本發(fā)明涉及醫(yī)藥，特別是苯硼酸修飾的介孔二氧化硅/胰島素納米粒的制備及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

糖尿?。―iabetes Mellitus，DM）是目前病因和發(fā)病機理尚未完全認識的常見的內(nèi)分泌代謝疾病。由于胰島素分泌不足或作用缺陷所引起的以慢性高血糖為主,合并脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂為特征的綜合征。胰島素治療糖尿病始于1922年，至今仍為治療1型糖尿病的首選藥物具有不可替代的作用。胰島素的給藥途徑為皮下注射，每天注射胰島素維持血糖水平，這在一定程度上反映糖尿病的控制情況，但這和正常生理條件下胰腺對血糖水平的調(diào)節(jié)和維持還相差很遠，有可能會導致心血管疾病，腎病，白內(nèi)障等。雖然近年來開發(fā)和研制了多種胰島素的給藥途徑，但還不能根本克服血糖波動對患者的身體危害。因此發(fā)明一種“自調(diào)節(jié)”“可控式”“開-關(guān)”的根據(jù)體內(nèi)葡萄糖濃度的變化釋放胰島素系統(tǒng)迫在眉睫。

介孔二氧化硅納米粒子(mesoporous silica nanoparticles，MSN)具有在2～50nm 范圍內(nèi)可連續(xù)調(diào)節(jié)的均一介孔孔徑、規(guī)則的孔道、穩(wěn)定的骨架結(jié)構(gòu)、易于修飾的內(nèi)外表面和無生理毒性等特點，非常適合用作藥物分子的載體。同時，MSN具有巨大的比表面積（＞900m2/g）和比孔容（＞0.9cm3/g），可以在孔道內(nèi)負載各種藥物，并可對藥物起到緩釋作用，提高藥效的持久性。因此，近年來MSN在可控藥物傳輸系統(tǒng)方面的應(yīng)用日益得到重視，Chiyoung Park 等利用3- 氨基丙基三乙氧基硅烷先對介孔二氧化硅納米粒子進行表面改性，使其表面帶有氨基，進而再利用含端羧基的聚合物與氨基修飾介孔二氧化硅反應(yīng)，在介孔二氧化硅表面修飾一層pH響應(yīng)性聚合物，可控釋放介孔二氧化硅孔道內(nèi)的藥物分子。雖然介孔二氧化硅作為藥物載體已有很多研究，但做為可逆的“開-關(guān)”式藥物載體系統(tǒng)卻鮮見報道。

苯硼酸基團（phenylboronic acid, PBA）可以與含有鄰二醇的化合物（如葡萄糖、聚乙烯醇）可逆結(jié)合五元或六元環(huán)可逆酯成為近年來的研究熱點，因此，Kitano等將PBA引入聚（N-乙烯基-2-吡咯烷酮）中作為葡萄糖敏感分子形成聚（NVP-co-PBA）。PVA由于含有二羥基而與聚（NVP- co- PBA）形成復合物，將胰島素加入該體系中，復合物的形成和解離可以引起黏度的變化，復合物形成時為凝膠狀態(tài)，加入葡萄糖后與PVA競爭硼酸基團，隨著葡萄糖濃度的增加，凝膠交聯(lián)密度降低，變?yōu)槿苣z態(tài)，胰島素的釋放增加，從而可得到響應(yīng)于葡萄糖濃度變化的釋放。但該類載體系統(tǒng)只能對藥物進行一次裝載和釋放，不能循環(huán)進行，因此本發(fā)明致力于開發(fā)一種可逆的負載胰島素系統(tǒng)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供苯硼酸修飾的介孔二氧化硅/胰島素納米粒的制備及應(yīng)用，可有效解決傳統(tǒng)藥物載體單向釋放藥物的問題。

本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，首先合成介孔二氧化硅納米粒，在其表面修飾氨基，然后通過物理吸附，在介孔結(jié)構(gòu)內(nèi)部負載藥物胰島素，再進一步修飾苯硼酸及多糖，得基于苯硼酸修飾的介孔二氧化硅/胰島素納米粒；

