OPN-RNAi-2。
質(zhì)粒的通用結(jié)構(gòu)如圖1所示。
質(zhì)粒的構(gòu)建方法為設(shè)計(jì)三條引物U6-F、U6-R+shRNA1和U6-R+shRNA2,U6-F引物含有BamH I的酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基,U6-R+shRNA1和2分別含有shDNA1和shDNA2序列,并且含有Xba I酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基。用人的基因組DNA為模板,分別用引物U6-F和U6-R+shRNA1及U6-R+shRNA2進(jìn)行擴(kuò)增,得到U6+shRNA的PCR產(chǎn)物,用BamH I和Xba I酶切之后連接到pcDNA3.0的BamH I和Xba I酶切位點(diǎn)之間。EGFP(增強(qiáng)綠色熒光蛋白)插入到pcDNA3.0的Kpn I和BamH I酶切位點(diǎn)之間。
本發(fā)明提供了兩種shRNA序列,并在pcDNA3.0的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改造,使之可表達(dá)EGFP,可作為更好的轉(zhuǎn)染標(biāo)記,不共轉(zhuǎn)染更方便和經(jīng)濟(jì)。
本發(fā)明篩選的含有OPN-shRNA的穩(wěn)定細(xì)胞系為研究OPN在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用機(jī)制提供了極好的研究材料,也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍,并將在惡性腫瘤的治療研究中起到重要作用。
圖1質(zhì)粒pcDNA3.0+EGFP+U6/OPN-RNAi-1和OPN-RNAi-2的通用圖譜。
圖2穩(wěn)定細(xì)胞系中OPN表達(dá)水平檢測(cè)圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1針對(duì)OPN基因RNAi載體的構(gòu)建一、RNA干擾片段的選擇首先從GeneBankTM得到OPN的mRNA序列,根據(jù)文獻(xiàn)提供的經(jīng)驗(yàn)利用Ambion網(wǎng)站設(shè)計(jì)siRNA軟件選取了兩條siRNA片段,核苷酸序列如下siRNA1CGACTCTGATGATGTAGATGACACTsiRNA2GCGAGGAGTTGAATGGTGCATACAA根據(jù)這兩條siRNA片段和U6啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)以下三條引物U6-F’CATGGATCCTCGGGCAGGAAGAGGGCCTAU6-R+shRNA15’-CATTCTAGAAAAAACGACTCTGATGATGTAGATGACACT AGTGTCATCTACATCATCAGAGTCGCGGAATTCCGCGTCCTTTCCACAAG3’U6-R+shRNA25’-CATTCTAGAAAAAAGCGAGGAGTTGAATGGTGCATACAA TTGTATGCACCATTCAACTCCTCGCCGGAATTCCGCGTCCTTTCCACAAG-3’帶有下劃線的為酶切位點(diǎn),下劃線之前的為保護(hù)堿基,方框中為siRNA之間的Loop結(jié)構(gòu),前后反向互補(bǔ)序列形成shRNA結(jié)構(gòu)。
二、U6+shRNA片段和EGFP的擴(kuò)增用人的基因組DNA為模板,分別用U6和U6-R+shRNA1或shRNA2進(jìn)行擴(kuò)增,得到的產(chǎn)物即為U6啟動(dòng)子+shRNA片段;用PWEN100為模板,根據(jù)EGFP的序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR,得到的PCR產(chǎn)物即為EGFP。
三、RNAi載體的構(gòu)建將載體pcDNA3.0和EGFP分別用Kpn I和BamH I進(jìn)行雙酶切,酶切后切膠回收目的片段,將載體和EGFP的酶切片段連接。按照常規(guī)方法制備大腸桿菌感受態(tài),將連接好的產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化,涂板后37℃培養(yǎng)過(guò)夜,挑出單菌落搖菌培養(yǎng),提取質(zhì)粒并用Kpn I和BamH I雙酶切鑒定,陽(yáng)性克隆進(jìn)一步用T7引物測(cè)序鑒定,擴(kuò)增并純化陽(yáng)性克隆,即得到pcDNA3.0+EGFP質(zhì)粒。
將載體pcDNA3.0+EGFP和U6+shRNA分別用BamH I和Xba I進(jìn)行雙酶切,回收、連接、轉(zhuǎn)化及鑒定同上,陽(yáng)性克隆進(jìn)一步用U6-F引物測(cè)序,擴(kuò)增并純化陽(yáng)性克隆,即得到pcDNA3.0+EGFP+U6+shRNA的RNAi載體。
實(shí)施例2RNAi載體的轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定細(xì)胞系的篩選以5×104/孔的密度在24孔板上鋪SK-Hep-1細(xì)胞,24小時(shí)后進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。將帶有OPN基因序列的RNAi載體和帶有無(wú)關(guān)序列的負(fù)對(duì)照載體各500ng轉(zhuǎn)染細(xì)胞,轉(zhuǎn)染試劑使用Lipofectamine(Invitrogen),具體操作步驟見(jiàn)Invitrogen公司脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑使用說(shuō)明。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后以1∶20的比例傳代轉(zhuǎn)染細(xì)胞,加500ug/ml的G418進(jìn)行穩(wěn)定細(xì)胞系的篩選,10-14天后在熒光顯微鏡下標(biāo)記表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞集落,轉(zhuǎn)移至孔板繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng),凍存能穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的穩(wěn)定細(xì)胞系,以備繼續(xù)研究之用。
