本發(fā)明涉及脂質(zhì)體制劑，具體而言，本發(fā)明涉及具有高含量的陽性脂質(zhì)化合物的脂質(zhì)體制劑及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

rna干擾(rnainterference，rnai)是近十年來發(fā)現(xiàn)的具有調(diào)節(jié)生物體內(nèi)基因表達(dá)功能的一種自身保護(hù)機制，rnai是由雙鏈rna(double-strandedrna，dsrna)介導(dǎo)的、由特定酶參與的特異性基因沉默現(xiàn)象，它在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平上阻斷基因的表達(dá)。隨著rnai技術(shù)的越來越成熟，目前已有多種圍繞rnai機制開發(fā)的核酸藥物進(jìn)入臨床試驗階段，調(diào)節(jié)異?；虮磉_(dá)的核酸藥物將有望成為的一種高效快捷的疾病治療途徑。

以rnai技術(shù)為研究起點的一系列核酸藥物近年來得到了很好的發(fā)展，其中包括小干擾核酸(smallinterferingrna，sirna)、微小核酸(microrna，mirna)、非編碼核酸(non-codingrna，ncrna)、反義核酸(antisenserna/dna)、小配體核酸(smallligandrna，slirna)及小激活核酸(smallactiverna，sarna)等，這些核酸通過包含rnai在內(nèi)不同的基因調(diào)節(jié)機制發(fā)揮作用，如sirna和mirna通過rnai機制調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)特定基因的表達(dá)水平，當(dāng)sirna或mirna進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，這些雙鏈rna能與細(xì)胞內(nèi)的特定蛋白結(jié)合形成rna誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(rnainducingsilencingcomplex，risc)，sirna在risc中解鏈后通過序列互補識別并與mrna結(jié)合，mrna被切割，達(dá)到下調(diào)基因表達(dá)的效果。rnai提供了一種與靶基因互補并阻斷編碼蛋白的mrna表達(dá)的基因治療方法。

雖然研究人員用基于脂質(zhì)體的載體系統(tǒng)來傳輸核酸藥物，在陽性脂質(zhì)體中的sirna通過全身給藥，有研究報道，這些核酸脂質(zhì)體制劑在體內(nèi)和體外 的實驗中得到了很好的驗證。但是目前在核酸脂質(zhì)體藥物制劑在運用中還存在幾大難題：1)缺乏高效的體內(nèi)傳輸系統(tǒng)；2)現(xiàn)有以脂質(zhì)體作為制劑形式，其核酸載藥量低；3)核酸脂質(zhì)體藥物體內(nèi)毒性高。

為了克服上述這些難題，本領(lǐng)域亟需一種具有高含量陽性脂質(zhì)化合物的脂質(zhì)體制劑以將高含量的核酸藥物安全地遞送至體內(nèi)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

一方面，本發(fā)明提供一種用于遞送核酸的脂質(zhì)體，其包含陽性脂質(zhì)化合物、磷脂和長效脂質(zhì)，其中，所述陽性脂質(zhì)化合物的重量百分含量為50％至90％，所述磷脂的重量百分含量為5％至10％，所述長效脂質(zhì)的重量百分含量為0％至10％；并且，其中，所述陽性脂質(zhì)化合物由脂類脂質(zhì)化合物和膽固醇類脂質(zhì)化合物組成，所述脂類脂質(zhì)化合物和所述膽固醇類脂質(zhì)化合物的摩爾比為4：1至1：4。優(yōu)選地，本發(fā)明的用于遞送核酸的脂質(zhì)體中陽性脂質(zhì)化合物的重量百分含量為60％-90％，或70％-90％，或75％-90％，或80％-90％，或85％-90％。

