檢測骨橋蛋白的電化學(xué)傳感器及其構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明利用一種檢測骨橋蛋白的電化學(xué)傳感器及其構(gòu)建方法。該傳感器為三電極體系，鉑絲電極作為對電極、飽和甘汞電極作為參比電極、修飾后金電極作為工作電極，葡聚糖胺作為一種常見的三維材料連接劑具有如下兩大優(yōu)勢：（1）減少蛋白質(zhì)變性和非特異性結(jié)合，（2）葡聚糖胺的氨基與抗體定向多肽相連形成的復(fù)合三維傳感界面具有較好的抗體綁定能力和較多的固定位點(diǎn)。本發(fā)明結(jié)合電化學(xué)技術(shù)和復(fù)合三維材料的優(yōu)勢，制備出一種新型的電化學(xué)生物傳感器，實現(xiàn)了對骨橋蛋白高特異性定量檢測。
【專利說明】檢測骨橋蛋白的電化學(xué)傳感器及其構(gòu)建方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明利用一種檢測骨橋蛋白的電化學(xué)傳感器及其構(gòu)建方法。

【背景技術(shù)】
[0002]1979年，Senger等首次報道一種包含RGD整合素結(jié)合區(qū)且與惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)的磷酸化糖蛋白及其與腫瘤的關(guān)系，稱之為轉(zhuǎn)化相關(guān)性磷酸蛋白。后來Franzen等從骨基質(zhì)和牙齒中分離出一種磷酸蛋白，特性與轉(zhuǎn)化相關(guān)性磷酸蛋白相似，人們將其命名為Osteopontin(OPN)，它可以調(diào)控腫瘤的轉(zhuǎn)移。分泌后，OPN可以參與許多腫瘤的活動，例如:腫瘤血管生成、入侵、粘附、遷移、逃避識別/破壞免疫系統(tǒng)，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。它在心臟和血管中的正常表達(dá)水平很低，但是，如果持續(xù)增加其表達(dá)水平將會引發(fā)胃癌、乳腺癌、食道癌、腎癌、結(jié)腸直癌和子宮宮頸癌等疾病。
[0003]近年來，OPN因可作為一些疾病的診斷標(biāo)志物和治療目標(biāo)而引起了很多研究者的關(guān)注。因此，一些檢測OPN的方法被不斷報道，迄今為止，ELISA法是檢測OPN最常用的方法，但是由于ELISA法需要耗費(fèi)大量的時間和樣品并且靈敏度不高，因此，找出一種新穎、靈敏、便捷的方法檢測OPN是非常必要的。
[0004]電化學(xué)傳感器具有選擇性高、檢出限低等優(yōu)點(diǎn)。在電化學(xué)免疫傳感器中，免疫復(fù)合物(抗體)通常被間接固定在電極上。一些特殊的分子經(jīng)常被作為連接劑來連接電極和抗體，葡聚糖胺作為一種最常見的連接劑之一，被廣泛用于蛋白質(zhì)的固定。它是一種富含氨基，通過葡萄糖分子之間1，6連接形成的線型高分子聚合物。葡聚糖胺有兩大優(yōu)勢:第一，它不但可以降低蛋白質(zhì)變性的幾率，而且可以盡量避免配體與傳感器表面的非特異性結(jié)合，是生物分子和金基底之間有效的屏障；第二，葡聚糖胺的氨基與抗體定向多肽相連形成的復(fù)合三維傳感界面具有較好的抗體綁定能力和較多的固定位點(diǎn)。然而，蛋白質(zhì)的羧基和葡聚糖胺的氨基直接反應(yīng)可能會破壞蛋白質(zhì)的活性區(qū)域，因此，許多科學(xué)家都在努力尋找一種可以特異性地結(jié)合在蛋白質(zhì)穩(wěn)定區(qū)域的分子。抗體分子的Fe端為其穩(wěn)定區(qū)，F(xiàn)ab端可以穩(wěn)定地結(jié)合抗原。