包括以下步驟：

（1）制備介孔二氧化硅納米粒：將摩爾濃度為2mol/L的氫氧化鈉溶液3.0-4.0mL 與400-500mL 蒸餾水混合，在75-85℃條件下攪拌加入1.0-1.2g 十六烷基三甲基溴化銨，再滴加5.0-5.8mL正硅酸四乙酯，攪拌1.5-2.5h，過濾，真空干燥，500-600℃煅燒3.5-4.5h ，得介孔二氧化硅納米粒；

（2）介孔二氧化硅納米粒的氨化：將400-600mg 介孔二氧化硅納米粒分散于40-60mL 無水甲苯中，室溫下攪拌，滴加1.0-2.0mL 3-氨丙基三甲氨基硅烷，攪拌25-35min ，加熱升溫至100-120℃，回流24h，抽濾，得到氨基化介孔二氧化硅納米粒；

（3）將40-60mg 氨基化介孔二氧化硅納米粒和20-30mg 胰島素溶解于40-60mL 鹽酸溶液中，8-12℃ 避光攪拌24h，得到介孔二氧化硅/胰島素納米粒；

（4）將步驟（3）所得的介孔二氧化硅/胰島素納米粒20-40mg 溶解到20-40mL 有機溶劑中得溶液A，將6.0-8.0mg 苯硼酸與10-14mg 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽溶解到5-10mL 有機溶劑中，攪拌30min得溶液B，將溶液B加入到溶液A中，室溫攪拌24h，得基于苯硼酸修飾的介孔二氧化硅/胰島素納米粒；

所述的有機溶劑為乙醇，二甲基亞砜，二甲基甲酰胺或二氯甲烷中的一種。

所制備的苯硼酸修飾的介孔二氧化硅/胰島素納米粒的粒徑為150-170nm。

所述的苯硼酸具有葡萄糖響應(yīng)性，多糖具有鄰二醇結(jié)構(gòu)，生物相容性好。

所述的胰島素的載藥量為23%-27%。苯硼酸與二氧化硅的質(zhì)量比為1:3-5。

所制備的苯硼酸修飾的介孔二氧化硅/胰島素納米粒在制備糖尿病治療藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明方法制備的苯硼酸修飾的介孔二氧化硅/胰島素納米?？捎糜谔悄虿∷幬锏闹苽?，能夠自動感知患者體內(nèi)的葡萄糖濃度變化，能夠可逆的開放與關(guān)閉胰島素的釋放閥門，調(diào)控藥物的釋放與否，維持患者平穩(wěn)的血糖水平，避免血糖波動誘發(fā)并發(fā)癥。

本發(fā)明合成工藝簡單，制備的納米粒具有良好的生物相容性，能夠反復開關(guān)藥物的釋放閥門，對于藥物的釋放具有緩控釋作用，在體內(nèi)能夠長循環(huán)，減少給藥次數(shù)，是糖尿病治療藥物上的創(chuàng)新。

具體實施方式

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細說明。

實施例1

本發(fā)明在具體實施中，可由以下步驟實現(xiàn)：

（1）制備介孔二氧化硅納米粒：將摩爾濃度為2mol/L的氫氧化鈉溶液3.0mL 與400mL 蒸餾水混合，在75℃條件下攪拌加入1.0g 十六烷基三甲基溴化銨，再滴加5.0mL正硅酸四乙酯，攪拌1.5h，過濾，真空干燥，500℃煅燒3.5h ，得介孔二氧化硅納米粒；

（2）介孔二氧化硅納米粒的氨化：將400mg 介孔二氧化硅納米粒分散于40mL 無水甲苯中，室溫下攪拌，滴加1.0mL 3-氨丙基三甲氨基硅烷，攪拌25min ，加熱升溫至100℃，回流24h，抽濾，得到氨基化介孔二氧化硅納米粒；