本發(fā)明的脂類脂質(zhì)化合物選自下述通式i、通式ii，通式iii和通式iv的化合物中的一種或多種：

其中，r,r'為c14-c22飽和或不飽和脂肪酸，a,a'為c1-c4烷基，n＝1-4。

在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，所述通式i的化合物選自下列化合物：

化合物1：r＝r’＝亞油酸基，n＝1，a＝ch3，a’＝ch3ch2；

化合物2：r＝r’＝亞油酸基，n＝2，a＝ch3，a’＝ch3ch2；

化合物3：r＝r’＝亞油酸基，n＝3，a＝ch3，a’＝ch3ch2；

化合物4：r＝r’＝亞油酸基，n＝4，a＝ch3，a’＝ch3ch2；

化合物5：r＝r’＝油酸基，n＝1，a＝ch3，a’＝ch3；

化合物6：r＝r’＝油酸基，n＝2，a＝ch3，a’＝ch3；

化合物7：r＝r’＝油酸基，n＝3，a＝ch3，a’＝ch3；

化合物8：r＝r’＝油酸基，n＝4，a＝ch3，a’＝ch3；

化合物9：r＝r’＝亞油酸基，n＝1，a＝ch3ch2，a’＝ch3ch2；

化合物10：r＝r’＝亞油酸基，n＝2，a＝ch3ch2，a’＝ch3ch2；

化合物11：r＝r’＝亞油酸基，n＝3，a＝ch3ch2，a’＝ch3ch2；

化合物12：r＝r’＝亞油酸基，n＝4，a＝ch3ch2，a’＝ch3ch2；

化合物13：r＝r’＝亞油酸基，n＝1，a＝ch3ch2，a’＝ch3；

化合物14：r＝r’＝亞油酸基，n＝2，a＝ch3ch2，a’＝ch3；

化合物15：r＝r’＝亞油酸基，n＝3，a＝ch3ch2，a’＝ch3；

化合物16：r＝r’＝亞油酸基，n＝4，a＝ch3ch2，a’＝ch3；

化合物17：r＝r’＝油酸基，n＝1，a＝ch3ch2，a’＝ch3ch2；

化合物18：r＝r’＝油酸基，n＝2，a＝ch3ch2，a’＝ch3ch2；

化合物19：r＝r’＝油酸基，n＝3，a＝ch3ch2，a’＝ch3ch2；

化合物20：r＝r’＝油酸基，n＝4，a＝ch3ch2，a’＝ch3ch2；

化合物21：r＝r’＝油酸基，n＝1，a＝ch3，a’＝ch3ch2；

化合物22：r＝r’＝油酸基，n＝2，a＝ch3，a’＝ch3ch2；

化合物23：r＝r’＝油酸基，n＝3，a＝ch3，a’＝ch3ch2；

化合物24：r＝r’＝油酸基，n＝4，a＝ch3，a’＝ch3ch2。

在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，所述通式ii的化合物選自下列化合物：

化合物1’：r＝r’＝亞油酸基，n＝1，a＝ch3，a’＝ch3ch2；

化合物2’：r＝r’＝亞油酸基，n＝2，a＝ch3，a’＝ch3ch2；

化合物3’：r＝r’＝亞油酸基，n＝3，a＝ch3，a’＝ch3ch2；

化合物4’：r＝r’＝亞油酸基，n＝4，a＝ch3，a’＝ch3ch2；

化合物5’：r＝r’＝油酸基，n＝1，a＝ch3，a’＝ch3；

化合物6’：r＝r’＝油酸基，n＝2，a＝ch3，a’＝ch3；

化合物7’：r＝r’＝油酸基，n＝3，a＝ch3，a’＝ch3；

化合物8’：r＝r’＝油酸基，n＝4，a＝ch3，a’＝ch3；

化合物9’：r＝r’＝亞油酸基，n＝1，a＝ch3ch2，a’＝ch3ch2；

化合物10’：r＝r’＝亞油酸基，n＝2，a＝ch3ch2，a’＝ch3ch2；

化合物11’：r＝r’＝亞油酸基，n＝3，a＝ch3ch2，a’＝ch3ch2；

化合物12’：r＝r’＝亞油酸基，n＝4，a＝ch3ch2，a’＝ch3ch2；

化合物13’：r＝r’＝亞油酸基，n＝1，a＝ch3ch2，a’＝ch3；

化合物14’：r＝r’＝亞油酸基，n＝2，a＝ch3ch2，a’＝ch3；

化合物15’：r＝r’＝亞油酸基，n＝3，a＝ch3ch2，a’＝ch3；

化合物16’：r＝r’＝亞油酸基，n＝4，a＝ch3ch2，a’＝ch3；

化合物13’：r＝r’＝油酸基，n＝1，a＝ch3ch2，a’＝ch3ch2；

化合物14’：r＝r’＝油酸基，n＝2，a＝ch3ch2，a’＝ch3ch2；

化合物15’：r＝r’＝油酸基，n＝3，a＝ch3ch2，a’＝ch3ch2；

化合物16’：r＝r’＝油酸基，n＝4，a＝ch3ch2，a’＝ch3ch2；

化合物17’：r＝r’＝油酸基，n＝1，a＝ch3，a’＝ch3ch2；

化合物18’：r＝r’＝油酸基，n＝2，a＝ch3，a’＝ch3ch2；

化合物19’：r＝r’＝油酸基，n＝3，a＝ch3，a’＝ch3ch2；

化合物20’：r＝r’＝油酸基，n＝4，a＝ch3，a’＝ch3ch2。

在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，所述通式iii的化合物選自下列化合物：

化合物1”：r＝r’＝亞油酸基，n＝1，a＝ch3，a’＝ch3ch2；

化合物2”：r＝r’＝亞油酸基，n＝2，a＝ch3，a’＝ch3ch2；

化合物3”：r＝r’＝亞油酸基，n＝3，a＝ch3，a’＝ch3ch2；

化合物4”：r＝r’＝亞油酸基，n＝4，a＝ch3，a’＝ch3ch2；

化合物5”：r＝r’＝油酸基，n＝1，a＝ch3，a’＝ch3；

化合物6”：r＝r’＝油酸基，n＝2，a＝ch3，a’＝ch3；

化合物7”：r＝r’＝油酸基，n＝3，a＝ch3，a’＝ch3；

化合物8”：r＝r’＝油酸基，n＝4，a＝ch3，a’＝ch3；

化合物9”：r＝r’＝亞油酸基，n＝1，a＝ch3ch2，a’＝ch3ch2；

化合物10”：r＝r’＝亞油酸基，n＝2，a＝ch3ch2，a’＝ch3ch2；

化合物11”：r＝r’＝亞油酸基，n＝3，a＝ch3ch2，a’＝ch3ch2；

化合物12”：r＝r’＝亞油酸基，n＝4，a＝ch3ch2，a’＝ch3ch2；

化合物13”：r＝r’＝亞油酸基，n＝1，a＝ch3ch2，a’＝ch3；

化合物14”：r＝r’＝亞油酸基，n＝2，a＝ch3ch2，a’＝ch3；

化合物15”：r＝r’＝亞油酸基，n＝3，a＝ch3ch2，a’＝ch3；

化合物16”：r＝r’＝亞油酸基，n＝4，a＝ch3ch2，a’＝ch3；

化合物17”：r＝r’＝油酸基，n＝1，a＝ch3ch2，a’＝ch3ch2；

化合物18”：r＝r’＝油酸基，n＝2，a＝ch3ch2，a’＝ch3ch2；

化合物19”：r＝r’＝油酸基，n＝3，a＝ch3ch2，a’＝ch3ch2；

化合物20”：r＝r’＝油酸基，n＝4，a＝ch3ch2，a’＝ch3ch2；

化合物21”：r＝r’＝油酸基，n＝1，a＝ch3，a’＝ch3ch2；

化合物22”：r＝r’＝油酸基，n＝2，a＝ch3，a’＝ch3ch2；

化合物23”：r＝r’＝油酸基，n＝3，a＝ch3，a’＝ch3ch2；

化合物24”：r＝r’＝油酸基，n＝4，a＝ch3，a’＝ch3ch2。

在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，所述通式iv的化合物選自下列化合物：

化合物1”’：r＝r’＝亞油酸基，n＝1，a＝ch3，a’＝ch3ch2；

化合物2”’：r＝r’＝亞油酸基，n＝2，a＝ch3，a’＝ch3ch2；

化合物3”’：r＝r’＝亞油酸基，n＝3，a＝ch3，a’＝ch3ch2；

化合物4”’：r＝r’＝亞油酸基，n＝4，a＝ch3，a’＝ch3ch2；

化合物5”’：r＝r’＝油酸基，n＝1，a＝ch3，a’＝ch3；