Carbonell等發(fā)現(xiàn)了一個新的六聚體短肽HWRGWV,可以結(jié)合到IgG的Fe端。并且該短肽綁定的親和力比蛋白質(zhì)低，這一特點(diǎn)成為該短肽應(yīng)用于其它體系的優(yōu)勢。目前，葡聚糖胺和短肽HWRGWV已被應(yīng)用于多個領(lǐng)域的研究中，并取得了良好的效果。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的之一在于提供一種檢測骨橋蛋白的電化學(xué)傳感器，該傳感器含有葡聚糖胺和短肽等特殊分子組成的三維體系，并將其修飾到金電極上構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器來檢測0ΡΝ，及其作為OPN電化學(xué)免疫傳感器的使用方法。
[0006]本發(fā)明的目的之二在于提供該傳感器的構(gòu)建方法。
[0007]一種檢測骨橋蛋白的電化學(xué)傳感器，三電極體系，鉬絲電極作為對電極、飽和甘汞電極作為參比電極、修飾后金電極作為工作電極，其特征在于所述的修飾后金電極具有三維結(jié)構(gòu),先通過金巰鍵在金電極表面修飾ω-巰基^ 酸(MUA)與6-巰基己醇(MCH),再利用氨基與羧基的交聯(lián)反應(yīng)連接三維材料葡聚糖胺，短肽的羧基與葡聚糖胺的氨基相連，骨橋蛋白抗體通過Fe末端與短肽相連，即得到修飾后金電極；所述的短肽的序列為:Acetylated-HWRGWVA。
[0008]一種構(gòu)建上述的檢測骨橋蛋白的電化學(xué)傳感器的方法，其特征在于傳感器的構(gòu)建方法為:
a.三維構(gòu)型基底的形成:
a-Ι.將處理好的金電極浸泡在ω-巰基^^一酸(MUA)與6_巰基己醇(MCH)的混合溶液中過夜；然后分別用無水乙醇和超純水沖洗干凈并吹干待用
a-2.將步驟a-Ι所得金電極在1-(3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的混合液中浸泡20分鐘，再將該金電極放在濃度為
0.lmg/mL的葡聚糖胺溶液中孵育30分鐘；最后用乙醇胺進(jìn)行封板；
a-3.向步驟a-2所得的金電極浸沒在0.5mg/mL短肽的溶液中，反應(yīng)12-15小時；即形成傳感器的三維構(gòu)型基底；
b.將步驟a所得金電極浸沒在10Pg/mL的骨橋蛋白抗體溶液中共同孵育2 h，以固定Ant1-OPN，最終得到修飾后金電極；
c.將步驟b所得修飾后金電極與鉬絲電極和飽和甘汞電極一起構(gòu)成三電極傳感器，即為檢測骨橋蛋白的電化學(xué)傳感器。
[0009]上述的步驟a-Ι的金電極的處理方法具體為:用超純水將金電極充分沖洗至潔凈狀態(tài)，并吹干；然后，分別用3000、5000目的砂紙打磨，并依次在含有不同粒度I μπι，0.3μπι, 0.05 μπι的氧化鋁砂漿中拋光電極，直至電極表面呈鏡面無痕狀，用超純水和乙醇沖洗干凈后，然后，向電極表面滴加20 μ? piranha，即98% H2SO4: 30% H202=3:1溶液；5分鐘后用超純水清洗干凈；最后，將電極放入0.5 M H2SO4中，用循環(huán)伏安法掃描(0V-+1.6V)至信號穩(wěn)定)，用超純水沖洗干凈、氮?dú)獯蹈珊蟠谩?br> [0010]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)如下所述:本發(fā)明利用一種新型復(fù)合三維材料修飾的金電極構(gòu)建一種檢測骨橋蛋白的電化學(xué)傳感器。