（3）將40mg 氨基化介孔二氧化硅納米粒和20mg 胰島素溶解于40mL 鹽酸溶液中，8℃ 避光攪拌24h，得到介孔二氧化硅/胰島素納米粒；

（4）將步驟（3）所得的介孔二氧化硅/胰島素納米粒20mg 溶解到20mL 乙醇中得溶液A，將6.0mg 苯硼酸與10mg 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽溶解到5mL乙醇中，攪拌30min得溶液B，將溶液B加入到溶液A中，室溫攪拌24h，得基于苯硼酸修飾的介孔二氧化硅/胰島素納米粒。

實施例2

本發(fā)明在具體實施中，可由以下步驟實現(xiàn)：

（1）制備介孔二氧化硅納米粒：將摩爾濃度為2mol/L的氫氧化鈉溶液4.0mL 與500mL 蒸餾水混合，在85℃條件下攪拌加入1.2g 十六烷基三甲基溴化銨，再滴加5.8mL正硅酸四乙酯，攪拌2.5h，過濾，真空干燥，600℃煅燒4.5h ，得介孔二氧化硅納米粒；

（2）介孔二氧化硅納米粒的氨化：將600mg 介孔二氧化硅納米粒分散于60mL 無水甲苯中，室溫下攪拌，滴加2.0mL 3-氨丙基三甲氨基硅烷，攪拌35min ，加熱升溫至120℃，回流24h，抽濾，得到氨基化介孔二氧化硅納米粒；

（3）將60mg 氨基化介孔二氧化硅納米粒和30mg 胰島素溶解于60mL 鹽酸溶液中，12℃ 避光攪拌24h，得到介孔二氧化硅/胰島素納米粒；

（4）將步驟（3）所得的介孔二氧化硅/胰島素納米粒40mg 溶解到40mL 二甲基亞砜中得溶液A，將8.0mg 苯硼酸與14mg 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽溶解到10mL二甲基亞砜中，攪拌30min得溶液B，將溶液B加入到溶液A中，室溫攪拌24h，得基于苯硼酸修飾的介孔二氧化硅/胰島素納米粒。

實施例3

本發(fā)明在具體實施中，可由以下步驟實現(xiàn)：

（1）制備介孔二氧化硅納米粒：將摩爾濃度為2mol/L的氫氧化鈉溶液3.5mL 與450mL 蒸餾水混合，在80℃條件下攪拌加入1.1g 十六烷基三甲基溴化銨，再滴加5.2mL正硅酸四乙酯，攪拌2h，過濾，真空干燥，550℃煅燒4h ，得介孔二氧化硅納米粒；

（2）介孔二氧化硅納米粒的氨化：將500mg 介孔二氧化硅納米粒分散于45mL 無水甲苯中，室溫下攪拌，滴加1.2mL 3-氨丙基三甲氨基硅烷，攪拌30min ，加熱升溫至110℃，回流24h，抽濾，得到氨基化介孔二氧化硅納米粒；

（3）將50mg 氨基化介孔二氧化硅納米粒和25mg 胰島素溶解于45mL 鹽酸溶液中，10℃ 避光攪拌24h，得到介孔二氧化硅/胰島素納米粒；

（4）將步驟（3）所得的介孔二氧化硅/胰島素納米粒30mg 溶解到30mL 二甲基甲酰胺中得溶液A，將6.5mg 苯硼酸與12mg 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽溶解到7mL 二甲基甲酰胺中，攪拌30min得溶液B，將溶液B加入到溶液A中，室溫攪拌24h，得基于苯硼酸修飾的介孔二氧化硅/胰島素納米粒。

實施例4

本發(fā)明在具體實施中，可由以下步驟實現(xiàn)：

（1）制備介孔二氧化硅納米粒：將摩爾濃度為2mol/L的氫氧化鈉溶液3.2mL 與470mL 蒸餾水混合，在80℃條件下攪拌加入1.1g 十六烷基三甲基溴化銨，再滴加5.5mL正硅酸四乙酯，攪拌2h，過濾，真空干燥，550℃煅燒4h ，得介孔二氧化硅納米粒；