實(shí)施例3目標(biāo)基因OPN在穩(wěn)定細(xì)胞系中表達(dá)的比較分析提取穩(wěn)定細(xì)胞系及SK-Hep-1的RNA,提取RNA使用試劑RNA提取試劑Trizol(Invitrogen),具體操作步驟見(jiàn)Invitrogen公司Trizol試劑使用說(shuō)明。用2ug的RNA進(jìn)行RT-PCR;RT使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega),用隨機(jī)引物進(jìn)行RT,具體見(jiàn)Promega公司的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書(shū)。PCR時(shí)所用OPN引物為根據(jù)OPN的Exon序列設(shè)計(jì)而得,用HPBDG作為內(nèi)源對(duì)照,引物序列如下OPN-FAGCCTTCTCAGCCAAACG OPN-RGACTTACTTGGAAGGGTCTGTGHPBDG-FTCTGGTAACGGCAATGCGGHPBDG-RGCAGATGGCTCCGATGGTG用55℃退火,擴(kuò)增27個(gè)循環(huán),PCR完成之后用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,拍照分析,結(jié)果見(jiàn)圖2,由圖可知,在含pcDNA3.0+EGFP+U6/OPN-RNAi-1和2的穩(wěn)定細(xì)胞系中,OPN的表達(dá)水平都有明顯的下調(diào),而在含負(fù)對(duì)照載體的穩(wěn)定細(xì)胞系中,OPN的表達(dá)水平無(wú)變化。
由此可見(jiàn),本發(fā)明中的OPN-RNAi序列和根據(jù)pcDNA3.0所改造使用的載體,在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中能夠有效的抑制目標(biāo)基因的表達(dá),并可以用于轉(zhuǎn)染后目標(biāo)基因下調(diào)的穩(wěn)定細(xì)胞系的篩選。因此該RNAi序列可以用來(lái)有效的抑制OPN的表達(dá),可以作為一種抑制OPN表達(dá)的小分子RNA藥物,故可用于治療與OPN表達(dá)密切相關(guān)的一些疾病,如動(dòng)脈粥樣硬化、骨質(zhì)疏松癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病及多種腫瘤等;本發(fā)明建立的抑制OPN表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系及其負(fù)對(duì)照穩(wěn)定細(xì)胞系也可用來(lái)做為研究OPN在肝癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中作用機(jī)制的模型;本發(fā)明改造的RNAi載體也可用于制備研究其它基因功能的試劑或是其它疾病的治療藥物。
權(quán)利要求
1.一種抑制骨橋蛋白OPN表達(dá)的核苷酸序列,其特征在于其包含有siRNA1或siRNA2序列。
2.按權(quán)利要求1所述的一種抑制骨橋蛋白OPN表達(dá)的核苷酸序列,其特征在于所述的核苷酸序列是siRNA1或siRNA2。
3.一種抑制骨橋蛋白OPN表達(dá)的shRNA,其特征在于其序列如shRNA1或shRNA2所示。
4.一種包含權(quán)利要求3所述shRNA的載體。
5.按權(quán)利要求4所述的載體,其特征在于所述載體為pcDNA3.0+GFP+U6/OPN-RNAi-1和pcDNA3.0+GFP+U6/OPN-RNAi-2。
6.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞,其特征在于,其含有權(quán)利要求4或5所述的載體。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種能抑制骨橋蛋白OPN表達(dá)的小分子RNA藥物及其表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明提供的抑制OPN表達(dá)的方法是RNAi技術(shù),具體提供了兩條能特異抑制OPN表達(dá)的shRNA序列,并提供了包含上述兩條shRNA的質(zhì)粒pcDNA3.0+EGFP+U6/OPN-RNAi-1和OPN-RNAi-2及其構(gòu)建方法。本發(fā)明可用于治療一些與OPN表達(dá)密切相關(guān)的疾病,如動(dòng)脈粥樣硬化、骨質(zhì)疏松癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病及多種高轉(zhuǎn)移性的腫瘤等。本發(fā)明改造的RNAi載體也可用于制備研究其它基因功能的試劑或是其它疾病的治療藥物。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1896235SQ20061003260
公開(kāi)日2007年1月17日 申請(qǐng)日期2006年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月9日
發(fā)明者莊詩(shī)美, 程家森, 楊金娥, 張宴 申請(qǐng)人:中山大學(xué)