葡聚糖胺作為一種最常見的連接劑之一，廣泛用來固定蛋白質(zhì)，葡聚糖胺有兩大優(yōu)勢:第一，它不但可以降低蛋白質(zhì)變性的幾率，而且可以盡量避免配體與傳感器表面的非特異性結(jié)合，是生物分子和金基底之間有效的屏障；第二，葡聚糖胺的氨基與抗體定向多肽相連形成的復(fù)合三維傳感界面具有較好的抗體綁定能力和較多的固定位點(diǎn)。再用一段短肽來連接葡聚糖胺和抗體，從而避免了蛋白質(zhì)的羧基和葡聚糖胺的氨基直接反應(yīng)時破壞蛋白質(zhì)的活性區(qū)域。本發(fā)明結(jié)合電化學(xué)技術(shù)和三維材料的優(yōu)勢，制備出一種新型的電化學(xué)生物傳感器，通過交流阻抗方法對OPN進(jìn)行高特異性定量檢測。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為最佳條件下，加入不同濃度的OPN溶液的交流阻抗圖。

【具體實施方式】
[0012]現(xiàn)將本發(fā)明的具體實施例敘述于后。
[0013]實施例1 本實施例中三維構(gòu)型傳感器的構(gòu)建方法和步驟如下:
1、三維構(gòu)型基底的形成:
a.金電極的預(yù)處理:首先，用超純水將電極充分沖洗至潔凈狀態(tài)，并以洗耳球吹干電極表面；然后，分別在3000、5000目的砂紙上打磨電極，并依次在含有不同粒度(I ym,
0.3 ym, 0.05 μ m)的氧化鋁砂漿中拋光電極，直至電極表面呈鏡面無痕狀，用超純水沖洗干凈后，再依次用乙醇和超純水各超聲清洗5分鐘，然后，向電極表面滴加20 μ?piranha(98% H2SO4: 30% H202=3:1)溶液，5分鐘后用超純水清洗干凈。最后，將電極放入
0.5 M H2SO4中，用循環(huán)伏安掃描(0V- +1.6V)至信號穩(wěn)定(約40圈)，用超純水沖洗干凈、氮?dú)獯蹈珊蟠谩?br> [0014]b.自組裝單分子層的形成:將處理好的電極立即浸泡在ω-巰基^^一酸(MUA)&6-巰基己醇(MCH)混合溶液中過夜。然后分別用無水乙醇和超純水沖洗干凈并用氮?dú)獯蹈珊蠊┫乱徊绞褂谩?br> [0015]c.準(zhǔn)備三維材料修飾的電極:
(I)將修飾過的電極在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)& N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的混合液中浸泡20分鐘，用以活化MUA末端的羧基?；罨Y(jié)束，將電極放在葡聚糖胺溶液中孵育三十分鐘。為了阻止其它非特異性分子結(jié)合活化的羧基，用乙醇胺對上述處理過的電極進(jìn)行封板。
[0016](2)向封板后的電極表面滴加含有短肽Acetylated-HWRGWVA的溶液，至少反應(yīng)12小時。短肽Acetylated-HWRGWVA的羧基與葡聚糖胺的氨基形成共價酰胺鍵結(jié)合在電極表面，即形成OPN檢測傳感器的三維構(gòu)型基底。
[0017]2、抗體的固定和OPN的檢測
將一定濃度的OPN抗體(Ant1-OPN)與上述已修飾三維材料的電極共同孵育，以固定Ant1-OPN,并利用抗原抗體的特異性反應(yīng)，檢測目標(biāo)蛋白(0ΡΝ)。將由上述構(gòu)建修飾后金電極作為工作電極、鉬絲電極作為對電極、飽和甘汞電極作為參比電極，組成傳統(tǒng)的三電極體系；檢測時，將三電極體系置于鐵氰化鉀溶液中測定不同濃度OPN時的交流阻抗值。
[0018]電化學(xué)檢測0ΡΝ:
采用 OPN 濃度分另Ij 為 2.27X10' 3.41X10-9, 5.68X10' 9.08X10-9,13.62X10—9，20.43X10_9 M/L.測試條件:以構(gòu)建修飾后金電極作為工作電極、鉬絲電極作為對電極、飽和甘汞電極作為參比電極，組成傳統(tǒng)的三電極體系；檢測時，將三電極體系置于鐵氰化鉀溶液中測定不同濃度OPN時的交流阻抗值。