（2）介孔二氧化硅納米粒的氨化：將450mg 介孔二氧化硅納米粒分散于50mL 無水甲苯中，室溫下攪拌，滴加1.5mL 3-氨丙基三甲氨基硅烷，攪拌30min ，加熱升溫至110℃，回流24h，抽濾，得到氨基化介孔二氧化硅納米粒；

（3）將50mg 氨基化介孔二氧化硅納米粒和25mg 胰島素溶解于50mL 鹽酸溶液中，10℃ 避光攪拌24h，得到介孔二氧化硅/胰島素納米粒；

（4）將步驟（3）所得的介孔二氧化硅/胰島素納米粒35mg 溶解到35mL 二氯甲烷中得溶液A，將7.0mg 苯硼酸與11mg 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽溶解到8mL 二氯甲烷中，攪拌30min得溶液B，將溶液B加入到溶液A中，室溫攪拌24h，得基于苯硼酸修飾的介孔二氧化硅/胰島素納米粒。

本發(fā)明在介孔二氧化硅納米粒表面修飾苯硼酸及含有鄰二醇的多糖，利用苯硼酸的葡萄糖敏感性以及多糖的鄰二醇基與葡萄糖競爭苯硼酸的結(jié)合位點，建立葡萄糖敏感的可逆的胰島素釋放系統(tǒng)，不僅克服可傳統(tǒng)藥物傳遞系統(tǒng)單向釋放藥物的弊端，而且該系統(tǒng)具有緩控釋的特性，在體內(nèi)能夠長循環(huán)，減少給藥次數(shù)，所用材料均具有良好的生物相容性，避免了一系列化學反應(yīng)對機體的副作應(yīng)。相關(guān)實驗資料如下：

一、基于苯硼酸修飾的介孔二氧化硅/胰島素納米粒掃譜分析：

對本發(fā)明基于苯硼酸修飾的介孔二氧化硅/胰島素納米粒進行傅里葉紅外圖譜分析可知：當苯硼酸與介孔二氧化硅納米粒偶聯(lián)后，1645cm-1處出現(xiàn)了酰胺鍵的伸縮振動峰，在1325cm-1處出現(xiàn)了硼-氧鍵的峰，證明苯硼酸有效地連接到介孔二氧化硅納米粒上。

二、基于苯硼酸修飾的介孔二氧化硅/胰島素納米粒的表征：

1、基于苯硼酸修飾的介孔二氧化硅/胰島素納米粒中胰島素含量的測定

采用紫外分光光度計，于276nm波長處測定胰島素的含量，以式（1）計算樣品的載藥量，載藥量達到25%左右：

載藥量（%）=載入的藥物量/（載入的藥物量+載體量）×100 式（1）

2、基于苯硼酸修飾的介孔二氧化硅/胰島素納米粒粒徑和電位的測定

取適量基于苯硼酸修飾的介孔二氧化硅/胰島素納米粒分散于水中，用Nano-ZS90型激光納米粒度分析儀測得其粒徑和電位分別為150~170nm和18.2±2.5mV。

三、基于苯硼酸修飾的介孔二氧化硅/胰島素納米粒的藥物釋放實驗

取1mL 已知藥物含量的多糖/PBA-MSN/INS溶液置于透析袋里（MWCO=25000），分別浸入50mL 含不同濃度的葡萄糖溶液（0，3，5，10mg/mL）的pH7.4的PBS溶液中，在恒溫搖床中震蕩，固定恒溫搖床溫度37.0±0.5℃，轉(zhuǎn)速為100r/min。于0，5，1，2，4，8，12，24，36，48h 取樣，每次取樣同時補充同體積的釋藥介質(zhì)，采用HPLC法測定INS含量，計算累積釋藥量，計算累積釋放百分率。對釋藥數(shù)據(jù)進行擬合，探討其在不同葡萄糖濃度下的釋藥機制。數(shù)據(jù)結(jié)果表明，在36h 時，胰島素在0，3，5，10mg/mL 的葡萄糖溶液中的累積釋放率為10%，50%，65%，92%，表明該制劑有明顯的葡萄糖濃度依懶性。