化合物6”’：r＝r’＝油酸基，n＝2，a＝ch3，a’＝ch3；

化合物7”’：r＝r’＝油酸基，n＝3，a＝ch3，a’＝ch3；

化合物8”’：r＝r’＝油酸基，n＝4，a＝ch3，a’＝ch3；

化合物9”’：r＝r’＝亞油酸基，n＝1，a＝ch3ch2，a’＝ch3ch2；

化合物10”’：r＝r’＝亞油酸基，n＝2，a＝ch3ch2，a’＝ch3ch2；

化合物11”’：r＝r’＝亞油酸基，n＝3，a＝ch3ch2，a’＝ch3ch2；

化合物12”’：r＝r’＝亞油酸基，n＝4，a＝ch3ch2，a’＝ch3ch2；

化合物13”’：r＝r’＝亞油酸基，n＝1，a＝ch3ch2，a’＝ch3；

化合物14”’：r＝r’＝亞油酸基，n＝2，a＝ch3ch2，a’＝ch3；

化合物15”’：r＝r’＝亞油酸基，n＝3，a＝ch3ch2，a’＝ch3；

化合物16”’：r＝r’＝亞油酸基，n＝4，a＝ch3ch2，a’＝ch3；

化合物17”’：r＝r’＝油酸基，n＝1，a＝ch3ch2，a’＝ch3ch2；

化合物18”’：r＝r’＝油酸基，n＝2，a＝ch3ch2，a’＝ch3ch2；

化合物19”’：r＝r’＝油酸基，n＝3，a＝ch3ch2，a’＝ch3ch2；

化合物20”’：r＝r’＝油酸基，n＝4，a＝ch3ch2，a’＝ch3ch2；

化合物21”’：r＝r’＝油酸基，n＝1，a＝ch3，a’＝ch3ch2；

化合物22”’：r＝r’＝油酸基，n＝2，a＝ch3，a’＝ch3ch2；

化合物23”’：r＝r’＝油酸基，n＝3，a＝ch3，a’＝ch3ch2；

化合物24”’：r＝r’＝油酸基，n＝3，a＝ch3，a’＝ch3ch2。

本發(fā)明的膽固醇類脂質(zhì)化合物選自下述通式v的化合物：

其中，y＝(c＝o)、(c＝s)、(-hn(o)c-)或化學(xué)鍵，a,a'為c1-c4烷基，n＝1-4。

在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，所述通式v的化合物選自下列化合物：

化合物v1：y＝(c＝o)，n＝1，a＝ch3，a’＝ch3ch2；

化合物v2：y＝(c＝o)，n＝2，a＝ch3，a’＝ch3ch2；

化合物v3：y＝(c＝o)，n＝3，a＝ch3ch2，a’＝ch3ch2；

化合物v4：y＝(c＝o)，n＝4，a＝ch3ch2，a’＝ch3ch2；

化合物v5：y＝(c＝o)，n＝1，a＝ch3ch2，a’＝ch3；

化合物v6：y＝(c＝o)，n＝2，a＝ch3，a’＝ch3；

化合物v7：y＝(c＝o)，n＝3，a＝ch3，a’＝ch3；

化合物v8：y＝(c＝o)，n＝4，a＝ch3，a’＝ch3；

化合物v9：y＝(c＝s)，n＝1，a＝ch3ch2，a’＝ch3ch2；

化合物v10：y＝(c＝s)，n＝2，a＝ch3ch2，a’＝ch3ch2；

化合物v11：y＝(c＝s)，n＝3，a＝ch3ch2，a’＝ch3ch2；

化合物v12：y＝(c＝s)，n＝4，a＝ch3ch2，a’＝ch3ch2；

化合物v13：y＝(c＝s)，n＝1，a＝ch3ch2，a’＝ch3；

化合物v14：y＝(c＝s)，n＝2，a＝ch3ch2，a’＝ch3；

化合物v15：y＝(c＝s)，n＝3，a＝ch3ch2，a’＝ch3；

化合物v16：y＝(c＝s)，n＝4，a＝ch3ch2，a’＝ch3；

化合物v17：y＝(-hnc＝o-)，n＝1，a＝ch3ch2，a’＝ch3ch2；

化合物v18：y＝(-hnc＝o-)，n＝2，a＝ch3ch2，a’＝ch3ch2；

化合物v19：y＝(-hnc＝o-)，n＝3，a＝ch3ch2，a’＝ch3ch2；

化合物v20：y＝(-hnc＝o-)，n＝4，a＝ch3ch2，a’＝ch3ch2；

化合物v21：y＝(-hnc＝o-)，n＝1，a＝ch3，a’＝ch3ch2；

化合物v22：y＝(-hnc＝o-)，n＝2，a＝ch3，a’＝ch3ch2；

化合物v23：y＝(-hnc＝o-)，n＝3，a＝ch3，a’＝ch3ch2；

化合物v24：y＝(-hnc＝o-)，n＝4，a＝ch3，a’＝ch3ch2。

另一方面，本發(fā)明提供一種核酸脂質(zhì)體制劑，其包含上述本發(fā)明的脂質(zhì)體以及包裹在所述脂質(zhì)體內(nèi)的核酸，其中，所述核酸選自：小干擾核酸、微小核酸、非編碼核酸、反義核酸、小配體核酸和小激活核酸。優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸脂質(zhì)體制劑還可包含藥學(xué)上可接受的賦形劑。在一種實施方式中，本發(fā)明的核酸脂質(zhì)體制劑可以是片劑、膠囊、乳液、滴劑、粉末、溶液、氣溶膠的形式。在另一實施方式中，本發(fā)明的核酸脂質(zhì)體制劑可以是口服劑型、靜脈內(nèi)注射劑型、肌肉內(nèi)注射劑型、皮下給藥劑型、腸胃外給藥劑型和腹膜內(nèi)給藥劑型。

又一方面，本發(fā)明提供制備上述核酸脂質(zhì)體制劑的方法，所述方法包括：

(1)提供陽性脂質(zhì)化合物、磷脂和長效脂質(zhì)的混合溶液；

(2)將步驟(1)的混合溶液與核酸溶液混合，得到所述核酸脂質(zhì)體制劑；

其中，所述混合溶液中陽性脂質(zhì)化合物的重量百分含量為50％至90％。

優(yōu)選地，在步驟(1)之后對所述混合溶液進(jìn)行擠出處理，得到脂質(zhì)體空囊泡，其中，將所述核酸溶液與所述脂質(zhì)體空囊泡混合，從而將所述核酸裝載至所述脂質(zhì)體空囊泡中，得到所述核酸脂質(zhì)體制劑。

再一方面，本發(fā)明提供一種治療與基因的異常表達(dá)有關(guān)的疾病的方法，其包括將本發(fā)明的核酸脂質(zhì)體制劑給藥于需要這種治療的患者。本發(fā)明的核 酸脂質(zhì)體制劑以口服給藥、靜脈內(nèi)給藥、肌肉內(nèi)給藥、皮下給藥、腸胃外給藥以及腹膜內(nèi)給藥的方式給藥于患者。在本發(fā)明的一些實施方式中，所述核酸脂質(zhì)體制劑中的核酸可被傳輸至細(xì)胞內(nèi)，例如，肝或發(fā)炎組織等一些靶組織的細(xì)胞內(nèi)。

本發(fā)明還涉及本發(fā)明的上述核酸脂質(zhì)體制劑在制備用于治療與基因的異常表達(dá)有關(guān)的疾病中的應(yīng)用。

本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑的優(yōu)勢在于：

1)核酸載藥量高，本發(fā)明提供的脂質(zhì)體由于其中陽性脂質(zhì)化合物的含量較高，能載入的帶負(fù)電荷的核酸就更多，大大提高了核酸載藥量。

2)用藥毒性低，本發(fā)明提供的脂質(zhì)體制劑的單位脂質(zhì)囊泡里能載入更多的核酸藥物，在用同等給藥劑量的條件下，由于載藥量的提高，陽性脂質(zhì)化合物量的攝入量相對減少，從而降低脂質(zhì)的用量，降低毒性。

附圖說明

圖1是根據(jù)本發(fā)明的一種實施方式將本發(fā)明的裝載了核酸藥物的脂質(zhì)體制劑給藥于小鼠前后的小鼠體重柱形圖，其中，橫坐標(biāo)表示各實驗組，縱坐標(biāo)表示小鼠體重。

圖2是將本發(fā)明的裝載了核酸藥物的脂質(zhì)體制劑給藥于小鼠后小鼠肝臟組織中apob基因的mrna相對表達(dá)水平柱形圖，其中，橫坐標(biāo)表示各實驗組，縱坐標(biāo)表示apob基因的mrna相對表達(dá)水平。