[0019]參見附圖，圖1為最佳條件下，加入不同濃度的OPN溶液的交流阻抗圖。
[0020]由圖可見，隨著OPN濃度的增高，阻抗(Ω )也呈現(xiàn)上升趨勢。
[0021]本發(fā)明方法制備的OPN電化學(xué)免疫傳感器具有無標(biāo)記、較高的靈敏度、良好的選擇性等優(yōu)勢。不僅為OPN檢測提供了一種較好的方法，也為其它腫瘤標(biāo)志物的檢測提供了一個良好的平臺，并且推動腫瘤早期診斷和治療的發(fā)展。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測骨橋蛋白的電化學(xué)傳感器，三電極體系，鉬絲電極作為對電極、飽和甘汞電極作為參比電極、修飾后金電極作為工作電極，其特征在于所述的修飾后金電極具有三維結(jié)構(gòu)，先通過金巰鍵在金電極表面修飾ω-巰基i 酸(MUA)與6-巰基己醇(MCH),再利用氨基與羧基的交聯(lián)反應(yīng)連接三維材料葡聚糖胺，短肽的羧基與葡聚糖胺的氨基相連，骨橋蛋白抗體通過Fe末端與短肽相連，即得到修飾后金電極；所述的短肽的序列為:Acetylated-HWRGWVA。
2.—種構(gòu)建根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測骨橋蛋白的電化學(xué)傳感器的方法，其特征在于傳感器的構(gòu)建方法為: a.三維構(gòu)型基底的形成: a-Ι.將處理好的金電極浸泡在ω-巰基^^一酸(MUA)與6_巰基己醇(MCH)的混合溶液中過夜；然后分別用無水乙醇和超純水沖洗干凈并吹干待用 a-2.將步驟a-Ι所得金電極在1-(3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的混合液中浸泡20分鐘，再將該金電極放在濃度為0.lmg/mL的葡聚糖胺溶液中孵育30分鐘；最后用乙醇胺進(jìn)行封板； a-3.向步驟a-2所得的金電極浸沒在0.5mg/mL短肽的溶液中，反應(yīng)12-15小時；即形成傳感器的三維構(gòu)型基底； b.將步驟a所得金電極浸沒在10Pg/mL的骨橋蛋白抗體溶液中共同孵育2 h，以固定Ant1-OPN，最終得到修飾后金電極； c.將步驟b所得修飾后金電極與鉬絲電極和飽和甘汞電極一起構(gòu)成三電極傳感器，即為檢測骨橋蛋白的電化學(xué)傳感器。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的步驟a-Ι的金電極的處理方法具體為:用超純水將金電極充分沖洗至潔凈狀態(tài)，并吹干；然后，分別用3000、5000目的砂紙打磨，并依次在含有不同粒度I μπι，0.3 ym, 0.05 μ m的氧化鋁砂漿中拋光電極，直至電極表面呈鏡面無痕狀，用超純水和乙醇沖洗干凈后，然后，向電極表面滴加20 VL piranha,即98% H2SO4: 30% H202=3: I溶液；5分鐘后用超純水清洗干凈；最后，將電極放入0.5 MH2SO4中，用循環(huán)伏安法掃描(0V-+1.6V)至信號穩(wěn)定)，用超純水沖洗干凈、氮?dú)獯蹈珊蟠谩?br> 【文檔編號】G01N33/68GK104165913SQ201410210922
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年5月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月19日
【發(fā)明者】李根喜, 陳紅霞, 賈盛崧 申請人:上海大學(xué)