四、基于苯硼酸修飾的介孔二氧化硅/胰島素納米粒的細胞增殖抑制實驗

采用SRB法，選擇對數(shù)生長期的HeLa細胞，調(diào)整細胞數(shù)為1×104/mL 接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μL （邊緣孔用無菌PBS填充），細胞貼壁生長24h 后加入不同的樣品溶液，分別為：空白組，多糖/PBA-MSN組，多糖/PBA-MSN/INS組。樣品溶液與細胞培養(yǎng)24h 后加入，每孔加入50μL 4℃ 預(yù)冷的50％三氯乙酸（TCA）固定細胞，固定10min 后移入4℃ 冰箱固定1h，取出棄去固定液，用去離子水洗5遍，甩干，室溫自然干燥。室溫晾干后，每孔加入SRB染液50μL，室溫避光放置15～30min 染色，棄染液，用1％的冰醋酸洗5遍，室溫干燥。之后，用150μL 非緩沖Tris堿液（10mM，pH＝10.5）溶解與細胞蛋白結(jié)合的染料，搖床微振蕩（37℃，100rpm，10min）于酶標儀515nm 波長處測每個小孔的OD值，計算細胞生長抑制率（％）＝（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100％，計算得到多糖/PBA-MSN組，多糖/PBA-MSN/INS組的細胞生長抑制率分別為3.8%，4.5%。結(jié)果表明，載體多糖/PBA-MSN及制劑多糖/PBA-MSN/INS在實驗劑量下對細胞無明顯毒性。

五、基于苯硼酸修飾的介孔二氧化硅/胰島素納米粒的體內(nèi)應(yīng)答式行為評價

采用正常大鼠為動物模型，分別于設(shè)定時間點（如0，3，5，10，12，24，36，48h）靜脈注射葡萄糖溶液（0.3g/kg），并于0時刻靜脈注射INS溶液劑（0.5IU/kg）、多糖/PBA-MSN/INS（INS 0.5IU/kg）和PBA-MSN/INS（INS 0.5IU/kg），INS溶液組分別于0和1h 給藥兩次；于一定時間間隔采血，通過血糖儀測定血糖水平。將所得血糖值對時間進行擬合，評價制劑的自調(diào)節(jié)釋放能力。結(jié)果表明，與INS溶液劑組和PBA-MSN/INS組對比，多糖/PBA-MSN/INS組能夠更長時間的維持血液中較低的葡萄糖水平，說明該納米粒在體內(nèi)對葡萄糖濃度具有敏感性，能夠有效的釋放胰島素。

通過以上實驗表明：本發(fā)明具有以下突出的有益技術(shù)效果：

（1）本發(fā)明通過多糖與體內(nèi)葡萄糖競爭性結(jié)合苯硼酸的結(jié)合位點，能夠根據(jù)體內(nèi)的葡萄糖濃度可逆的開啟與關(guān)閉胰島素的釋放閥門，實現(xiàn)智能可控的藥物釋放系統(tǒng)，在體內(nèi)能夠長循環(huán)，減少給藥次數(shù)，維持平穩(wěn)的血糖水平，大大避免由于血糖波動引發(fā)的并發(fā)癥。

（2）MSN粒徑小，表面易修飾，使得該體系能夠穩(wěn)定持久的存在于生理環(huán)境中，巨大的比表面積（＞900m2/g）和比孔容（＞0.9cm3/g），可以在孔道內(nèi)負載各種藥物，并可對藥物起到緩釋作用，提高藥效的持久性。

（3）本發(fā)明所用材料均具有良好的生物相容性，體系簡單、安全，避免了一系列化學反應(yīng)帶來的問題，并且基于苯硼酸修飾的介孔二氧化硅/胰島素納米粒的制備方法簡單，成本低廉，易于大規(guī)模制備，經(jīng)濟和社會效益巨大，是糖尿病治療藥物上的創(chuàng)新。