圖3是將本發(fā)明的裝載了核酸藥物的脂質(zhì)體制劑給藥于小鼠后小鼠血清中總膽固醇水平柱形圖，其中，橫坐標(biāo)表示各實驗組，縱坐標(biāo)表示小鼠血清總膽固醇水平。

圖4是根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式將本發(fā)明的裝載了核酸藥物的脂質(zhì)體制劑給藥于小鼠前后的小鼠體重柱形圖，其中，橫坐標(biāo)表示各實驗組，縱坐標(biāo)表示小鼠體重。

圖5是將本發(fā)明的裝載了核酸藥物的脂質(zhì)體制劑給藥于小鼠后小鼠肝臟組織中apob基因的mrna相對表達(dá)水平柱形圖，其中，橫坐標(biāo)表示各實驗組，縱坐標(biāo)表示apob基因的mrna相對表達(dá)水平。

圖6是將本發(fā)明的裝載了核酸藥物的脂質(zhì)體制劑給藥于小鼠后小鼠血清中總膽固醇水平柱形圖，其中，橫坐標(biāo)表示各實驗組，縱坐標(biāo)表示小鼠血清總膽固醇水平。

圖7是根據(jù)本發(fā)明的再一實施方式將本發(fā)明的裝載了核酸藥物的脂質(zhì)體制劑給藥于小鼠前后的小鼠體重柱形圖，其中，橫坐標(biāo)表示各實驗組，縱坐標(biāo)表示小鼠體重。

圖8是將本發(fā)明的裝載了核酸藥物的脂質(zhì)體制劑給藥于小鼠后小鼠肝臟組織中apob基因的mrna相對表達(dá)水平柱形圖，其中，橫坐標(biāo)表示各實驗組，縱坐標(biāo)表示apob基因的mrna相對表達(dá)水平。

圖9是將本發(fā)明的裝載了核酸藥物的脂質(zhì)體制劑給藥于小鼠后小鼠血清中總膽固醇水平柱形圖，其中，橫坐標(biāo)表示各實驗組，縱坐標(biāo)表示小鼠血清總膽固醇水平。

圖10是根據(jù)本發(fā)明的再一實施方式將本發(fā)明的裝載了核酸藥物的脂質(zhì)體制劑給藥于小鼠前后的小鼠體重柱形圖，其中，橫坐標(biāo)表示各實驗組，縱坐標(biāo)表示小鼠體重。

圖11是將本發(fā)明的裝載了核酸藥物的脂質(zhì)體制劑給藥于小鼠后小鼠肝臟組織中apob基因的mrna相對表達(dá)水平柱形圖，其中，橫坐標(biāo)表示各實驗組，縱坐標(biāo)表示apob基因的mrna相對表達(dá)水平。

圖12是將本發(fā)明的裝載了核酸藥物的脂質(zhì)體制劑給藥于小鼠后小鼠血清中總膽固醇水平柱形圖，其中，橫坐標(biāo)表示各實驗組，縱坐標(biāo)表示小鼠血清總膽固醇水平。

圖13是根據(jù)本發(fā)明的再一實施方式將本發(fā)明的裝載了核酸藥物的脂質(zhì)體制劑給藥于小鼠前后的小鼠體重柱形圖，其中，橫坐標(biāo)表示各實驗組，縱坐標(biāo)表示小鼠體重。

圖14是將本發(fā)明的裝載了核酸藥物的脂質(zhì)體制劑給藥于小鼠后小鼠肝臟組織中apob基因的mrna相對表達(dá)水平柱形圖，其中，橫坐標(biāo)表示各實驗組，縱坐標(biāo)表示apob基因的mrna相對表達(dá)水平。

圖15是將本發(fā)明的裝載了核酸藥物的脂質(zhì)體制劑給藥于小鼠后小鼠血清中總膽固醇水平柱形圖，其中，橫坐標(biāo)表示各實驗組，縱坐標(biāo)表示小鼠血清 總膽固醇水平。

圖16是根據(jù)本發(fā)明的再一實施方式將本發(fā)明的裝載了核酸藥物的脂質(zhì)體制劑給藥于小鼠前后的小鼠體重柱形圖，其中，橫坐標(biāo)表示各實驗組，縱坐標(biāo)表示小鼠體重。

圖17是將本發(fā)明的裝載了核酸藥物的脂質(zhì)體制劑給藥于小鼠后小鼠肝臟組織中apob基因的mrna相對表達(dá)水平柱形圖，其中，橫坐標(biāo)表示各實驗組，縱坐標(biāo)表示apob基因的mrna相對表達(dá)水平。

圖18是將本發(fā)明的裝載了核酸藥物的脂質(zhì)體制劑給藥于小鼠后小鼠血清中總膽固醇水平柱形圖，其中，橫坐標(biāo)表示各實驗組，縱坐標(biāo)表示小鼠血清總膽固醇水平。

具體實施方式

為了更加清楚地描述本發(fā)明的目的、特征以及優(yōu)勢，以下將結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，但下文詳細(xì)描述的本發(fā)明的實施方式，僅僅是為了對本發(fā)明的內(nèi)容進(jìn)行舉例說明，并不對本發(fā)明構(gòu)成任何限定。本發(fā)明的保護(hù)范圍僅由權(quán)利要求書限定。

實施例l

本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑中使用的脂類脂質(zhì)化合物和膽固醇類脂質(zhì)化合物根據(jù)有機化學(xué)、合成化學(xué)以及生物化學(xué)等現(xiàn)有技術(shù)相關(guān)文獻(xiàn)、專利申請和專利文件或改良技術(shù)制備，例如，r＝r’＝亞油酸基，n＝1，a＝a’＝ch3的通式i的脂類脂質(zhì)化合物(cl52)根據(jù)heyesj等人(jcontrolrelease2005；107:276-287)或heyesj等人(jcontrolrelease2005；107:276-287)文中的方法制備；r＝r’＝油酸基，n＝1，a＝a’＝ch3的通式i的脂類脂質(zhì)化合物(cl53)根據(jù)heyesj等人(jcontrolrelease2005；107:276-287)或heyesj等人(jcontrolrelease2005；107:276-287)文中的方法制備；r＝r’＝亞油酸基，n＝2，a＝a’＝ch3的通式ii的脂類脂質(zhì)化合物(cl54)根據(jù)jchen等人的pct申請(wo/2009/086558、wo/2010/042877)或semplesc等人(naturebiotech,2010； 28:172-176)文中的方法制備；r＝r’＝亞油酸基，n＝3，a＝a’＝ch3的通式iii的脂類脂質(zhì)化合物(cl51)根據(jù)jayaramanm等人(angewchemintedengl.2012；51:8529-33)文中的方法制備；r＝r’＝亞油酸基，n＝1，a＝a’＝ch3的通式iv的脂類脂質(zhì)化合物(cl55)根據(jù)leventisr等人(biochimbiophysacta1990；1023:124-132)文中的方法制備；r＝r’＝油酸基，n＝1，a＝a’＝ch3的通式iv的脂類脂質(zhì)化合物(cl56)根據(jù)leventisr等人(biochimbiophysacta1990；1023:124-132)文中的方法制備；peg-c-dma根據(jù)jchen等人的pct申請(wo/2009/086558、wo/2010/042877)或semplesc等人(naturebiotech,2010；28:172-176)文中的方法制備。

y＝(c＝o)，a＝a’＝ch3，n＝2的通式v的膽固醇類脂質(zhì)化合物(cl66)合成方法如下：

100ml燒瓶中加入反應(yīng)產(chǎn)物膽固醇(1.1g，2.84mmol)溶解在dcm(20ml)中，加入原料11(4-(二甲基氨基)丙酸鹽酸鹽)(0.7g，4.55mmol)，然后加入二異丙基乙基胺(1ml)及dmap(0.056g，0.56mmol)。室溫攪拌5min后，溶液中加入edc·hcl(1.1g，5.6mmol)，室溫攪拌過夜。tlc(5％meoh/dcm)檢測反應(yīng)進(jìn)行程度。反應(yīng)完全后，溶液用20mldcm稀釋。然后用16ml飽和nahco3、16ml水及16ml飽和食鹽水洗，無水na2so4干燥，過濾，濃縮有機相，得到粗產(chǎn)品約1.1g。使用flash柱純化(90g硅膠，用210ml含0.1％tea的dcm上柱；流動相分別為：140ml0.1％tea的dcm；560ml2％甲醇+98％含0.1％tea的dcm；140ml2.5％甲醇+97.5％含0.1％tea的dcm；420ml3％甲醇+97％含0.1％tea的dcm)分離得到純的產(chǎn)品cl66。

y＝(c＝o)，a＝a’＝ch3，n＝1的通式v的膽固醇類脂質(zhì)化合物(cl68)合成方法如下：

100ml燒瓶中加入反應(yīng)產(chǎn)物膽固醇(1.1g，2.84mmol)溶解在dcm(20ml)中，加入原料13(4-(二甲基氨基)丙酸鹽酸鹽)(0.7g，5.0mmol)，然后加入二異丙基乙基胺(1ml)及dmap(0.056g，0.56mmol)。室溫攪拌5min后，溶液中加入edc·hcl(1.1g，5.6mmol)，室溫攪拌過夜。tlc(5％meoh/dcm)檢測反應(yīng)進(jìn)行程度。反應(yīng)完全后，溶液用20mldcm稀 釋。然后用16ml飽和nahco3、16ml水及16ml飽和食鹽水洗，無水na2so4干燥，過濾，濃縮有機相，得到粗產(chǎn)品約1.1g。使用flash柱純化(90g硅膠，用210ml含0.1％tea的dcm上柱；流動相分別為：140ml0.1％tea的dcm；560ml2％甲醇+98％含0.1％tea的dcm；140ml2.5％甲醇+97.5％含0.1％tea的dcm；420ml3％甲醇+97％含0.1％tea的dcm)分離得到純的產(chǎn)品cl68。

實施例2

脂質(zhì)體制劑的制備

1主要試劑、材料及儀器

1.1主要試劑：

脂類脂質(zhì)化合物是r＝r’＝亞油酸基，n＝3的通式iii的化合物(cl51)；

膽固醇類脂質(zhì)化合物是實施例1中制備的cl66和cl68；

磷脂為二硬脂酰磷脂酰膽堿(dspc)，購自上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司；

長效脂質(zhì)為實施例1制備的peg-c-dma；

熒光染料6-對甲苯氨基-2-萘磺酸鉀(tns)購自sigma-aldrich公司；

其他生化試劑：無水乙醇，甲醇，氯仿，檸檬酸，檸檬酸鈉，nacl等均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純試劑。

本發(fā)明的實施例中使用的示例性的核酸藥物是apob-sirna，由百奧邁科生物技術(shù)有限公司合成，凍干粉狀態(tài)，其序列為：

apb-s：5’-gucaucacacugaauaccaau-3’；

apb-as：5’-auugguauucagugugaugacac-3’。

1.2主要材料：離子交換柱：vivapuredminih(美國sartoriusstedim 公司)，ultracel-100離心超濾管(美國millipore公司)，透析膜：nucleporemembranecircles(80nm)(美國whatman公司)，透析袋和針頭式過濾器購自生工生物有限公司，透析袋md24(mw：20000，上海寶曼生物)，針頭式過濾器(上海生工)，50mlfalcon管(美國corning公司)。

1.3主要儀器：漩渦振蕩器(美國vwr公司)，恒溫水浴鍋(江蘇天宏儀器)，離心機(美國eppendorf公司)，紫外-可見分光光度計(上海精科)，磁力攪拌器(上海梅穎浦儀器)，nli脂質(zhì)體擠出器(加拿大ats公司)，超凈工作臺(蘇州凈化)，高速冷凍離心機(賽特湘儀)，熒光分光光度計(rf-5301pc，日本島津公司)等。

2脂質(zhì)體制劑的制備

2.1試劑準(zhǔn)備：

2.1.1制備脂質(zhì)儲液：

將脂類脂質(zhì)化合物cl51、膽固醇類脂質(zhì)化合物cl66和cl68、磷脂dspc、長效脂質(zhì)peg-c-dma在稱量前在室溫平衡約30min；

將脂類脂質(zhì)化合物cl51用100％乙醇配制成40mg/ml的儲液，膽固醇類脂質(zhì)化合物cl66和cl68分別用100％乙醇配制成20mg/ml的儲液，將dspc用100％乙醇配制成20mg/ml的儲液。長效脂質(zhì)peg-c-dma用100％乙醇配制成50mg/ml的儲液。

2.2制備脂質(zhì)體制劑：

按照下表1所列的脂類脂質(zhì)化合物cl51和膽固醇類脂質(zhì)化合物cl68的比例(其中長效脂質(zhì)為peg-c-dma，含量為10％，其余用磷脂dspc補足至100％，以下實施例中長效脂質(zhì)和磷脂的含量均按此添加)制備脂質(zhì)體制劑f601-f520，具體而言，用無水乙醇作為溶劑，按照表1所列的比例將脂類脂質(zhì)化合物cl51、膽固醇類脂質(zhì)化合物cl68、長效脂質(zhì)peg-c-dma以及磷脂dspc配制成脂質(zhì)乙醇溶液。待所有脂質(zhì)溶解后，一邊攪拌一邊將上述脂質(zhì)乙 醇溶液加入到制劑緩沖液(50mm檸檬酸，ph4.0)中，使乙醇的終濃度為30％(v/v)。室溫下，在200psi壓力條件下用裝有兩層nucleporemembranecircles的nli脂質(zhì)體擠出器擠出，即得到粒徑均一的脂質(zhì)體空囊泡。經(jīng)過擠出器的脂質(zhì)體空囊泡用粒徑分析儀測量其粒徑。

表1.

2.3制備裝載了sirna的脂質(zhì)體制劑：

2.3.1sirna儲液制備：

溶解sirna：用10mm檸檬酸/30mmnacl,ph6.0的溶液配制理論終濃度為50mg/ml的apob-sirna儲液；取適量的apob-sirna儲液，用pbs稀釋2000倍，用于檢測sirna濃度。每個樣品做三個平行樣。紫外分光光度計檢測a260值，并計算得apob-sirna儲液的實際濃度。

將所需體積的脂質(zhì)體空囊泡裝入50mlfalcon管中，在35℃水浴中預(yù)平衡4～5min。將apob-sirna儲液配制成sirna/制劑緩沖 液/乙醇溶液，保證乙醇占總體積的30％。然后將sirna/制劑緩沖液/乙醇溶液緩慢加入到上述脂質(zhì)體空囊泡中，35℃孵育30min。孵育完成后取600μl孵育產(chǎn)物用于a260分析。用透析袋md24透析上述sirna脂質(zhì)體制劑，1×pbs透析過夜，回收透析后產(chǎn)物，用0.2μm針頭式過濾器過濾透析后產(chǎn)物進(jìn)行過濾除菌，取600μl除菌后產(chǎn)物用于包封率檢測。

2.4包封率測定：

取300μl除菌后產(chǎn)物過vivapuredminih(離子交換柱)，即為層析后樣品，剩余的300μl為層析前樣品。根據(jù)實際測得的a260值計算實際濃度系數(shù)(mg/ml)＝加入的apob-sirna儲液體積(ml)×apob-sirna儲液的實際濃度(mg/ml)×0.03(ml)×1000/(sirna脂質(zhì)體制劑總體積(ml)×孵育產(chǎn)物a260值×1.1(ml)。根據(jù)sirna濃度，計算包封率，包封率的定義為：包封率＝(脂質(zhì)體中包封的藥物/脂質(zhì)體制劑中的藥物總量)×100％。計算公式為：包封率＝層析后樣品sirna濃度/層析前樣品sirna濃度。

2.5載藥率＝(脂質(zhì)體中包封的藥物量/脂質(zhì)體+脂質(zhì)體制劑中的藥物總量)×100％。

2.6脂質(zhì)體空囊泡的pka檢測：

利用熒光染料tns在水溶液中不發(fā)光或只有微弱的熒光，而在有機環(huán)境中，其有很強的熒光的特性來測定脂質(zhì)體空囊泡的pka值。若在陽離子脂質(zhì)體溶液中加入tns，由于tns帶負(fù)電，會富集于脂質(zhì)體的表面而發(fā)出熒光，而游離的tns在水溶液中不發(fā)光，故溶液的熒光強度(在一定濃度內(nèi))與脂質(zhì)體表面正電荷的數(shù)量成正比。這樣，通過檢測熒光強度，就可得到陽離子脂質(zhì)體中氨基的電離程度。而根據(jù)解離常數(shù)的定義，可知當(dāng)弱酸在溶液中的電離程度為50％時，溶液的ph值即為該酸的pka值。由上可知，若通過熒光光強對ph值作圖，所得 熒光光強中點的ph值，即為該陽離子溶液的表觀pka值。

具體測定方法為：1)在樣品瓶中加入不同ph值的pbs溶液(ph值分別為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0，用hcl及naoh調(diào)節(jié)ph值)各2ml。2)在每個樣品瓶中各依次加入80μl的250mm4-嗎啉乙磺酸溶液、80μl的250mm的hepes溶液、80μl的250mm的乙酸氨溶液、80μl的3.85m的氯化鈉溶液及60μl的pfv。3)在ph值為2.5的樣品瓶中加入40ml的83.5μmtns溶液，攪拌30s后，將溶液取出，用熒光分光光度計測量其發(fā)射光強度(激發(fā)波長為321nm，發(fā)射波長為445nm)4)按照上述方法，測量不同ph值下tns的發(fā)射光強度，并以ph值為x軸，發(fā)射光強為y軸作圖，其中發(fā)射光強中點處ph值即為pfv的表觀pka值，計算得到pka值。

2.7粒徑分析：

用nicomp370粒徑分析儀檢測脂質(zhì)體空囊泡及sirna脂質(zhì)體制劑的粒徑。

表2列出了以上制備的脂質(zhì)體空囊泡的粒徑、pka值、其對sirna的包封率和載藥率。

表2.

從上表面2的sirna包封率和載藥率測試結(jié)果可以看出，隨著脂質(zhì)體制劑中陽性脂質(zhì)化合物的含量的增加，sirna包封率和載藥率也隨之增大，這表明由于陽性脂質(zhì)化合物的含量增加，能載入的帶負(fù)電荷的核酸就增多，因此，采用本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑可以大大提高核酸載藥量。由此，本發(fā)明提供的脂質(zhì)體制劑的單位脂質(zhì)囊泡里能載入更多的核酸藥物，在用同等給藥劑量的條件下，由于載藥量的提高，陽性脂質(zhì)化合物量的攝入量相對減少，從而降低脂質(zhì)的用量，降低毒性。

實施例3

驗證脂質(zhì)體制劑的有效性

1主要試劑、材料及儀器

1.1主要試劑、材料：脂質(zhì)體制劑(上述實施例2制備)，氯化鈉注射液(山東康寧藥業(yè)有限公司)，riso^tmrna提取試劑(百奧邁科生物技術(shù)有限公司))，onestepqpcrkit(百奧邁科生物技術(shù)有限公司)，1ml無菌注射器(河南曙光健士醫(yī)療器械集團有限公司)，總膽固醇(cho酶法)測試盒(南京建成生物)。

1.2實驗動物：4-6周齡icr小鼠，雌性，18-22g，購自南通大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。

1.3主要儀器：lightcycler480實時熒光定量pcr儀(美國roche公司)，紫外-可見分光光度計uv759s(上海精科)。

2實驗方法

2.1實驗分組：給藥前稱量小鼠體重，按體重進(jìn)行分組，共分3組，分 別為sirna脂質(zhì)體制劑處理組(表1)，生理鹽水組，注射量如下：

sirna脂質(zhì)體制劑處理組：注射量按脂質(zhì)體制劑中sirna的量為3mg/kg計算；

生理鹽水組：注射300μl氯化鈉注射液。

2.2給藥：用小鼠固定器固定小鼠，用1ml無菌注射器按脂質(zhì)體制劑中sirna量為3mg/kg通過小鼠尾靜脈進(jìn)行注射給藥，對照組注射300μl氯化鈉注射液。

2.3小鼠血清總膽固醇含量檢測

給藥后48h稱量小鼠體重，通過摘取眼球采集小鼠血液，約800μl，4℃放置1h，3000rpm離心10min分離出血清，待檢測。取10μl分離的小鼠血清按總膽固醇(cho酶法)測試盒說明書進(jìn)行血清總膽固醇檢測，測定500nm吸光度值。

膽固醇含量計算方法為：膽固醇含量＝(測定樣品a500值/標(biāo)準(zhǔn)品a500值)×標(biāo)準(zhǔn)液濃度(標(biāo)準(zhǔn)液濃度：200mg/dl(5.17mm))。

2.4實時定量pcr(realtimequantitypcr，rt-qpcr)檢測小鼠肝臟中apob基因的mrna表達(dá)水平

注射脂質(zhì)體制劑后48h，處死小鼠，解剖小鼠從肝臟的不同部位取3塊組織，用riso^tmrna提取試劑，按照說明書提取小鼠肝臟組織的總rna，用rt-qpcr檢測小鼠肝臟apob基因的mrna表達(dá)水平。

用基因特異性引物檢測樣本中apob基因mrna的表達(dá)水平，同時擴增看家基因gapdh作為內(nèi)參對照。每個樣本同時擴增apob基因和內(nèi)參基因gapdh，每個反應(yīng)做3個平行。用onestepqpcrkit進(jìn)行定量反應(yīng)，建立如下反應(yīng)體系：2μlrna模板，12.5μl的2×mastermix，5’端引物(10μm)和3’端引物(10μm)各0.5μl，0.5μl的50×sybrgreenisolution，用無rnase的水補足體系至25μl?；旌暇鶆蚝螅糜趯崟r定量pcr儀上反應(yīng)。

檢測apob基因mrna的5’端引物為：aagcacctccgaaagtacgtg， 3’端引物為：ctccagctctaccttacagttga。檢測看家基因gapdh的5’端引物為：gtatgactccactcacggcaaa，3’端引物為：ggtctcgctcctggaagatg。所需引物均由百奧邁科生物技術(shù)有限公司合成。

反應(yīng)條件：42℃反轉(zhuǎn)錄30min，95℃預(yù)變性5min，95℃變性20sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，循環(huán)45次。并做溶解曲線反應(yīng)：95℃/5min，58℃/5min，以0.5℃/5sec升溫至95℃。

2.5統(tǒng)計處理

用spss14.0統(tǒng)計軟件分析，計量數(shù)據(jù)用表示，多組間差異顯著性檢驗用單因素方差分析，兩組間比較用t檢驗，p<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3實驗結(jié)果

3.1小鼠體重變化，分別檢測注射脂質(zhì)體制劑前后小鼠體重的變化，可以間接反應(yīng)毒性，如圖1所示，各組在給藥前后小鼠體重?zé)o明顯變化，表明本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑無明顯毒性。

3.2apob基因的mrna水平變化，如圖2所示，本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑有效抑制了肝臟apobmrna的表達(dá)。

3.3總膽固醇含量變化，如圖3所示，與對照組相比，本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑均同時降低了小鼠血清中的總膽固醇水平。

綜合實驗結(jié)果可以看出，本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑能夠?qū)⒑怂崴幬?，如sirna傳輸至靶組織或器官，并能有效發(fā)揮核酸藥物的功能。

實施例4

1裝載有sirna的脂質(zhì)體制劑制備

1.1陽性脂質(zhì)化合物由脂類脂質(zhì)化合物cl52和膽固醇類脂質(zhì)化合物cl68構(gòu)成。磷脂為dspc，購自上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司；長效脂質(zhì)為 peg-c-dma。

1.2按實施例2中的步驟制備裝載有sirna的脂質(zhì)體制劑并檢測各項指標(biāo)，各脂質(zhì)化合物的比例在表3中列出，表4列出了制備的脂質(zhì)體制劑的粒徑和pka值以及裝載了sirna的脂質(zhì)體制劑包封率和載藥率。

表3

表4

從上表4可以看出，隨著脂質(zhì)體制劑中陽性脂質(zhì)化合物的含量的增加，sirna包封率和載藥率也隨之增大，這表明由于陽性脂質(zhì)化合物的含量增加，能載入的帶負(fù)電荷的核酸就增多，因此，采用本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑可以大大提高核酸載藥量。由此，本發(fā)明提供的脂質(zhì)體制劑的單位脂質(zhì)囊泡里能載入更多的核酸藥物，在用同等給藥劑量的條件下，由于載藥量的提高，陽性脂質(zhì)化合物量的攝入量相對減少，從而降低脂質(zhì)的用量，降低毒性。

2驗證裝載有sirna的脂質(zhì)體制劑的有效性

按實施例3的方法檢測本實施例制備的裝載有sirna的脂質(zhì)體制劑的有效性。

3實驗結(jié)果

3.1小鼠體重變化，如圖4所示，各組在給藥前后小鼠體重?zé)o明顯變化，表明脂質(zhì)體制劑無明顯毒性。

3.2apob基因的mrna水平變化，如圖5所示，脂質(zhì)體制劑有效抑制了肝臟apobmrna的表達(dá)。

3.3總膽固醇含量變化，如圖6所示，與對照組相比，脂質(zhì)體制劑均同時降低了小鼠血清中的總膽固醇水平。

綜上實驗結(jié)果，脂質(zhì)體制劑能夠?qū)⒑怂崴幬?，如sirna傳輸至靶組織或器官，并能有效發(fā)揮核酸藥物的功能。

實施例5

1裝載有sirna的脂質(zhì)體制劑的制備：

1.1陽性脂質(zhì)化合物由脂類脂質(zhì)化合物cl53和膽固醇類脂質(zhì)化合物cl68構(gòu)成。磷脂為dspc，購自上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司；長效脂質(zhì)為peg-c-dma。

1.2按實施例2的步驟，制備裝載有sirna的脂質(zhì)體制劑，各脂質(zhì)化合物在表5中列出，在表6列出制備脂質(zhì)體制劑的粒徑和pka值以及裝載有sirna的脂質(zhì)體制劑的包封率和載藥率。

表5

表6

從上表6可以看出，隨著脂質(zhì)體制劑中陽性脂質(zhì)化合物的含量的增加，sirna包封率和載藥率也隨之增大，這表明由于陽性脂質(zhì)化合物的含量增加，能載入的帶負(fù)電荷的核酸就增多，因此，采用本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑可以大大提高核酸載藥量。由此，本發(fā)明提供的脂質(zhì)體制劑的單位脂質(zhì)囊泡里能載入更多的核酸藥物，在用同等給藥劑量的條件下，由于載藥量的提高，陽性脂質(zhì)化合物量的攝入量相對減少，從而降低脂質(zhì)的用量，降低毒性。

2驗證脂質(zhì)體制劑的有效性

按實施例3的方法檢測本實施例制備的裝載有sirna的脂質(zhì)體制劑的有效性。

3實驗結(jié)果

3.1小鼠體重變化，如圖7所示，各組在給藥前后小鼠體重?zé)o明顯變化，表明脂質(zhì)體制劑無明顯毒性。

3.2apob基因的mrna水平變化，如圖8所示，脂質(zhì)體制劑有效抑制了肝臟apobmrna的表達(dá)。

3.3總膽固醇含量變化，如圖9所示，與對照組相比，脂質(zhì)體制劑均同時降低了小鼠血清中的總膽固醇水平。

綜上實驗結(jié)果，脂質(zhì)體制劑能夠?qū)⒑怂崴幬?，如sirna傳輸至靶組織或器官，并能有效發(fā)揮核酸藥物的功能。

實施例6

1裝載有sirna的脂質(zhì)體制劑的制備

1.1陽性脂質(zhì)化合物由脂類脂質(zhì)化合物cl54和膽固醇類脂質(zhì)化合物cl68構(gòu)成。磷脂為dspc，購自上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司；長效脂質(zhì)為 peg-c-dma。

1.2按實施例2制備裝載有sirna的脂質(zhì)體制劑，各脂質(zhì)化合物的比例在表7中列出，在表8中列出了本實施例制備的脂質(zhì)體制劑的粒徑和pka值以及裝載sirna的脂質(zhì)體制劑的包封率和載藥率。

表7

表8

從上表8可以看出，隨著脂質(zhì)體制劑中陽性脂質(zhì)化合物的含量的增加，sirna包封率和載藥率也隨之增大，這表明由于陽性脂質(zhì)化合物的含量增加，能載入的帶負(fù)電荷的核酸就增多，因此，采用本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑可以大大提高核酸載藥量。由此，本發(fā)明提供的脂質(zhì)體制劑的單位脂質(zhì)囊泡里能載入更多的核酸藥物，在用同等給藥劑量的條件下，由于載藥量的提高，陽性脂質(zhì)化合物量的攝入量相對減少，從而降低脂質(zhì)的用量，降低毒性。

2驗證脂質(zhì)體制劑的有效性

按實施例3的方法檢測本實施例制備的裝載有sirna的脂質(zhì)體制劑的有效性。

3實驗結(jié)果

3.1小鼠體重變化，如圖10所示，各組在給藥前后小鼠體重?zé)o明顯變化， 表明本實施例制備的裝載有sirna的脂質(zhì)體制劑無明顯毒性。

3.2apob基因的mrna水平變化，如圖11所示，本實施例制備的裝載有sirna的脂質(zhì)體制劑有效抑制了肝臟apobmrna的表達(dá)。

3.3總膽固醇含量變化，如圖12所示，與對照組相比，本實施例制備的裝載有sirna的脂質(zhì)體制劑均同時降低了小鼠血清中的總膽固醇水平。

綜上實驗結(jié)果，本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑能夠?qū)⒑怂崴幬?，如sirna傳輸至靶組織或器官，并能有效發(fā)揮核酸藥物的功能。

實施例7

1裝載有sirna的脂質(zhì)體制劑制備

1.1陽性脂質(zhì)化合物由脂類脂質(zhì)化合物cl55和膽固醇類脂質(zhì)化合物cl68構(gòu)成。磷脂為dspc，購自上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司；長效脂質(zhì)為peg-c-dma。

1.2按實施例2的步驟制備裝載有sirna的脂質(zhì)體制劑，各脂質(zhì)化合物的比例在表9中列出，在表10中列出了本實施例制備的脂質(zhì)體制劑的粒徑和pka值以及裝載sirna的脂質(zhì)體制劑的包封率和載藥率。

表9

表10

從上表10可以看出，隨著脂質(zhì)體制劑中陽性脂質(zhì)化合物的含量的增加，sirna包封率和載藥率也隨之增大，這表明由于陽性脂質(zhì)化合物的含量增加，能載入的帶負(fù)電荷的核酸就增多，因此，采用本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑可以大大提高核酸載藥量。由此，本發(fā)明提供的脂質(zhì)體制劑的單位脂質(zhì)囊泡里能載入更多的核酸藥物，在用同等給藥劑量的條件下，由于載藥量的提高，陽性脂質(zhì)化合物量的攝入量相對減少，從而降低脂質(zhì)的用量，降低毒性。

2驗證脂質(zhì)體制劑的有效性

按實施例3的方法檢測本實施例制備的裝載有sirna的脂質(zhì)體制劑的有效性。

3實驗結(jié)果

3.1小鼠體重變化，如圖13所示，各組在給藥前后小鼠體重?zé)o明顯變化，表明本實施例制備的裝載有sirna的脂質(zhì)體制劑無明顯毒性。

3.2apob基因的mrna水平變化，如圖14所示，本實施例制備的裝載有sirna的脂質(zhì)體制劑有效抑制了肝臟apobmrna的表達(dá)。

3.3總膽固醇含量變化，如圖15所示，與對照組相比，本實施例制備的裝載有sirna的脂質(zhì)體制劑均同時降低了小鼠血清中的總膽固醇水平。

綜上實驗結(jié)果，本實施例制備的脂質(zhì)體制劑能夠?qū)⒑怂崴幬?，如sirna傳輸至靶組織或器官，并能有效發(fā)揮核酸藥物的功能。

實施例8

1裝載有sirna的脂質(zhì)體制劑的制備

1.1陽性脂質(zhì)化合物由脂類脂質(zhì)化合物cl56和膽固醇類脂質(zhì)化合物 cl68構(gòu)成。磷脂為dspc，購自上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司；長效脂質(zhì)為peg-c-dma。

1.2按實施例2的方法制備裝載有sirna的脂質(zhì)體制劑，各脂質(zhì)化合物的比例在表11中列出，在表12中列出了本實施例制備的脂質(zhì)體制劑的粒徑和pka值以及裝載sirna的脂質(zhì)體制劑的包封率和載藥率。

表11

表12

從上表12可以看出，隨著脂質(zhì)體制劑中陽性脂質(zhì)化合物的含量的增加，sirna包封率和載藥率也隨之增大，這表明由于陽性脂質(zhì)化合物的含量增加，能載入的帶負(fù)電荷的核酸就增多，因此，采用本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑可以大大提高核酸載藥量。由此，本發(fā)明提供的脂質(zhì)體制劑的單位脂質(zhì)囊泡里能載入更多的核酸藥物，在用同等給藥劑量的條件下，由于載藥量的提高，陽性脂質(zhì)化合物量的攝入量相對減少，從而降低脂質(zhì)的用量，降低毒性。

2驗證脂質(zhì)體制劑的有效性

按實施例3的方法檢測本實施例制備的裝載有sirna的脂質(zhì)體制劑的有效性。

3實驗結(jié)果

3.1小鼠體重變化，如圖16所示，各組在給藥前后小鼠體重?zé)o明顯變化，表明本實施例制備的裝載有sirna的脂質(zhì)體制劑無明顯毒性。

3.2apob基因的mrna水平變化，如圖17所示，本實施例制備的裝載有sirna的脂質(zhì)體制劑有效抑制了肝臟apobmrna的表達(dá)。

3.3總膽固醇含量變化，如圖18所示，與對照組相比，本實施例制備的裝載有sirna的脂質(zhì)體制劑均同時降低了小鼠血清中的總膽固醇水平。

綜上實驗結(jié)果，本實施例制備的脂質(zhì)體制劑能夠?qū)⒑怂崴幬?，如sirna傳輸至靶組織或器官，并能有效發(fā)揮核酸藥物的功能。